Dissecação, digitalização MicroCT e morfométricas Análises do Baculum
19 de março de 2017
Muitas estruturas biológicas falta marcos facilmente definíveis, o que torna difícil a aplicação de métodos morfométricos modernos. Aqui, ilustramos métodos para estudar o báculo rato (um osso do pénis), incluindo dissecção e digitalização microCT, seguido por métodos computacionais para definir semi-chave que são utilizadas para quantificar a forma e tamanho variação.
O objetivo geral desta dissecação e análise morfométrica é ilustrar a robustez de nossa metodologia morfométrica para o estudo de estruturas com formas complexas, como o osso do pênis do camundongo. Tivemos pela primeira vez a ideia para este estudo ao perceber que os métodos existentes de mensuração da variação do baculo, como a obtenção das dimensões de comprimento e largura, perdiam toda a informação sobre curvatura e complexidade da forma; por isso, desenvolvemos este método para quantificar a variação de tamanho e forma de qualquer osso ou estrutura de interesse em três dimensões. A principal vantagem desta técnica é que ela aplica morfometria moderna a estruturas sem pontos de referência anatômicos.
Isso deve avançar o campo ao fornecer medidas repetíveis aprimoradas de estruturas complexas. Posicione um camundongo macho adulto sexualmente maduro, previamente eutanasiado, em posição supina e progrida o pênis aplicando pressão com o polegar lateralmente à abertura prepucial. Uma vez que o pênis emerja, estenda o tecido através do prepúcio o máximo possível.
Em seguida, usando tesoura, corte o corpo peniano próximo à glande do pênis, onde se localiza o baculum, destacando o pênis. Então, submerja completamente o pênis em cerca de 200 microlitros de água da torneira em um tubo de microcentrífuga. Para amaciar o tecido, incube-o a aproximadamente 50 graus celsius por três a cinco dias.
O amolecimento do tecido reduz a chance de o osso quebrar durante a extração. Após a incubação, utilize um microscópio de dissecação e pinça para remover a maior parte do tecido ao redor do baculo. Após a dissecação macroscópica, borrife suavemente etanol a 70 por cento para remover o tecido remanescente e limpar o osso.
Em seguida, coloque o baculo dissecado em um novo tubo de microcentrífuga e deixe o osso secar à temperatura ambiente com a tampa aberta. Para começar, prepare o material no qual o osso será colocado. Pressione um suporte cilíndrico para tomografia computadorizada em um bloco de espuma floral.
Em seguida, extraia o cilindro resultante de espuma e corte fatias de espuma com espessura entre dois e cinco centímetros. Agora, insira de 10 a 15 baculos secos na espuma floral ao redor da periferia de uma fatia individual para minimizar interferências durante a varredura. Anote a orientação precisa do osso para identificação futura.
Em seguida, coloque cuidadosamente os ossos sobre a espuma no suporte do microtomógrafo computadorizado e insira o suporte em um scanner micro CT 50. Configure o scanner micro CT 50 da seguinte maneira: utilize 90 quilovolts-pascal, um tamanho de vóxel de 155 angstroms, um filtro de alumínio de 5 mililitros, 750 projeções por 180 graus e um tempo de exposição de 500 milissegundos.
Em seguida, prossiga para escanear o espécime. Os ossos do baculum foram dissecados, preparados e escaneados utilizando o protocolo descrito. Muitos ossos podem ser acomodados em um único exame de tomografia computadorizada.
As imagens foram então processadas utilizando geometria computacional, conforme descrito no protocolo textual. Esse processo de imagem deve ser aplicável ao estudo de uma ampla variedade de ossos e outros objetos de interesse. A análise fornece informações detalhadas sobre as características marcantes do objeto e é altamente automatizada.
Esse processo exigiu apenas cerca de 10 ajustes manuais ao analisar 369 baculos. O mais empolgante é que nossos métodos podem ser aplicados a uma grande variedade de estruturas complexas. Esses métodos nos permitiram quantificar o tamanho e a forma do baculo em três dimensões.
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Visão Geral
Este estudo demonstra uma metodologia morfométrica robusta para analisar o baculum de camundongo, um osso presente no pênis, que carece de marcos anatômicos facilmente definíveis. Ao empregar dissecação e escaneamento por microTC, a pesquisa quantifica a variação de tamanho e forma utilizando semimarcos, aprimorando a compreensão de estruturas biológicas complexas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Morfometria
Antecedentes
- O baculo do camundongo apresenta desafios devido à sua forma complexa.
