O uso do condicionamento de rastreamento Eyeblink clássico para avaliar disfunção Hippocampal em um modelo do rato de transtornos do espectro do álcool Fetal

O objetivo geral deste experimento é demonstrar como o uso do condicionamento clássico de piscar de olhos, uma forma de aprendizado associativo, pode ajudar a detectar a disfunção do hipocampo em um modelo de rato de distúrbios do espectro alcoólico fetal. Filhotes de ratos neonatais são desafiados com uma alta dose de álcool, uma concentração de 11,9% de volume de álcool em uma compulsão. Durante o equivalente a um terceiro trimestre em humanos no que diz respeito ao crescimento do cérebro.

Esse padrão de exposição e dose ao álcool são fatores-chave na produção de déficits cerebrais ao longo da vida, imitando casos humanos de FASD. Uma importante região do cérebro que é comprometida pela exposição precoce ao álcool é o hipocampo. Depois que os ratos crescem como adultos, eles são examinados quanto à disfunção do hipocampo usando o condicionamento clássico do piscar de olhos.

Esta é uma forma de aprendizagem associativa de alta ordem que depende da integridade do hipocampo. Durante os dias pós-natais de quatro a nove, os filhotes de ratos são pesados todas as manhãs e seus pesos são registrados. Os volumes de alimentação são então obtidos a partir de uma tabela pré-impressa com base no peso corporal.

Uma solução de álcool de volume de 11,9% é administrada aos filhotes de ratos em duas mamadas separadas por duas horas. A dose diária total de álcool é de 5,25 gramas por quilograma por dia. Este paradigma de exposição à compulsão fornece 0278 mils de álcool por grama de peso corporal por alimentação em solução láctea.

Extraia o leite contendo álcool usando uma seringa estéril de um mililitro. Em seguida, empurre o excesso de solução para obter a quantidade exata necessária. Mergulhe a ponta do tubo PE-10 em óleo de milho fresco.

Isso facilita a inserção. Meça o comprimento do tubo PE-10 da boca do filhote até o estômago. Se necessário, ajuste a rolha PE-50 para atuar como um guia visual para o ponto de parada.

Insira cuidadosamente o tubo PE-10 na boca do filhote. Você normalmente encontrará alguma resistência quando a ponta encontrar a garganta. Manobre o tubo até que a ponta se dobre na entrada do esôfago.

Tente não deixar o tubo escorregar para trás, pois pode ficar escorregadio com o óleo. Desça pelo esôfago e, à medida que a ponta passa pelo esfíncter gastroesofágico, ela entrará no estômago. Pare neste ponto, estabilize a bomba e entregue a solução.

Isso deve ser feito em um ritmo lento. Remova cuidadosamente o tubo PE-10 e examine o filhote quanto a retrolavagem de solução, sangue ou lesões físicas. Substitua o filhote por seus companheiros de ninhada, se estiver tudo bem.

Consulte o protocolo escrito e a lista de materiais para instrumentos específicos usados no procedimento de cirurgia das pálpebras. Esterilize o campo cirúrgico com um desinfetante aprovado e autoclave todos os instrumentos e suprimentos cirúrgicos com antecedência. Depois de induzir anestesia adequada no rato com isoflurano, raspe a cabeça com um aparador de pelos, expondo uma quantidade suficiente de pele para o local da incisão e a pálpebra esquerda.

Sua pele é esterilizada por meio da realização de três esfoliações alternadas envolvendo álcool isopropílico 70% e iodopovidona. Siga o procedimento padrão para prender o rato ao dispositivo estereotáxico com as barras auriculares. Prossiga com a cirurgia quando o rato apresentar plano anestésico adequado.

Use a lâmina do bisturi para fazer uma incisão anterior posterior na linha média. Esta incisão deve expor área suficiente anterior aos olhos e ligeiramente posterior à linha sutoral lambda. Use a lâmina do bisturi para raspar o periósteo no topo do crânio, com cuidado, para não causar sangramento excessivo.

