O uso do condicionamento de rastreamento Eyeblink clássico para avaliar disfunção Hippocampal em um modelo do rato de transtornos do espectro do álcool Fetal

O objetivo geral deste experimento é demonstrar como o uso do condicionamento clássico do reflexo palpebral por traço, uma forma de aprendizado associativo, pode auxiliar na detecção de disfunção hipocampal em um modelo de ratos para transtornos fetais alcoólicos. Filhotes de ratos neonatos são submetidos a uma alta dose de álcool, numa concentração de 11,9% volume/volume de álcool, administrada em padrão semelhante a uma bebedeira. Durante o período equivalente ao terceiro trimestre em humanos, em termos de crescimento cerebral.

Esse padrão de exposição ao álcool e dose são fatores-chave na produção de déficits cerebrais ao longo do ciclo de vida, imitando casos humanos de TEAF. Uma região cerebral importante que é comprometida pela exposição precoce ao álcool é o hipocampo. Após os ratos atingirem a idade adulta, eles são examinados quanto à disfunção do hipocampo utilizando o condicionamento clássico do reflexo palpebral em traço.

Esta é uma forma de aprendizado associativo de alto nível que depende da integridade do hipocampo. Durante os dias pós-natais de quatro a nove, as crias de rato são pesadas todas as manhãs e seus pesos são registrados. Os volumes de alimentação são então obtidos a partir de uma tabela pré-impressa com base no peso corporal.

Uma solução alcoólica de 11,9% volume/volume é administrada a filhotes de rato em duas refeições separadas por duas horas. A dose diária total de álcool é de 5,25 gramas por quilograma por dia. Esse paradigma de exposição aguda fornece 0,278 mililitros de álcool por grama de peso corporal por refeição na solução de leite.

Extraia o leite contendo álcool utilizando uma seringa estéril de um mililitro. Em seguida, expulse o excesso de solução para obter a quantidade exata necessária. Mergulhe a ponta do tubo de PE-10 em óleo de milho fresco.

Isso facilita a inserção. Meça o comprimento do tubo de PE-10 da boca do filhote até o estômago. Se necessário, ajuste o tampão de PE-50 para atuar como um guia visual para o ponto de parada.

Insira cuidadosamente o tubo PE-10 na boca do filhote. Normalmente, você encontrará alguma resistência quando a ponta atingir a garganta. Maneje o tubo até que a ponta se dobre para a entrada do esôfago.

Tente não deixar o tubo escorregar para trás, pois ele pode ficar escorregadio com o óleo. Prossiga pelo esôfago e, quando a ponta passar pelo esfíncter gastroesofágico, entrará no estômago. Pare neste ponto, estabilize a bomba e administre a solução.

Isso deve ser feito em uma taxa lenta. Remova cuidadosamente o tubo PE-10 e examine o filhote quanto a refluxo da solução, sangue ou lesão física. Substitua o filhote pelos seus companheiros de ninhada se estiver bem.

Consulte o protocolo escrito e a lista de materiais para obter os instrumentos específicos utilizados no procedimento cirúrgico de pálpebra. Esterilize o campo cirúrgico com um desinfetante aprovado e autoclave todos os instrumentos e materiais cirúrgicos com antecedência. Após induzir anestesia adequada na rata com isoflurano, depile a cabeça utilizando uma máquina de cortar pelos, expondo uma área suficiente de pele para o local da incisão e para a pálpebra esquerda.

A pele é esterilizada realizando três esfregações alternados com álcool isopropílico a 70% e iodopovidona. Siga o procedimento padrão para fixar a rata no aparelho estereotáxico com as hastes auriculares. Prossiga com a cirurgia quando a rata apresentar plano anestésico adequado.

Use a lâmina de bisturi para fazer uma incisão ântero-posterior na linha média. Essa incisão deve expor uma área suficiente anterior aos olhos e ligeiramente posterior à linha lambdoide. Use a lâmina de bisturi para raspar cuidadosamente o periósteo localizado na parte superior do crânio, tomando cuidado para não causar sangramento excessivo.

