Medição e Modelagem contrátil que secam no Estrato Córneo Humano
1 de março de 2017
Este artigo descreve um método para quantificar o comportamento dinâmico de secagem e propriedades mecânicas do estrato córneo através da medição espacialmente resolvida no plano deslocamentos de secagem de amostras circulares de tecido aderidas a um substrato de elastómero. Esta técnica pode ser utilizada para medir a forma como os diferentes tratamentos químicos Após a secagem dos tecidos e propriedades mecânicas.
O objetivo geral deste método é quantificar a rigidez mecânica dinâmica e o acúmulo de tensões durante a secagem em amostras ex vivo do estrato córneo humano, após diferentes tratamentos químicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biomecânica e ciência cosmética, como a forma pela qual a composição do estrato córneo ou o tratamento do tecido cutâneo com produtos de cuidados pessoais pode influenciar suas propriedades mecânicas e comportamento dinâmico de secagem. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece uma alternativa mais rápida em comparação com outros métodos de avaliação mecânica, exige significativamente menos tecido cutâneo e proporciona uma secagem fisiologicamente mais relevante, impedindo a evaporação pela face inferior da amostra.
Para preparar lamínulas revestidas com elastômero, primeiro prepare o agente de cura Sylgard 184 com os sólidos da base numa proporção de base para agente de cura de 55 para um, até que fique homogêneo. São necessários seis gramas no total. Em seguida, desgaseifique a solução.
Em seguida, utilize a solução para revestir as lamínulas em um espalhador por centrifugação. Usando uma pipeta de grande orifício, adicione um mililitro da mistura centralmente sobre uma lamínula. Em seguida, realize o revestimento por centrifugação da lamínula a 2.000 rpm por 60 segundos.
Prepare cinco ou seis lamínulas revestidas dessa maneira. Para curar as lamínulas, mantenha-as em uma estufa a 60 graus Celsius por 12 horas. No dia seguinte, meça as espessuras dos filmes de elastômero.
Use uma lâmina de barbear para levantar uma borda da película de elastômero do lamínula. Em seguida, use uma caneta indelével para marcar o lado superior da película de elastômero e para marcar o lamínula tratado abaixo. Agora, utilizando um microscópio invertido, meça a altura Z entre os planos focais das marcas para determinar as espessuras da película.
Siga procedimentos padrão para preparar o tecido da camada córnea (SC). Para preparar as amostras, retire punções de seis milímetros de diâmetro da SC. Nas amostras, faça uma marca no centro da face mais externa utilizando uma caneta indelével. Em seguida, deposite microesferas marcadoras fluorescentes sobre a superfície da camada córnea flutuando as amostras em 15 mililitros de água, contendo cerca de 90 microlitros do concentrado de microesferas.
Utilize agitação suave por 30 minutos e ajuste a concentração de microesferas conforme necessário. Após o tratamento, mergulhe cada amostra em água para montá-la sobre o elastômero. Posicione uma lamínula revestida em um ângulo raso, de 15 a 30 graus, sob a amostra de cristalino (SC), com o elastômero voltado para o lado inferior do SC. Em seguida, levante a lamínula da água com o SC aderido acima, laminando suavemente a amostra de SC sem rugas ou bolhas de ar aprisionadas.
Em seguida, seque as amostras montadas em condições ambientes por cerca de uma hora. Após a secagem, transfira as amostras para uma câmara hermeticamente selada contendo um recipiente com água. Deixe as amostras em equilíbrio com a umidade por 24 horas.
No dia seguinte, monte uma amostra em uma câmara de perfusão para uma sessão prolongada de imageamento. Coloque a câmara de perfusão sobre o substrato e selar as bordas da câmara de perfusão ao elastômero utilizando graxa de vácuo. Em seguida, registre imagens fluorescentes e de luz transmitida com um campo de visão amplo o suficiente para capturar toda a amostra de SC.