Limpe o excesso de tecido conjuntivo e sangue com um cotonete e enxágue a área com solução salina estéril entre os arranhões. Faça um furo começando diretamente atrás da sutura coronal em um osso parietal. Remova qualquer sangue e detritos ósseos com um cotonete.

Use uma pinça de lasca para segurar um parafuso 0 80. Use uma chave de fenda de joalheiro para prender o parafuso ao orifício, aperte o parafuso apenas o suficiente sem danificar o tecido cerebral cortical, geralmente três a quatro voltas completas. Siga o mesmo procedimento para prender os parafusos restantes.

Deve haver dois parafusos fixados bilateralmente atrás da sutura coronal e um no osso parietal direito, anterior à sutura lambda. Segure a pele superior no local da incisão do olho esquerdo com a pinça de curativo de quatro polegadas e direcione a pinça de curativo de três polegadas para o canto deste olho. Pegue uma agulha de calibre 26 de 3/8 de polegada e insira-a no canto da pálpebra.

Gire a agulha de forma que o lado chanfrado fique voltado para cima. Insira a segunda agulha no meio da pálpebra. Use uma pinça fina para segurar um fio 3T e insira-o em uma das agulhas.

Você não precisa inseri-lo totalmente. Siga o mesmo procedimento para o segundo fio 3T. Segure ambas as agulhas com uma mão enquanto segura o estágio principal com a outra mão.

Em um movimento contínuo, puxe as agulhas para longe da pálpebra enquanto guia o estágio da cabeça na mesma direção. Enquanto segura o cabeçote EMG stage com uma mão, use a pinça de curativo de três polegadas com a outra mão para enrolar o fio 10T em torno de um ou ambos os parafusos no lado direito. Guarde este fio para que não fique saliente dos parafusos.

O estágio principal do EMG deve ser centralizado antes de passar para a próxima etapa. Use a pinça de curativo de quatro polegadas para criar uma pequena bolsa, separando a pele, ou seja, a fáscia superficial do músculo temporal. Com o bolso criado, use a tesoura de íris para cortar mais tecido conjuntivo, trabalhando em direção ao canto do olho esquerdo.

Tenha cuidado para não entrar muito fundo ou cortar vasos sanguíneos. Pegue um eletrodo bipolar e molde o fio condutor para que eles possam ser encaixados ao longo da curvatura do músculo temporal. As duas pontas estarão situadas posteriormente ao olho esquerdo e a extremidade inferior do eletrodo bipolar estará situada diretamente no topo do crânio.

Misture o pó Ortho Jet em componentes líquidos para obter uma consistência líquida. Aplique a pasta com uma micro espátula em todo o local da incisão. Tenha cuidado para não deixar cair nenhuma pasta nos olhos do rato e mantenha-a contida.

Deixe o Ortho Jet chegar a um estado semi-seco e, em seguida, use a pinça de lasca para remover o excesso de acrílico no estágio da cabeça de EMG. E os fios do eletrodo bipolar. Corte o excesso de fio 3T, deixando alguns centímetros para trabalhar.

Remova cuidadosamente a blindagem de PTFE de cada fio 3T usando a pinça de microdissecação. Isso permite que eles entrem em contato com o músculo orbicular do olho. Use a pinça de microdissecação para criar ganchos em cada extremidade dos fios 3T.

Corte o excesso de fio, tomando cuidado para não cortar tanto que o fio restante se retraia de volta para a pálpebra. O cabeamento é feito internamente. O plugue bipolar branco é conectado primeiro, e isso permite a entrega do estímulo de choque dos EUA.

O plugue laranja do estágio da cabeça EMG é conectado posteriormente. Ele registra a atividade eletromiográfica à medida que o rato pisca. Ambos os plugues levam a um comutador redondo na parte superior do braço que mantém a continuidade do sinal à medida que o rato se move livremente.

