Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

O objetivo geral deste experimento microfluídico é medir simultaneamente a deposição de plaquetas na formação de fibrina em uma superfície reativa sob condições de fluxo usando microscopia de vídeo em tempo real. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina transfusional sobre os efeitos da preparação de concentrado de plaquetas na natureza pró-coagulante do sangue transfundido. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita a análise simultânea da função plaquetária e da coagulação no fluxo, permitindo que a interação entre os dois processos seja examinada.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a procoagulação plaquetária induzida pela via de contato, ele também pode ser aplicado ao estudo da via extrínseca por revestimento com fator tecidual lipídico. Demonstrando o procedimento estará Rosalie Devloo, uma técnica do laboratório. Comece a configuração da câmara de fluxo microfluídico pipetando 0,8 microlitros de colágeno recém-reconstituído em cinco sextos do comprimento de cada canal em uma extremidade de um novo biochip microfluídico descartável com oito canais paralelos retos e rotulando esta extremidade do microchip como a saída.

Incube o biochip a quatro graus Celsius por pelo menos quatro horas em um recipiente umidificado e lacrado. No final da incubação, preencha os canais codificados em um número igual de canais em forma de Y em um biochip de mistura com tampão de bloqueio. Retorne o microchip ao recipiente por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, coloque um alfinete em uma extremidade de dois pedaços de tubo de oito centímetros de comprimento e um de dois centímetros de comprimento e em ambas as extremidades de um pedaço de tubo de 46 centímetros de comprimento para cada canal em uso. Em seguida, use o software Nanopump para enxaguar todos os fluidos da bomba na tubulação conectada com água destilada e uma seringa no pino do conector da seringa para encher todos os outros tubos com tampão de bloqueio. Em seguida, fixe o biochip codificado no estágio do microscópio automatizado usando um macaco de tesoura de laboratório para fixar o biochip de mistura na mesma altura do estágio do microscópio.

Use os pinos nos tubos de oito centímetros para fixar esses pedaços de tubo na entrada do biochip de mistura e coloque a extremidade livre de cada tubo em um frasco de solução salina tamponada com HEPES. Agora, conecte o biochip codificado ao biochip de mistura com o pedaço de tubo de 46 centímetros em uma linha flexível, mas reta. Conecte um pino conector da seringa à tubulação compatível com luer da bomba de enxágue.

Em seguida, conecte o pino à extremidade livre do pedaço de tubo de dois centímetros e fixe a outra extremidade do tubo na saída do biochip codificado. Em seguida, enxágue todos os tubos e canais com um mililitro de HBS. Para preparar as bombas de perfusão, abra o software Microfluidic Perfusion Pump Driver e clique duas vezes no ícone de seringas para inicializar as bombas.

Selecione o tipo de seringa que será usada e desconecte a bomba de enxágue e a tubulação de dois centímetros conectada a ela. Conecte o tubo de dois centímetros desconectado com seu pino conector de seringa à trava luer de um pedaço de tubo de resíduos de paredes espessas e use uma seringa para encher o tubo de paredes espessas com solução de pepsina padrão. Em seguida, prenda a extremidade aberta do tubo de paredes grossas com uma braçadeira Kocher.

Prenda a tubulação na saída do biochip codificado. Desconecte os dois tubos da câmara de fluxo de mistura e descarte os recipientes de HBS. Depois de obter a amostra de sangue em recipientes evacuados de citrato de sódio, centrifugue os tubos e transfira o plasma rico em plaquetas para um novo tubo de centrifugação.

Gire os recipientes com plasma rico em plaquetas novamente. Em seguida, transfira o plasma sobrenadante pobre em plaquetas para um tubo de centrífuga diferente. Em seguida, use uma agulha de calibre 21 para perfurar o fundo dos recipientes de citrato de sódio para permitir que os glóbulos vermelhos concentrados pingem em um novo tubo cônico.

