Tratamento de Estruturas Ligamentares com Soro Condicionado por Exercício: Um Modelo Translacional de Engenharia de Tecidos

O objetivo geral deste modelo é determinar o impacto do exercício e da nutrição na síntese e função do tecido conjuntivo. Esta técnica utiliza soro humano que é tomado antes e depois do exercício para tratar tecidos 3D, para que possamos entender como o exercício afeta a função dos ligamentos e tendões. A garantia de tecido 3D combina os benefícios de ensaios in vitro bem caracterizados com a função, morfologia e características bioquímicas dos tecidos in vivo.

Depois de preparar placas de 35 milímetros revestidas de silicone com antecedência de acordo com o protocolo de texto, prepare os moldes de ancoragem colocando um pino minuciano no centro de cada poço cilíndrico nos moldes. Combine a solução de fosfato tricálcico beta e ácido cítrico ortofosfórico a um a três gramas por mililitro em um barco de pesagem de plástico no gelo. Use um raspador de célula de plástico para misturar vigorosamente o cimento.

Triture o cimento para continuar misturando e pipete a mistura nos moldes, depois centrifugue o molde cheio a 2.250 vezes g por cinco minutos. Após a centrifugação, permita que as âncoras de cimento brushite endureçam em temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, remova as âncoras do molde e prenda duas âncoras, separadas por 12 milímetros em cada placa revestida de silicone.

Esterilize as placas fixadas pulverizando-as com etanol 70%, enchendo as placas e as tampas e, em seguida, coloque as placas em um armário de segurança biológica ou BSC. Após pelo menos 30 minutos, aspire as placas e deixe-as experimentar no BSC. Recoloque as tampas e guarde-as no BSC até que sejam necessárias.

Cumpra os regulamentos locais de risco biológico para uso e descarte adequados de material de risco biológico. Manter a esterilidade e executar etapas de formação de construções em um gabinete de segurança biológica. Após a preparação de fibroblastos primários, reagentes e placas revestidas de silicone com âncoras de brushite fixadas, de acordo com o protocolo de texto, cultivar as células em placas de 15 centímetros a 70% de confluência.

Em seguida, prepare uma mistura mestre composta pelo seguinte, 681 microlitros por construção de suspensão celular, 29 microlitros por construção de trombina, dois microlitros por construção de aprotinina e dois microlitros por construção de ácido aminohexanóico. Depois de misturar bem a solução, adicione 714 microlitros a cada placa fixada em um padrão em forma de oito ao redor das âncoras de cimento brushite, garantindo que a mistura principal entre em contato direto com as laterais das âncoras. Bata suavemente em cada prato para distribuir uniformemente a mistura.

A etapa mais crítica é formar o gel de fibrina sentado na célula. Certifique-se de que a mistura principal do assento da célula entre em contato direto com as âncoras e bata na placa para distribuir a mistura uniformemente. Um prato de cada vez, adicione 286 microlitros de fibrinogênio de forma gota a gota uniformemente sobre o prato.

Deslize imediatamente a placa para frente e para trás e de um lado para o outro para distribuir o fibrinogênio para formar os géis de fibrina incorporados nas células e, em seguida, prossiga para a próxima placa. Coloque as construções em uma incubadora estéril mantida a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube-as por pelo menos 15 minutos para permitir a polimerização do fibrinogênio. Prepare dois mililitros por construção de meio de alimentação suplementando o meio de crescimento com 200 micromoles de ácido ascórbico, 50 micromoles de Prolene e cinco nanogramas por mililitro de TGF beta 1.

Use dois mililitros de meio de alimentação para cobrir cada construção e cultive as construções em uma incubadora estéril mantida a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por um total de 14 dias, ou até o ponto final desejado, atualizando o meio a cada dois dias com dois mililitros de meio de alimentação. Para coletar soro humano, retire uma amostra de sangue em repouso de acordo com o protocolo de texto e, em seguida, peça aos participantes que realizem um modo de exercício que se adapte ao seu objetivo de pesquisa. Aqui é mostrada uma sessão de 30 minutos de exercícios de resistência de alta intensidade.

Colete uma amostra de sangue 15 minutos após a sessão de exercícios e, depois de permitir que o sangue coagule, gire a amostra a 1.500 vezes g por 10 minutos. Em condições estéreis, transfira o soro para tubos estéreis para preparação do meio. Após a preparação das construções ligamentares, realize o teste de tração usando um testador de tração em um banho PBS com garras moldadas reversas que são acopladas ao transdutor de força.

Isso mantém as âncoras de cimento brushite no lugar durante o teste. Usando paquímetros digitais, determine o comprimento e a largura das construções ligamentares e calcule a área da seção transversal do tecido. Solte a construção do ligamento da placa e coloque as âncoras nas garras moldadas reversas, garantindo que a construção esteja submersa em PBS e, em seguida, ajuste a distância entre as garras, definindo o comprimento da construção para seu comprimento inicial.

Comece o teste e force a construção até a falha a uma taxa de deformação de 0,4 milímetros por segundo, ou 3% por segundo. Após o teste, processe o tecido e realize a quantificação do colágeno dos ligamentos projetados de acordo com o protocolo de texto. Após um a dois dias em cultura, os fibroblastos do LCA se ligaram ao gel de fibrina, estenderam os processos celulares e começaram a exercer forças de tração.

A tensão é gerada entre os dois pontos de ancoragem, e as células se alinham paralelamente a esse eixo e começam a depositar colágeno. Aqui é mostrado um gráfico de tensão e deformação representativo para um ligamento testado até a falha. Nesses experimentos, o soro humano foi isolado de amostras de sangue pré e pós-exercício e usado no lugar do FBS para gerar meios enriquecidos com o meio bioquímico induzido pelo exercício.

Conforme mostrado neste gráfico, após um período de cultura de 14 dias, as construções ligamentares demonstraram um aumento significativo na carga máxima de tração e no conteúdo de colágeno em resposta ao soro pós-exercício. Uma vez dominadas, as construções ligamentares podem ser feitas ao longo de dois dias e estarão prontas para testes de tração, quantificação do conteúdo de colágeno e outras análises bioquímicas em duas semanas. Este modelo translacional in vitro in vivo faz parte de uma missão mais ampla de entender como o exercício melhora a função dos ligamentos, tendões e, na verdade, quase todos os tecidos do corpo.

Portanto, esta é uma técnica realmente robusta e forte, onde podemos determinar o conteúdo de colágeno e a função do tecido conjuntivo após tratamentos com exercícios, nutrição, carga, quaisquer tipos de fatores de crescimento, todos os tipos de intervenções diferentes que podemos fazer em humanos ou animais.