O isolador de estímulo é ligado e as verificações finais de hardware são feitas. Isso inclui ajustar a linha de base EMG para um nível que seja visível na tela do computador. Na primeira sessão, a intensidade do choque é primeiro ajustada para 4 miliamperes e será aumentada em unidades de 4 mil amperes a cada duas tentativas.

Este procedimento de introdução gradual permite que um rato se acostume ao estímulo de choque. Na oitava tentativa, a intensidade do choque é mantida em 1,6 miliamperes durante esta sessão e todas as sessões subsequentes. Um computador separado executa um osciloscópio digital de quatro canais que nos permite realizar diagnósticos de sinal em tempo real.

Observe o piscar de olhos que foi emitido pelo rato na caixa um. O osciloscópio também indica que o sinal EMG de linha de base é relativamente limpo com baixo ruído. As webcams também nos permitem monitorar cada rato.

Esta é uma captura de tela da versão 4.0 do software blink que mostra uma época de teste com duração de 1400 milissegundos. Nos primeiros 280 milissegundos, nenhum estímulo é apresentado para obter uma medida da atividade EMG basal. A linha amarela indica a linha limite na qual qualquer resposta EMG que exceda 4 volts acima do valor médio da linha de base pré-CS será elegível como uma resposta de piscar de olhos.

O estímulo da condição de tom de 85 decibéis é entregue no ponto de tempo de 280 milissegundos. O tom permanece ligado por 380 milissegundos, o que corresponde ao ponto de tempo de 660 milissegundos. Depois de desligar, há um intervalo de 500 milissegundos em que nenhum estímulo é apresentado. Isso é chamado de período de rastreamento, onde o rato deve resolver o deslocamento do tom CS com o início do choque US, ainda a ser entregue na marca de 1160 milissegundos.

O choque dos EUA dura 100 milissegundos. Naturalmente, o choque US provoca uma resposta defensiva conhecida como resposta incondicionada, ou UR, que é medida em uma janela de tempo de 140 milissegundos. Uma sessão de treinamento consiste em 100 tentativas.

Existem 90 tentativas em que o CS e o US são pareados e a cada décimo tentativa, apenas o CS é entregue. Existem 10 ensaios apenas de CS por sessão. Esses ensaios nos permitem investigar se aprendemos ou não sobre a associação CS US.

Na forma de respostas de condição, ou CR's, é expresso quando o choque US não está presente. O intervalo entre tentativas é calculado em média de 30 segundos, de modo que o início de cada tentativa não é previsível. Em qualquer teste, um rato pode piscar a qualquer momento e seu EMG será registrado pelo software.

Qualquer piscar de olhos discreto que exceda a linha limite será considerado uma resposta em uma das quatro categorias com base em quando ocorrer e na época do teste. Se o rato piscar durante os primeiros 80 milissegundos após o início do tom CS, a resposta é considerada uma resposta de sobressalto ou SR. Esta é uma resposta não associativa que é indicativa do desempenho sensório-motor, mas não do aprendizado da associação de US da EC em si. Se ele piscar após o período de SR, mas antes que o choque US seja entregue, então ele emitiu uma resposta condicionada.

Como mencionado anteriormente, o CR é a principal medida de aprendizagem associativa. Não se espera que o RC se desenvolva durante as fases iniciais do treinamento, mas à medida que o treinamento progride em muitas tentativas e sessões, esses tipos de respostas se tornam mais frequentes, mais amplos e podem ser mais oportunos. Particionamos os CRs em dois tipos, CRs totais e CRs adaptativos.

Os CRs totais refletem a capacidade geral de aprendizado, enquanto os CRs adaptativos refletem a capacidade do animal de cronometrar bem o piscar de olhos. Imediatamente antes do início do choque, como forma de se preparar, o período de RC adaptativo é de 200 milissegundos antes do início do choque US. Em mamíferos com hipocampo intacto, a expressão de CRs adaptativos reflete o envolvimento do hipocampo de alto nível no tempo adequado do piscar em relação à entrega dos dois estímulos.

