Name: Dissecação, digitalização MicroCT e morfométricas Análises do Baculum (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Aprenda a analisar estruturas biológicas complexas usando dissecação e digitalização MicroCT. Este método morfométrico quantifica variações de tamanho e forma em três dimensões, aplicável a ossos sem marcos definidos.

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Tim Daley e Andrew Smith forneceu muitas discussões computacionais úteis durante os primeiros dias; Tim Daley escreveu o rotate_translate_cylindrical programa necessário para o protocolo 5. recursos computacionais foram fornecidos pelo High Performance Cluster Computing na Universidade do Sul da Califórnia. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder # GM098536 (MDD).

Todos os procedimentos e pessoal foram aprovados pela universidade do instituto do sul da Califórnia para Animal Care e do Comitê Use (IACUC), protocolo nº 11394. 1. Baculum Dissecção e Preparação <ol><li> Euthanize um rato macho sexualmente maduros através de dióxido de carbono sobre-exposição, de acordo com protocolos estabelecidos pelo Comité pertinente Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC). </li><li> Coloque o animal em decúbito dorsal, e prolongar o pénis através da aplicação de pressão com os polegares lateralmente à abertura do prepúcio. </li><li> Uma vez que o pénis é prolongada, alargar o tecido através do prepúcio, tanto quanto possível. </li><li> Com uma tesoura, corte o proximal do corpo do pénis à glande do pénis onde o baculum reside. </li><li> Transfira os pénis dissecados para um tubo de 1,7 ml e adicionar 200 mL de água da torneira. Certifique-se de que o pênis está totalmente submersa no líquido. </li><li> Incubar o tecido em água a ~ 50 ° C durante 3-5 dias. </li><li&gt; Após incubação adequada, remova o tecido circundante do báculo, usando uma pinça sob um microscópio de dissecação. Gentilmente esguichar 70% de etanol para empurrar restante tecido e limpar o osso. </li><li> Colocar o báculo dissecados para um novo tubo de microcentrifugação com a tampa aberta. Deixe tampão aberto O / N a secar óssea. </li></ol> Digitalização 2. MicroCT <ol><li> Pressione um suporte cilíndrico digitalização microCT em um tijolo de espuma de florista para criar um cilindro de espuma de florista. </li><li> Extraia o cilindro de espuma de florista e cortar fatias ~ 2-5 cm de espessura. </li><li> Empurrar bacula seca na espuma florista, em torno da periferia de uma fatia individual a minimizar a interferência durante a verificação. A orientação precisa dos ossos deve ser comentou permitindo a identificação adequada das amostras individuais no Protocolo 4. </li><li> Delicadamente, coloque a fatia com os ossos incorporados no suporte para microCT. </li><li> Adquirir scans microCT. No caso de bacula rato 14 </sup&gt;, Foi utilizado um scanner uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Suíça) na USC Molecular Imaging Center sob as seguintes configurações: 90 kVp, 155 mA, 0,5 filtro mm Al, 750 projecções por 180 (cobertura de 360), tempo de exposição de 500 ms e tamanho voxel de 15,5 mm. </li></ol> 3. Processamento MicroCT: Convertendo um Stack .dcm para um arquivo .xyz Individual NOTA: Cada varredura microCT produz uma pilha de .dcm, ou &quot;DICOM&quot;, arquivos que representam fatias de imagem obtidos através do objeto. Toda a geometria computacional jusante requer arquivos .xyz planas, que é simplesmente um arquivo de texto que contém quatro colunas - X, Y e Z coordenadas de cada pixel, e a intensidade do pixel, que vão desde -5000 (preto) para 5000 (branco). Um limiar do pixel acima de 3.000 geralmente funciona bem como um limiar para a definição de ossos. <ol><li> Instalar Python (www.python.org) e os módulos Python COMANDOS, DICOM, Pylab, SYS e Numpy. </li><li> Open &quot;01_process_dicom.py &quot;{} Figshare com qualquer editor de texto. Na seção Variáveis, caminho de mudança, limites de pixels, e nomes de diretórios, conforme necessário. </li><li> Execute &quot;01_process_dicom.py python&quot;. Progress será impresso para a tela. Dentro de cada diretório nomeado na etapa 3.2, um novo arquivo é chamado; por exemplo, directory_name.PT3000.xyz, onde PT3000 indica o limiar do pixel indicado no passo 3.2. </li></ol> 4. Processamento MicroCT: Segmentando-out individual Specimen .xyz Arquivos <ol><li> Instale R (https://www.r-project.org/) com o RGL biblioteca. </li><li> Abra o arquivo &#39;02_segment_dicoms.r&#39; {} Figshare com qualquer editor de texto. Na seção Variáveis, mudar o nome do caminho para apontar para o arquivo .xyz criado no Protocolo n.º 3 acima. </li><li> De dentro R, execute a &quot;fonte ( &#39;02_segment_dicoms.r&#39;)&quot; comando (sem as aspas). </li><li> Após a imagem tridimensional do .xyz criado no Protocolo n.º 3 aparecer, digite o number de espécimes no arquivo geral .xyz. Em seguida, rotular e selecionar os pontos de cada amostra, utilizando as funções de rolagem e zoom. NOTA: No fundo, arquivos .xyz separadas será feita para cada espécime. Estes aparecem em um diretório chamado, por exemplo, XYZ_FILES_PT3000, onde PT3000 indica o limite de pixel usado. </li></ol> 5. &quot;Alinhar&quot; Specimen .xyz arquivos para Coordenadas Comum. <ol><li> Abra o script &quot;03_transform.py&quot; Python {Figshare}, que exige a mattdean_modules.py adicional módulo {Figshare}, bem como duas aplicações autónomas: &quot;rotate_translate_cylindrical&quot; (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) e &quot;qconvex&quot; (www.qhull.org/html/qconvex.htm) que são usados ​​por este script. </li><li> Na seção Variáveis, identificar os nomes caminho completo para mattdean_modules.py, rotate_path e qconvex_dir. Além disso, identificar o caminho completo para o diretório que contém o .xy indivíduoarquivos z criou na etapa 4. </li><li> 03_transform.py executado, o que cria um novo arquivo por espécime com o sufixo .TRANSFORMED.xyz. </li></ol> 6. &quot;fatiamento&quot; Specimen Alinhados .xyz Arquivos identificar Semi-marcos. <ol><li> Abrir e executar o script Python &quot;04_identify_landmarks.py&quot; {} Figshare. Na seção Variáveis, identificar nomes de caminho completo para o diretório que contém os arquivos .TRANSFORMED.xyz. Este script identifica 802 semi pontos de referência que pode ser usado para quantificar o tamanho e forma da estrutura. </li></ol>