Nas próximas 16 horas, capture uma imagem a cada 10 minutos. Em uma capela de exaustão química, carregue uma pequena tampa plástica com um mililitro de silano. Transfira a tampa para um recipiente fechado contendo um coverslip revestido com elastômero, sem contato direto.
Deixe-os incubarem à temperatura ambiente por cinco horas. Enquanto espera, prepare 20 mililitros da solução de microesferas de acordo com o protocolo descrito no texto e, em seguida, despeje-a em uma placa de 10 centímetros. Após cinco horas, posicione lentamente os substratos silanizados com a face do elastômero voltada para baixo na solução de microesferas.
Coloque dois substratos em cada placa e deixe os substratos reagirem com as microesferas por 45 minutos. Posteriormente, utilizando pinças, remova os substratos e enxágue-os em água destilada para remover as microesferas não ligadas. Em seguida, seque-os sob um fluxo suave de ar comprimido e armazene-os em uma caixa selada e opaca.
Utilizando a técnica descrita anteriormente, transfira as amostras de CS para um substrato tratado em um banho-maria. Imediatamente após montar o CS, aplique uma gota de cinco microlitros de solução concentrada de microesferas marcadoras fluorescentes sobre ele. Em seguida, deixe o CS secar por 60 minutos.
Agora, meça a espessura da SC usando o microscópio com uma lente objetiva de 40x em uma câmara de perfusão. Meça a espessura da SC ao longo do tempo, utilizando um acessório de foco remoto para registrar a diferença na altura Z entre as duas camadas de microesferas. Uma camada está na interface com o substrato da SC e a outra está na parte superior da SC. Usando as técnicas descritas, uma amostra de SC foi preparada e revestida com microesferas fluorescentes.
Após 16 horas de secagem, a 25% de umidade relativa, foram medidas as deformações. Devido à simetria circular das amostras, essas deformações foram médias azimutalmente. Durante toda a secagem, as deformações azimutais permanecem pequenas.
Os perfis de deslocamento radial, no entanto, aumentaram monotonicamente do centro para a borda e cresceram em magnitude até que um equilíbrio fosse atingido. Os perfis registrados em intervalos de 30 minutos mostram a evolução temporal dos deslocamentos no plano. A espessura média da camada córnea diminuiu durante a secagem, principalmente nas primeiras duas horas.
A dinâmica da secagem foi então analisada ajustando os perfis de deslocamento a um modelo de contratilidade linear e elástico, utilizando uma abordagem de mínimos quadrados. A partir do modelo, foram extraídos a tensão contrátil de secagem e o módulo elástico. Ambos os parâmetros aumentaram rapidamente nas primeiras duas horas de secagem.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de aderir completamente as amostras ao substrato. Após este procedimento, outros métodos, como a coloração de lipídios, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma pela qual tratamentos cosméticos específicos alteram a composição lipídica do tecido.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para quantificar a rigidez mecânica dinâmica e o comportamento de secagem do estrato córneo humano. Ao medir os deslocamentos de secagem no plano de amostras de tecido sobre um substrato de elastômero, a técnica avalia como tratamentos químicos afetam as propriedades do tecido.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biomecânica
- Ciência Cosmética
Contexto
- Compreender as propriedades mecânicas do estrato córneo é fundamental para aplicações no tratamento da pele.
- Os métodos atuais podem exigir mais tecido ou tempo do que o desejado.
- O comportamento dinâmico de secagem pode influenciar a eficácia de produtos de cuidados pessoais.
Objetivo do Estudo
- Quantificar tensões de secagem e rigidez mecânica em amostras de pele ex vivo.
- Avaliar o impacto de diversos tratamentos químicos nas propriedades da pele.
- Fornecer uma alternativa rápida aos métodos existentes de avaliação mecânica.
Métodos Utilizados
- Preparação de lamínulas revestidas com elastômero usando Sylgard 184.
- Medição de deslocamentos espacialmente resolvidos durante a secagem.
- Avaliação das propriedades mecânicas após o tratamento.
- Prevenção da evaporação pela face inferior da amostra para relevância fisiológica.
