Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

O objetivo geral deste procedimento é criar uma plataforma dinâmica de co-cultura baseada em microfluídica para emular o ambiente intraperitoneal com os componentes celulares e mecânicos onde ocorre a metástase do câncer de ovário. Ao usar este micro para esta plataforma, ele ajuda a responder às principais questões no campo da biologia do câncer, como o microambiente de disseminação peritoneal. A principal vantagem dessa técnica é que uma co-cultura 3D sob fluxo livre controlado com precisão imita melhor a comunicação in vivo entre células de câncer de ovário e células de metotédia que ocorre em uma cavidade peritoneal.

Depois de projetar e desenhar o padrão de canal microfluídico e produzi-lo de acordo com o protocolo de texto, gire uma camada de SU82075 Photoresist no wafer de silicone com uma velocidade de rotação de 1800 RPM. Asse o wafer revestido com fotorresistente diretamente em uma placa quente a 65 graus Celsius por cinco minutos. E então a 95 graus Celsius por 25 minutos para remover o excesso de solvente.

Gire uma segunda camada de SU82075 Photoresist no wafer para obter uma espessura final de 250 micrômetros. Coloque o wafer revestido com fotorresistente diretamente em uma placa quente a 65 graus Celsius por sete minutos e depois a 95 graus Celsius por 30 minutos antes de resfriar lentamente o wafer até a temperatura ambiente. Em seguida, alinhe e coloque a máscara fotográfica diretamente em cima do wafer.

Em seguida, exponha-o à luz ultravioleta por 20 segundos para cruzar o comprimento do padrão. Em uma placa quente, asse o wafer revestido a 65 graus Celsius por cinco minutos e 95 graus Celsius por 12 minutos para remover o solvente para pré-limerização. Remova o fotorresistente sem comprimento cruzado imergindo o wafer em um revelador SU8 por 25 minutos.

Em seguida, com isopropano, enxágue o wafer e use ar pressurizado para secá-lo. Combine a base de polidimetilsiloxano ou PDMS e o agente de cura em uma proporção de massa de 10 para um e use o misturador centrífugo sob a função de mistura e desgaseificação para misturar a solução. Despeje lentamente a mistura PDMS no wafer a uma altura de aproximadamente cinco milímetros.

Desgaseifique o PDMS em um dessecador a vácuo por 40 minutos. Em seguida, catalise o PDMS no forno a 65 graus Celsius por duas horas. Retire cuidadosamente a placa PDMS do mestre e apare o PDMS ao longo dos canais até que fique do tamanho de uma lâmina de vidro.

Em seguida, com um punção de biópsia de um milímetro, perfure o PDMS para criar as entradas e saídas do dispositivo. Use ar pressurizado para limpar a superfície do PDMS e, em seguida, com fita adesiva, remova a poeira e os detritos do PDMS. Agora coloque a laje PDMS com o lado do canal voltado para cima em um limpador de plasma.

Em seguida, posicione uma lâmina de vidro limpa no limpador de plasma ao lado da placa PDMS. Trate o PDMS e a lâmina de vidro sob plasma de ar em alta frequência de rádio ou nível de RF por um minuto. Em seguida, depois de remover as amostras do limpador de plasma, ligue o PDMS à lâmina de vidro para criar uma ligação covalente irreversível.

Coloque o chip PDMS em uma placa quente a 150 graus Celsius por uma hora para aumentar a força de ligação e retornar a hidrofobicidade do PDMS antes do uso. Para revestir os canais microfluídicos com fibronectina, comece usando 30 microlitros de etanol a 75% para esterilizar os canais. Remova o etanol e use PBS para enxaguar os canais duas vezes.

Em seguida, aspire completamente o PBS dos canais. Prepare 10 microgramas por mililitro de solução de fibronectina em meio M199MCDB105 sem soro com 30 microlitros da solução, encha lentamente os canais e use fita adesiva para selá-los. Em seguida, incube o chip a quatro graus Celsius durante a noite.

Para semear células primárias de mesotelia peritoneal ou HPMCs nos canais microfluídicos, após enxaguar as células cultivadas de acordo com o protocolo de texto, use dois mililitros de meio de cultura 10% FBS para ressuspender os HPMCs. Usando um hemocitômetro, conte as células e ajuste a concentração celular para 3,5 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro. Aqueça o chip microfluídico revestido com fibronectina em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos antes de usar.