<ol><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.anthro.34.081804.120613">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li>
<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlice%2C+DE+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. 6, Springer. (2005).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , 2nd, Elsevier. (2012).</li>
<li>Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBookstein%2C+F+%22Morphometric+tools+for+landmark+data%3A+geometry+and+biology%22">Morphometric tools for landmark data: geometry and biology</a>. , Cambridge University Press. (1991).</li>
<li>Rohlf, F. J., Marcus, L. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21236128">A Revolution in Morphometrics.</a> Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Rohlf, F. J., Slice, D. E. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2992207">Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks.</a> Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).</li>
<li>Gunz, P., Mitteroecker, P. <a target="_blank" href="http://www.italian-journal-of-mammalogy.it/article/view/6292">Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces.</a> Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).</li>
<li>Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+bony+labyrinth+reconsidered%2C+introducing+a+comprehensive+geometric+morphometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach.</a> J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).</li>
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<li>Oxnard, C., O'Higgins, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1162/biot.2009.4.1.84">Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology?</a> Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).</li>
<li>Schultz, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+baculum+size+and+shape+variation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of baculum size and shape variation in mice.</a> G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).</li>
<li>Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculum+was+gained+and+lost+multiple+times+during+mammalian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution.</a> Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).</li>
<li>Dines, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+selection+targets+cetacean+pelvic+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Sexual selection targets cetacean pelvic bones.</a> Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).</li>
<li>Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/2041-210X.12035/abstract">geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data.</a> Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As etapas críticas do protocolo acima são: 1) dissecar o bacula, 2) coleta as imagens microCT, 3) converter a saída microCT para um arquivo plano de coordenadas XYZ, 4) segmentar a nuvem de pontos de cada espécime, 5) transformar cada amostra para um padronizado sistema de coordenadas, e 6) que define semi-marcos. Estes passos são facilmente modificado para acomodar diferentes objectos. Estes métodos podem provavelmente ser aplicado a qualquer objecto que, pelo menos, não é, essencialmente &...