Remova o excesso de tecido conjuntivo e sangue com um cotonete e enxágue a área com solução salina estéril entre as raspagens. Faça um furo iniciando diretamente atrás da sutura coronal em um dos ossos parietais. Remova qualquer sangue e debris ósseo com um cotonete.

Use uma pinça de ponta fina para segurar um parafuso 0 80. Use uma chave de fenda de ourives para fixar o parafuso no orifício, apertando-o o suficiente sem danificar o tecido cortical cerebral, geralmente de três a quatro voltas completas. Siga o mesmo procedimento para fixar os parafusos restantes.

Devem haver dois parafusos fixados bilateralmente atrás da sutura coronal e um no osso parietal direito, anterior à sutura lambda. Segure a pele superior no local da incisão do olho esquerdo com a pinça de curativo de quatro polegadas e direcione a pinça de curativo de três polegadas para o canto desse olho. Pegue uma agulha de calibre 26 e 3/8 de polegada e insira-a no canto da pálpebra.

Gire a agulha para que o lado biselado fique voltado para cima. Insira a segunda agulha no meio da pálpebra. Use uma pinça fina para segurar um fio 3T e inseri-lo em uma das agulhas.

Você não precisa inseri-lo completamente. Siga o mesmo procedimento para o segundo fio 3T. Segure ambas as agulhas com uma mão enquanto segura o estágio da cabeça com a outra mão.

Em um único movimento contínuo, afaste as agulhas da pálpebra enquanto orienta o estágio de cabeça na mesma direção. Enquanto segura o estágio de cabeça do EMG com uma mão, use a pinça cirúrgica de três polegadas com a outra mão para enrolar o fio 10T em um ou ambos os parafusos do lado direito. Acomode esse fio para que ele não fique exposto para fora dos parafusos.

A etapa da cabeça do EMG deve ser centralizada antes de passar para a próxima etapa. Utilize a pinça cirúrgica de quatro polegadas para criar um pequeno bolsão separando a pele, ou seja, a fáscia superficial, do músculo temporal. Com o bolsão criado, use a tesoura de íris para remover mais tecido conjuntivo, trabalhando em direção ao canto do olho esquerdo.

Tenha cuidado para não ir muito fundo nem cortar quaisquer vasos sanguíneos. Pegue um eletrodo bipolar e modele o fio condutor de modo que possa ser ajustado ao longo da curvatura do músculo temporal. Os dois terminais serão posicionados posteriormente ao olho esquerdo e a extremidade inferior do eletrodo bipolar será posicionada diretamente no topo do crânio.

Misture o pó Ortho Jet com os componentes líquidos para obter uma consistência líquida. Aplique a pasta com uma espátula micro em toda a região do local da incisão. Tenha cuidado para não derramar nenhuma pasta nos olhos do rato e mantenha-a contida.

Deixe o Ortho Jet atingir um estado semi-seco, depois use a pinça de espinhos para remover o acrílico em excesso na plataforma de registro de EMG e nas rosca do eletrodo bipolar. Corte o fio 3T em excesso, deixando alguns centímetros para trabalhar.

Remova cuidadosamente o revestimento de PTFE de cada fio 3T usando pinças microcirúrgicas. Isso permite que eles façam contato com o músculo orbicular dos olhos. Use as pinças microcirúrgicas para criar ganchos em cada extremidade dos fios 3T.

Recorte o excesso de fio, tomando cuidado para não cortar tanto que o fio restante se retrai para dentro da pálpebra. Os cabos são fabricados internamente. O conector bipolar branco é conectado primeiro, e isso permite a aplicação do estímulo de choque US.

A tomada laranja do estágio inicial do EMG é conectada posteriormente. Ela registra a atividade eletromiográfica enquanto a rata pisco. Ambas as tomadas conduzem a um comutador circular na extremidade superior do braço, o qual mantém a continuidade do sinal enquanto o animal se movimenta livremente.

O isolador de estímulo é ligado e são realizados os últimos testes de hardware. Isso inclui ajustar a linha de base do EMG para um nível visível na tela do computador. Na primeira sessão, a intensidade do choque é inicialmente definida em 4 miliampères e será aumentada em incrementos de 4 miliampères a cada dois ensaios.