Em seguida, aspire completamente a solução de fibronectina e pipete lentamente 30 microlitros de suspensão de HPMC em cada canal. Use fita adesiva para selar os canais e coloque o dispositivo na incubadora de CO2 durante a noite. Para induzir a formação de esferóides de câncer de ovário, dissolva 0,5% de agarose em água esterilizada.

Dispense 50 microlitros da solução de agarose nos poços de placas de 96 poços. Depois de contar as células epiteliais de câncer humano previamente cultivadas, ressuspenda as células em meio de cultura 5% FBS a uma densidade de 5.000 células por mililitro. Transfira 200 microlitros de suspensão celular para cada poço revestido de agarose.

E cultive as células a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2 por 48 horas. Transfira os esferóides cancerígenos para um tubo de centrífuga de 50 mililitros pré-umedecido com um mililitro de meio sem soro e gire os esferóides a 750 vezes G por cinco minutos. Após a preparação de 2,5 microgramas por mililitro de solução CMFDA em meio M199MCDB105 sem soro.

Ressuspenda os esferóides cancerígenos em um mililitro da solução e incube os esferóides a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, conte o número de esferóides e use meio sem soro para ajustar a concentração para 2.000 esferóides por mililitro. Antes do carregamento do esferóide, injete lentamente 100 microlitros de meio M199MCDB105 sem soro para lavar as células mesotelio não aderidas dentro dos canais.

Carregue 30 microlitros de suspensão esferóide marcada com fluorescência em cada canal. Em seguida, coloque o chip microfluídico na incubadora de CO2. Monte uma plataforma de profusão conectando uma seringa carregada com meio M199MCDB105 sem soro fresco a um tubo de um metro de comprimento.

Coloque a seringa na bomba da seringa e prenda o êmbolo e o corpo da seringa. Em seguida, instale a bomba de seringa na posição horizontal na mesma altura do chip microfluídico dentro da incubadora. Infunda rapidamente todo o tubo com meio pressionando e segurando o botão de avanço rápido até que o meio transborde no tubo.

Em seguida, execute a injeção na taxa de fluxo desejada. Conecte a tubulação à entrada do canal de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, use um tubo de saída curto para conectar a saída do canal a um tubo cônico de 50 mililitros para coletar o meio de saída.

Finalmente, use um microscópio de campo brilhante ou fluorescência para observar os HPMCs e os esferóides cancerígenos. Usando a plataforma microfluídica descrita neste vídeo, esferoides de câncer de ovário foram modelados com células mesoteliais sob condições hidrodinâmicas. Conforme mostrado nesta figura, as células mesoteliais que foram cultivadas no microdispositivo por 16 horas formaram com sucesso uma monocamada de HPMCs.

Neste experimento, esferóides multicelulares com diâmetros de aproximadamente 100 micrômetros, que são semelhantes em tamanho aos encontrados em sociedades de pacientes, foram marcados com um corante fluorescente verde CMFDA. Os esferoides foram então transferidos para canais microfluídicos revestidos com HPMC e permaneceram em suspensão e as morfologias celulares foram capturadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em várias horas ao longo de três dias, se for executada corretamente.

Um em cada 10 neste procedimento, é importante lembrar de evitar a introdução de bolhas de ar nos canais microfluídicos. Após este procedimento, outros métodos, como tratamento medicamentoso, ensaios de adesão, ensaios de depuração de mesotelia podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o efeito do microambiente introperitoneal na progressão do câncer. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do câncer explorarem a mestase peritoneal em humanos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar um microdispositivo peritoneal com fluxo fluídico para iniciar o comportamento do câncer de ovário na cavidade peritoneal. Não se esqueça de que trabalhar com enxofres orgânicos, como acetona, como revelador e cilina, pode ser extremamente perigoso. Cuidados com o MP, como usar luvas e jaleco, devem sempre ser tomados ao realizar este procedimento pela primeira vez.

Todos os procedimentos que lidam com este cargo devem ser realizados sob cobertura extrema.