Resultados Principais
- O método permite a avaliação rápida das propriedades mecânicas da pele.
- Diferentes tratamentos químicos alteram significativamente o comportamento durante a secagem.
- É necessário menos tecido em comparação com os métodos tradicionais.
Conclusões
- Esta técnica aprimora a compreensão da biomecânica da pele.
- Fornece informações sobre os efeitos de produtos cosméticos na pele.
- Aplicações futuras podem melhorar a formulação e eficácia dos produtos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite uma avaliação rápida e fisiologicamente relevante das propriedades mecânicas do estrato córneo em condições de secagem, apoiando a avaliação inicial de formulações cosméticas e de cuidados pessoais. Ao quantificar as alterações dinâmicas na tensão de secagem e no módulo elástico, fornece informações preditivas sobre a função de barreira e a resiliência do tecido, orientando decisões de prosseguimento ou interrupção nos processos de desenvolvimento de produtos. A abordagem de alto rendimento e baixa exigência de tecido aumenta a eficiência do triagem e reduz a dependência de ensaios mecânicos tradicionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar como tratamentos cosméticos alteram as propriedades biomecânicas do estrato córneo, apoiando testes de hipóteses mecanicistas.
- Valor Operacional: Permite a triagem rápida dos efeitos de formulações na rigidez do tecido e na tensão de secagem com consumo mínimo de amostra.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera perfis quantitativos de deslocamento com resolução espacial que se correlacionam com alterações nas propriedades mecânicas durante a secagem.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo da amostra e a medição por meio de punções circulares aderidas a elastômero, melhorando a reprodutibilidade entre os grupos de tratamento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona alterações induzidas pela formulação no comportamento de secagem com a integridade da barreira, apoiando a relevância translacional para resultados na saúde da pele.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura contínua da evolução mecânica durante ciclos de secagem de 16 horas, permitindo avaliação de eficácia com resolução temporal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais o impacto da formulação sobre a biomecânica da pele é avaliado antes da otimização do composto líder, oferecendo uma ponte entre triagem molecular e avaliação funcional do tecido.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre como produtos de cuidados pessoais influenciam a mecânica do estrato córneo e o acúmulo de estresse induzido pela dessecação.
- Triagem: Fornece construtos padronizados de tecido-elastômero prontos para ensaios, adequados para comparação multifatorial em triagens de formulações.
- Análises: Extrai tensão de dessecação e módulo elástico a partir de perfis de deslocamento ajustados, permitindo comparação quantitativa dos efeitos de tratamentos ao longo do tempo.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a dinâmica mecânica da dessecação com a função de barreira, elucidando a relevância pré-clínica de intervenções cosméticas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de diversos ativos cosméticos, hidratantes e limpeza sob condições controladas de dessecação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva nos efeitos da formulação na resistência mecânica do tecido e no comportamento de secagem relacionado à barreira.
- Valor Operacional: Alto rendimento, baixo consumo de tecido e prevenção de artefatos de evaporação aumentam a confiabilidade e a escalabilidade do ensaio.
- Valor Estratégico: Permite a redução precoce de riscos de candidatos a formulações ao identificar aqueles que agravam o estresse mecânico induzido pela secagem.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de ingredientes cosméticos com base na compatibilidade biomecânica com o estrato córneo.
Considerações de Implementação
- Expertise em modelagem biomecânica e análise de imagens para rastreamento de deslocamento e ajuste de modelos.
- Acesso a centrífugas de deposição, câmaras de perfusão e controle ambiental para secagem regulada por umidade.
- Padronização dos protocolos de perfuração de tecidos, marcação com microesferas e revestimento com elastômero entre diferentes usuários.
- Considerações de adaptação para diferentes espessuras de tecido ou complacência da superfície ao estender o método além do estrato córneo humano.
- Limitação prática: o método assume comportamento elástico linear e simetria circular, o que pode não ser válido em estados teciduais patológicos ou severamente alterados.