O campo de morfometria inclui uma diversidade de métodos para quantificar o tamanho e a forma da forma biológica, uma etapa fundamental na investigação científica 1, 2, 3, 4, 5, 6. Tradicionalmente, a análise estatística de tamanho e forma começa pela identificação de pontos de referência em uma estrutura biológica, e depois medir distâncias lineares, ângulos e proporções, que podem ser analisadas num quadro multivariada. -Marco com base geométrica Morfometria é uma abordagem que mantém a posição espacial de pontos, preservando informações geométricas de coleta de dados por meio de análise e visualização 5. Análise Procrustes Generalizada (GPA) pode ser aplicada para remover a variação na localização, dimensão e rotação dos pontos de referência para produzir um alinhamento entre amostras que a Minimizes suas diferenças ao quadrado - o que resta é a forma dissimilaridade 7. Um conceito importante de qualquer análise morfométrica é homologia, ou a ideia de que se pode identificar com segurança marcos representando características biologicamente significativas e discretas que correspondem entre amostras ou estruturas. Por exemplo, crânios humanos têm processos homólogos, forame, suturas, e dutos que podem permitir análises morfométricas. Infelizmente, a identificação de pontos de referência correspondente é difícil em muitas estruturas biológicas, especialmente aqueles com superfícies lisas ou curvas 8, 9, 10. Nós abordar este problema a seguir utilizando geometria computacional. O fluxo geral é para gerar uma análise tridimensional do objecto que pode ser representada como uma nuvem de pontos, e em seguida rodar e que transformar nuvem de pontos de modo a que todos specimens são orientados em um sistema de coordenadas comum. Então nós definimos matematicamente semi-marcos de regiões específicas do objeto. Discretas semi pontos de referência colocadas em tais regiões são biologicamente arbitrário 11. Realização GPA e as análises estatísticas subsequentes podem produzir artefatos indesejáveis 8, 12, porque os marcos colocados arbitrariamente pode não ser biologicamente homóloga. Portanto, permitimos que estas meias-marcos para matematicamente &quot;slides&quot;. Este procedimento minimiza a diferença de potencial entre as estruturas. Como argumentei o algoritmo de correr aqui utilizada é apropriada para quantificar regiões anatômicas semelhantes faltam facilmente identificados marcos 3, 6, 8, 10, 11, 12 correspondente. Esses métodos têm o seu limitations 13, mas deve ser adaptável para objectos de tamanho e forma diferentes. Aqui, nós ilustrar como este método foi aplicado em um estudo recente da baculum rato 14, um osso no pênis que tem sido ganhou e perdeu várias vezes independentes durante a evolução dos mamíferos 15. Discute-se a dissecção e preparação de um osso específico, o báculo (Protocolo 1), a geração de imagens microCT (protocolo 2), ea conversão destas imagens para um formato que permite que toda a geometria computacional jusante (Protocolos 3 e 4). Após estas etapas, cada amostra é representado por ~ 100K xyz coordenadas. Em seguida, a pé através de uma série de transformações que efetivamente alinhar todas as amostras em uma orientação comum (Protocolo 5), em seguida, definir semi-marcos de espécimes alinhados (Protocolo 6). Protocolos 1-4 deve ser semelhante, independentemente do objeto analisado. O protocolo nº 5 e Protocolo 6 são specamente projetado para um báculo, mas é nossa esperança que, detalhando estes passos, os investigadores podem imaginar modificações que seriam relevantes para o seu objeto de interesse. Por exemplo, foram aplicadas modificações destes métodos para estudar ossos pélvicos baleia e costelas 16.

<table><tbody><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>A maioria dos tamanhos deve funcionar</td></tr><tr><td>Pinça de dissecação, ponta fina, curva</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>Para ser diluído a 70% para dissecações</td></tr><tr><td>Espuma Floral</td><td>Atacado Floral</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>scanner uCT50</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, Suíça</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissecação, digitalização microct e morfométricas análises do baculum

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

morfometria modernos fornece métodos poderosos para quantificar o tamanho e forma variação. Um requisito básico é uma lista de coordenadas que definem marcos; no entanto, tais coordenadas devem representar estruturas homólogas em toda espécimes. Enquanto muitos objetos biológicos consistem de marcos facilmente identificadas para satisfazer a hipótese de homologia, muitos não têm tais estruturas. Uma possível solução é matematicamente lugar semi-marcos em um objeto que representam a mesma região morfológica através de espécimes. Aqui, nós ilustrar um gasoduto recentemente desenvolvido para definir matematicamente semi-marcos do rato baculum (osso do pênis). Os nossos métodos deve ser aplicável a uma vasta gama de objectos.

As coordenadas xyz das meias-marcos produzidos no Protocolo 6 pode ser diretamente importado para qualquer morfometria geométrica análise baseada no marco 17. O oleoduto computacional supra foi aplicado para estudar bacula rato 14, bem como pélvica baleia e as costelas 16. Mais detalhes sobre a definição computacional de semi-marcos são apresentados aqui, em uma tentativa de ajudar os pesquisadores a visualizar passo...

Muitas estruturas biológicas falta marcos facilmente definíveis, o que torna difícil a aplicação de métodos morfométricos modernos. Aqui, ilustramos métodos para estudar o báculo rato (um osso do pénis), incluindo dissecção e digitalização microCT, seguido por métodos computacionais para definir semi-chave que são utilizadas para quantificar a forma e tamanho variação.

Dissecação, digitalização MicroCT e morfométricas Análises do Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

O objetivo geral desta dissecação e análise morfométrica é ilustrar a robustez de nossa metodologia morfométrica para o estudo de estruturas com formas complexas, como o osso do pênis do camundongo. Tivemos pela primeira vez a ideia para este estudo ao perceber que os métodos existentes de mensuração da variação do baculo, como a obtenção das dimensões de comprimento e largura, perdiam toda a informação sobre curvatura e complexidade da forma; por isso, desenvolvemos este método para quantificar a variação de tamanho e forma de qualquer osso ou estrutura de interesse em três dimensões. A principal vantagem desta técnica é que ela aplica morfometria moderna a estruturas sem pontos de referência anatômicos.Isso deve avançar o campo ao fornecer medidas repetíveis aprimoradas de estruturas complexas. Posicione um camundongo macho adulto sexualmente maduro, previamente eutanasiado, em posição supina e progrida o pênis aplicando pressão com o polegar lateralmente à abertura prepucial. Uma vez que o pênis emerja, estenda o tecido através do prepúcio o máximo possível.Em seguida, usando tesoura, corte o corpo peniano próximo à glande do pênis, onde se localiza o baculum, destacando o pênis

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