Por sua própria natureza, o condicionamento clássico do piscar de olhos é muito mais difícil de adquirir do que o condicionamento clássico do piscar de olhos atrasado, onde o tom CS e o choque US se sobrepõem no tempo. Embora a expressão de CRs possa variar de sujeito para sujeito e possa ser severamente afetada por desafios a circuitos cerebrais discretos, espera-se que o UR seja emitido durante cada teste de US CS pareado. Como tal, essa medida reflete o desempenho sensório-motor e, como as respostas de sobressalto, não são indicativas de aprendizagem da associação de US CS em si.

Na série de videoclipes a seguir, você verá a configuração do software e o início do treinamento de piscar de olhos. O software blink é ativado e os dois arquivos pertinentes são recrutados. Um arquivo de rato contendo dados do sujeito e o arquivo de condicionamento de piscar de olhos.

O programa é implementado até o início do treinamento. Quando o treinamento começa, observe que há um cronômetro na parte inferior direita da tela que faz a contagem regressiva para a próxima tentativa. Aqui está uma gravação de vídeo ao vivo da primeira sessão, teste 15, onde um UR é emitido, mas nenhum CR foi desenvolvido ainda.

Aqui está um replay em um terço da velocidade. Na série de clipes a seguir, você verá capturas de tela do mesmo rato de controle não intubado à medida que ele avança em seis sessões de treinamento. Eventualmente, emite CRs totais e CRs adaptativos.

Aqui está um videoclipe ao vivo da sessão seis, teste 96, onde dois piscar de olhos são emitidos, um CR adaptativo e o outro um UR. Aqui está um replay em um terço da velocidade. Neste clipe final, você verá um vídeo ao vivo de um rato intubado com álcool em seu último teste da sessão seis, um teste apenas de CS, mesmo após 600 tentativas de treinamento, ele não emite um CR adaptativo de forma confiável. Depois que os dados são coletados, eles são rastreados para testes ruins, consistindo em artefatos de alto ruído e atividade EMG de linha de base pré-CS incomum usando um algoritmo de erro embutido para detectar outliers.

Bons ensaios que são mantidos são analisados posteriormente para SRs, URs, CRs totais e CRs adaptativos em relação à porcentagem de respostas, amplitude, latência e outras medidas críticas. As CRs adaptativas médias em seis sessões de treinamento são mostradas neste primeiro conjunto de resultados. Tanto a porcentagem quanto a amplitude foram estatisticamente significativas entre o grupo intubado com álcool e os dois grupos controle da segunda à sexta sessão.

Isso indica que a frequência e a força dos CRs adaptativos foram prejudicadas em ratos expostos ao álcool durante o desenvolvimento inicial. As respostas médias incondicionadas são mostradas neste segundo conjunto de resultados. Tanto a frequência quanto a amplitude não foram estatisticamente diferentes entre nenhum dos grupos.

Esses resultados indicam que a exposição precoce ao álcool não prejudicou a capacidade dos ratos de piscar ao estímulo incondicionado, mas que o comprometimento que eles exibiram foi devido a uma falha na associação adequada do EC e do US durante a aquisição. Neste experimento, examinamos a relação do comportamento cerebral, determinando se a exposição ao álcool no desenvolvimento que é entregue de forma compulsiva afeta ou não o hipocampo, conforme refletido em déficits e traços de condicionamento clássico de piscar de olhos. De fato, o condicionamento clássico do piscar de olhos é uma ferramenta útil para avaliar as consequências neurocomportamentais associadas à exposição ao álcool durante o desenvolvimento do cérebro.

É muito versátil, pois alterando os parâmetros de estímulo ou os requisitos de aprendizagem associativa, a integridade funcional de diferentes sistemas cerebrais fora do hipocampo também pode ser avaliada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das complexidades envolvidas na administração de álcool a filhotes de ratos neonatais, implante de eletrodos e realização do procedimento de teste de piscar de olhos. Agradecemos por assistir a este vídeo.