Quando todos os concentrados de glóbulos vermelhos tiverem sido coletados, reconstitua suavemente o sangue combinando concentrado de glóbulos vermelhos separados com plasma pobre em plaquetas e adicione plaquetas de banco de sangue preparadas para transfusão para obter amostras com um hematócrito de 40% e 2,5 vezes 10 à quinta concentração de plaquetas por microlitro para um volume final de 2,5 mililitros e obter um hemograma completo. Em seguida, adicione 13 microlitros de fibrinogênio marcado com fluoróforo a um tubo cônico de poliestireno. Seguido por um mililitro de sangue reconstituído.

Misture outro mililitro de sangue com dois microlitros de corante plaquetário fluorescente e adicione as amostras de sangue marcadas. Em seguida, inverta suavemente as amostras de sangue misturadas e incube as células por 10 minutos a 37 graus Celsius. Antes de iniciar o ensaio de perfusão, concentre a óptica do microscópio nas fibras colágenas aderidas ao fundo do primeiro canal.

Usando o software de aquisição, defina uma região de interesse no canal selecionado. Carregue um mililitro de tampão de coagulação pré-aquecido em uma seringa de um mililitro e monte a seringa na bomba de perfusão. Após uma segunda inversão suave, coloque o sangue em uma seringa de dois mililitros e monte a seringa na bomba de perfusão.

Em seguida, use um pino conector de seringa para conectar ambas as seringas a um pedaço de tubo de oito centímetros e prepare os conectores e tubos a 400 microlitros por minuto. Quando todo o tubo estiver cheio de tampão de coagulação ou sangue, prenda a outra extremidade de ambos os tubos nas pernas divididas do canal em forma de Y no biochip de mistura. Em seguida, remova a pinça de Kocher na saída do tubo de resíduos e inicie a perfusão a 4,4 microlitros por minuto para o tampão de coagulação e 44 microlitros por minuto para o sangue reconstituído.

Grave imagens a cada 10 segundos por 30 minutos em tempo real, encerrando as bombas e a aquisição de imagens após 30 minutos ou quando o sinal ficar saturado. Em seguida, descarte todos os tubos e seringas como resíduos de risco biológico. Este vídeo fornece um excelente exemplo do acúmulo de trombos plaquetários e deposição de fibrina.

No início da perfusão, as plaquetas aderiram à superfície reativa, resultando em um aumento constante na fluorescência verde registrada. Durante esta fase de adesão, há pouca fluorescência violeta indicando que a fibrina é apenas marginalmente formada. Após o início da coagulação, a violenta fibrina fluorescente se deposita rapidamente com a fluorescência verde plaquetária se acumulando aproximadamente na mesma taxa.

Um momento de início da coagulação pode, portanto, ser extrapolado como um determinante do potencial pró-coagulante plaquetário. A adição de inibidor de tripsina de milho ao sangue reconstituído não afeta a adesão plaquetária, mas a coagulação não se inicia durante todo o experimento de perfusão. Ao aumentar o número de plaquetas em uma amostra reconstituída, a taxa de adesão, acúmulo e coagulação aumenta linearmente.

O momento de início é significativamente encurtado pelo aumento da concentração de plaquetas, sugerindo que um número limite de plaquetas depositadas ativadas é necessário para desencadear a coagulação. Além disso, em uma análise pareada de canais revestidos apenas com colágeno, ou em combinação com fator tecidual lipídico recombinante, o início da coagulação é significativamente mais rápido, embora nem a taxa geral de coagulação, nem o acúmulo de plaquetas, sejam diferentes entre as condições. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de câmara de fluxo microfluídico com sangue reconstituído duplamente marcado para a análise simultânea da função plaquetária e coagulação.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da medicina transfusional explorarem as interações entre plaquetas e coagulação sob fluxo. Neste vídeo, nos concentramos em demonstrar um experimento padronizado. Mas mudanças no revestimento da superfície, tensões do escudo ou concentração de cálcio podem ser introduzidas para responder a questões específicas de pesquisa de interesse.