Este procedimento de introdução gradual permite que uma rata se acostume ao estímulo de choque. A partir do oitavo ensaio, a intensidade do choque é mantida em 1,6 miliampères durante esta sessão e todas as sessões subsequentes. Um computador separado opera um osciloscópio digital de quatro canais, o que nos permite realizar diagnósticos de sinal em tempo real.

Observe o piscar de olhos emitido pelo rato na caixa um. O osciloscópio também indica que o sinal de EMG de linha de base é relativamente limpo, com baixo ruído. As webcams nos permitem monitorar cada rato também.

Esta é uma captura de tela do software blink na versão 4.0 que mostra uma época de ensaio com duração de 1400 milissegundos. Nos primeiros 280 milissegundos, nenhum estímulo é apresentado para obter uma medida da atividade EMG de linha de base. A linha amarela indica o limite em que qualquer resposta EMG que exceda 4 volts acima do valor médio de linha de base pré-CS será considerada uma resposta de piscar de olhos.

O estímulo condicionado de tom com 85 decibéis é apresentado no ponto de 280 milissegundos. O tom permanece ativo por 380 milissegundos, o que corresponde ao ponto de 660 milissegundos. Após ser desligado, há um intervalo de 500 milissegundos no qual nenhum estímulo é apresentado. Esse período é denominado período de traço, no qual a rata deve resolver o desligamento do CS (estímulo condicionado) de tom com o início do US (estímulo incondicionado) de choque, ainda a ser entregue no marco de 1160 milissegundos.

O estímulo aversivo de choque dura 100 milissegundos. Naturalmente, o estímulo aversivo de choque provoca uma resposta defensiva de piscar conhecida como resposta incondicionada, ou RI, que é medida em uma janela de tempo de 140 milissegundos. Uma sessão de treinamento consiste em 100 ensaios.

Existem 90 ensaios nos quais o CS e o US são pareados e, a cada dez ensaios, apenas o CS é apresentado. Há 10 ensaios com apenas o CS por sessão. Esses ensaios permitem investigar se houve ou não aprendizado da associação entre CS e US.

Na forma de respostas condicionadas, ou RCs, que se expressam quando o estímulo aversivo (US) não está presente. O intervalo entre ensaios é em média de 30 segundos, de modo que o início de cada ensaio não seja previsível. Em qualquer ensaio determinado, uma rata pode piscar em qualquer momento e seu EMG será registrado pelo software.

Qualquer piscada discreta que exceda a linha de limiar será considerada uma resposta em uma das quatro categorias, com base no momento em que ocorre e na época do ensaio. Se a rata piscar durante os primeiros 80 milissegundos após o início do tom (CS), a resposta é considerada uma resposta de sobressalto ou SR. Esta é uma resposta não associativa que indica o desempenho sensorimotor, mas não o aprendizado da associação entre CS e US em si. Se ela piscar após o período de SR, mas antes da aplicação do choque (US), então emitiu uma resposta condicionada.

Como mencionado anteriormente, a RC é a medida principal da aprendizagem associativa. Não se espera que a RC se desenvolva nas fases iniciais do treinamento, mas à medida que o treinamento progride por muitos ensaios e sessões, esses tipos de respostas tornam-se mais frequentes, com maior amplitude e podem apresentar um melhor ajuste temporal. Dividimos as RCs em dois tipos: RCs totais e RCs adaptativas.

Os RCs totais refletem a capacidade geral de aprendizado, enquanto os RCs adaptativos refletem a habilidade do animal de sincronizar bem seu piscar. Imediatamente antes do início do choque, como forma de se preparar, o período de RC adaptativo ocorre 200 milissegundos antes do início do estímulo incondicionado (US). Em mamíferos com hipocampo intacto, a expressão dos RCs adaptativos reflete um envolvimento elevado do hipocampo no acerto temporal do piscar em relação à apresentação dos dois estímulos.