- Métodos tradicionais de medição não conseguem captar a curvatura e a complexidade da forma.
- Técnicas modernas de morfometria podem melhorar a precisão das medições.
- Este estudo tem como objetivo avançar o campo da morfometria.
Objetivo do Estudo
- Ilustrar um método para quantificar a variação de tamanho e forma no baculum de camundongo.
- Fornecer uma estrutura para o estudo de outras estruturas biológicas complexas.
- Aprimorar a repetibilidade e a precisão nas medições morfométricas.
Métodos Utilizados
- Dissecação do baculum de um camundongo macho adulto eutanasiado.
- Escaneamento por microTC para obter informações estruturais detalhadas.
- Métodos computacionais para definir semipontos de referência para análise.
- Análise quantitativa da variação de tamanho e forma em três dimensões.
Resultados Principais
- A metodologia quantificou com sucesso a variação de tamanho e forma do baculum.
- Os resultados indicaram curvatura significativa e complexidade de forma que métodos tradicionais ignoraram.
- Essa abordagem pode ser aplicada a outras estruturas que carecem de marcos anatômicos definidos.
- Os achados contribuem para uma melhor compreensão da análise morfométrica.
Conclusões
- O estudo apresenta um método inovador para analisar estruturas biológicas complexas.
- Destaca a importância da morfometria moderna na pesquisa biológica.
- A abordagem pode aumentar a precisão das medições em diversas áreas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise morfométrica quantitativa de estruturas biológicas complexas, como o baculo do camundongo, preenche uma lacuna crítica na descoberta inicial ao permitir medições precisas em locais onde os marcos tradicionais estão ausentes. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva na triagem fenotípica e apoia a validação robusta de alvos ao fornecer dados repetíveis e de alta resolução sobre forma e tamanho. A abordagem é amplamente aplicável a fluxos de pesquisa e desenvolvimento que exigem avaliações morfológicas quantitativas padronizadas para diversos espécimes biológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite testes rigorosos de hipóteses ao quantificar a variação morfológica em estruturas que carecem de marcos anatômicos definidos.
- Apoia a desmistificação biológica por meio de medidas reprodutíveis de forma e tamanho tridimensionais.
- Facilita a validação funcional de alvos ao capturar diferenças fenotípicas sutis não detectáveis por métricas tradicionais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara modelos 3D validados para triagem fenotípica e estudos comparativos posteriores.
- Padroniza a coleta de dados morfométricos, melhorando a reprodutibilidade e a confiabilidade dos ensaios.
- Gera saídas quantitativas adequadas para análise de alto rendimento e comparações entre estudos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a quantificação morfológica à descoberta de biomarcadores translacionais quando a variação de forma é relevante para a doença.
- Garante continuidade do estágio inicial de descoberta até a validação pré-clínica, permitindo protocolos de medição consistentes.
- Reduz a ambiguidade mecanicista em modelos pré-clínicos ao fornecer dados estruturais detalhados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho morfométrico integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes, apoiando tanto pesquisas orientadas por hipóteses quanto fluxos de trabalho de triagem escaláveis.
- Biologia da Descoberta: Aperfeiçoa testes de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a medição de formas complexas sem pontos anatômicos tradicionais.
- Triagem: Fornece dados morfométricos quantitativos e reprodutíveis para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Oferece medições tridimensionais de alta resolução e saídas estatísticas para comparações robustas entre condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores quando características morfológicas estão associadas a modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho automatizado amplamente aplicável a diversas estruturas biológicas além do caso de uso inicial.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos morfológicos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade das análises morfométricas.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao fornecer dados quantitativos robustos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos em fase de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em morfometria, geometria computacional e imagens de microTC.
- Exige acesso a escâneres de microTC e infraestrutura computacional para análise.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de posicionamento de marcos anatômicos e semimarcos.
- Adaptável a diversos sistemas modelo com ajustes computacionais apropriados.
- A intervenção manual é mínima, mas pode ser necessária para controle de qualidade em conjuntos de dados grandes.