Por sua própria natureza, o condicionamento clássico do piscar de olhos em traço é muito mais difícil de adquirir do que o condicionamento clássico do piscar de olhos em atraso, no qual o CS (estímulo condicionado) de tom e o US (estímulo incondicionado) de choque se sobrepõem no tempo. Embora a expressão das RCs possa variar de sujeito para sujeito e possa ser severamente afetada por perturbações em circuitos cerebrais específicos, espera-se que a UR seja emitida em todos os ensaios pareados CS-US. Assim, esta medida reflete o desempenho sensorimotor e, como as respostas de sobressalto, não indicam propriamente a aprendizagem da associação CS-US.

Nos próximos clipes de vídeo, você verá a configuração do software e o início do treinamento de piscar de olhos. O software de piscar é ativado e os dois arquivos relevantes são carregados. Um arquivo de rato contendo os dados do sujeito e o arquivo de condicionamento de piscar de olhos com intervalo.

O programa é configurado previamente até o início do treinamento. Quando o treinamento começa, observe que há um cronômetro no canto inferior direito da tela que faz a contagem regressiva para o próximo ensaio. Abaixo, há uma gravação em vídeo ao vivo da sessão um, ensaio 15, na qual uma UR é emitida, mas ainda não se desenvolveram CRs.

Aqui está uma reprodução com um terço da velocidade. Na seguinte série de clipes, você verá telas do mesmo rato controle não entubado enquanto ele progride por seis sessões de treinamento. Eventualmente, ele emite tanto RCs totais quanto RCs adaptativos.

Aqui está um clipe de vídeo ao vivo da sessão seis, tentativa 96, na qual são emitidos dois piscar de olhos, sendo um uma RC adaptativa e o outro um UR. Aqui está uma reprodução com um terço da velocidade. Neste último clipe, você verá um vídeo ao vivo de uma rata intoxicada com álcool em sua última tentativa da sessão seis, um ensaio com apenas o EC; mesmo após 600 tentativas de treinamento, ela não emite uma RC adaptativa de forma confiável. Após a coleta dos dados, eles são analisados em busca de tentativas ruins, compostas por artefatos de ruído elevado e atividade de EMG na linha de base anterior ao EC incomum, utilizando um algoritmo interno de detecção de valores discrepantes.

Ensaios adequados que são mantidos são posteriormente analisados quanto aos SRs, URs, CRs totais e CRs adaptativos em relação à porcentagem de respostas, amplitude, latência e outras medidas críticas. Os valores médios de CRs adaptativos ao longo de seis sessões de treinamento são apresentados neste primeiro conjunto de resultados. Tanto a porcentagem quanto as medidas de amplitude foram estatisticamente significativas entre o grupo com álcool por intubação e os dois grupos-controle da sessão dois até a sessão seis.

Isso indica que a frequência e a intensidade das RCs adaptativas foram prejudicadas em ratos expostos ao álcool durante o desenvolvimento inicial. As respostas incondicionadas médias são mostradas neste segundo conjunto de resultados. As medidas de frequência e amplitude não diferiram estatisticamente entre nenhum dos grupos.

Esses resultados indicam que a exposição precoce ao álcool não prejudicou a capacidade dos ratos de piscar em resposta ao estímulo incondicionado, mas que o prejuízo que exibiram foi devido à incapacidade de associar adequadamente o EC e o EI durante a aquisição. Neste experimento, examinamos a relação entre cérebro e comportamento determinando se a exposição ao álcool durante o desenvolvimento, administrada de forma semelhante a uma bebedeira, afeta o hipocampo, conforme refletido por déficits na condicionamento clássico de piscar com intervalo. De fato, o condicionamento clássico de piscar é uma ferramenta útil para avaliar as consequências neurocomportamentais associadas à exposição ao álcool durante o desenvolvimento cerebral.

É muito versátil, pois, ao alterar os parâmetros do estímulo ou os requisitos de aprendizado associativo, também é possível avaliar a integridade funcional de diferentes sistemas cerebrais fora do hipocampo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão das complexidades envolvidas na administração de álcool a filhotes de ratos neonatos, implantação de eletrodos e realização do procedimento de teste do reflexo palpebral. Agradecemos por assistir a este vídeo.