Método agitador magnético para Detecção de Trichinella As larvas em amostras de músculo

O objetivo geral deste método de diagnóstico é identificar carne, ou produtos à base de carne, infestados com o parasita zoonótico de origem alimentar Trichinella. Este método é o padrão ouro para a detecção direta de larvas de triquinas na carne. A principal vantagem da técnica é que ela é de fácil execução e não requer equipamentos especializados.

Geralmente, indivíduos novos nesse método podem ter dificuldades, pois os controles internos não podem ser usados e o gerenciamento de qualidade rigoroso deve ser aplicado durante todo o teste. Demonstrando o procedimento estará Nora Thaben, uma técnica do meu laboratório. Olá! Para preparar uma amostra de músculo para digestão, coloque 100 gramas da amostra em um liquidificador ou moedor.

E adicione dois mililitros de água pré-aquecida para facilitar a mistura. Bata na velocidade máxima por dois a três segundos. Antes da segunda mistura, abra o liquidificador e transfira qualquer amostra de músculo na parte superior da margem da borda da tigela de mistura para a parte inferior.

Repita a mistura e continue misturando com rajadas de dois a três segundos até que não haja pedaços visíveis de carne. Antes de iniciar este procedimento, prepare o fluido de digestão em um béquer de três litros, conforme descrito no protocolo de texto. Transfira um litro do fluido de digestão pré-aquecido para um frasco.

Transfira a carne moída para o copo. E use uma colher ou um garfo para disseminar a carne no fluido de digestão. Lave bem a tigela, a tampa, as lâminas e o garfo do liquidificador com o fluido de digestão restante.

Coloque o copo em uma placa quente para manter uma temperatura constante de 44 a 46 graus Celsius enquanto monitora com um termômetro. Em seguida, cubra o copo com papel alumínio. Mexa o fluido de digestão por 30 minutos para criar um vórtice profundo sem respingar até que as partículas de carne desapareçam.

Após a digestão da amostra de músculo, o fluido de digestão deve ser filtrado e a quantidade de tecido não digerido determinada. Ajuste a balança para zero, pese uma peneira limpa de 180 micrômetros e anote seu peso. Verifique se o funil de decantação está nivelado verticalmente.

Para permitir uma boa sedimentação das larvas, a largura do funil de vidro de separação não deve ser superior a 55% do seu comprimento. Despeje cuidadosamente o fluido de digestão pela peneira, no funil de vidro de separação, evitando qualquer transbordamento. Para evitar a perda de sensibilidade, enxágue bem o copo de vidro e a peneira com aproximadamente 200 mililitros de água da torneira.

E transfira a água de enxágue para o funil de vidro de separação. Levante a peneira e enxágue bem a área sob a peneira usando um frasco de aperto. A água de enxágue também deve ser coletada em um funil de vidro de separação.

Deixar o crivo na ampola de decantação para secar durante todo o processo de sedimentação. Para iniciar o procedimento de sedimentação, manter o líquido de digestão filtrado num funil de separação durante 30 minutos para que as larvas de triquinas se depositem no fundo do funil. Quando a sedimentação estiver completa, abra completamente a torneira do funil de decantação para deixar pelo menos 20 mililitros do fluido de digestão escorrerem rapidamente para um cilindro medidor.

Em seguida, abra totalmente a torneira na direção oposta para permitir a passagem de 10 mililitros de fluido de digestão. Por fim, abra a torneira na direção oposta para que mais 10 mililitros passem para o cilindro medidor. Deixe os 40 mililitros de fluido de digestão no cilindro por 10 minutos para permitir que as larvas sedimentem.

Prossiga para determinar a quantidade de tecidos não digeridos. Levantar o crivo da ampola de sedimentação e secar o crivo com uma toalha de papel. Subtraia o peso da peneira antes da filtração do peso da peneira com tecidos não digeridos.

O processo de digestão é considerado satisfatório se não mais de 5% do peso inicial da amostra permanecer na peneira. Se a quantidade de tecido não digerido exceder 5%, repita a digestão usando amostras de músculo fresco. Se não estiverem disponíveis amostras frescas, digerir novamente o material restante.

Depois que o fluido de digestão estiver no cilindro por 10 minutos, remova 30 mililitros de sobrenadante por sucção com uma pipeta sem perturbar o sedimento de 10 mililitros. Para reduzir a quantidade de fibras de tecido na amostra, adicione 30 mililitros de água da torneira ao sedimento e deixe por mais 10 minutos. Repita esta lavagem até que o líquido esteja límpido.

Quando o líquido estiver límpido, remova o sobrenadante e transfira os 10 mililitros de sedimento lavado para uma placa de Petri quadriculada. Enxágue o cilindro com 10 mililitros de água da torneira e adicione a água ao sedimento lavado. Imediatamente após as etapas de lavagem, examinar as amostras com um triquinoscópio ou um microscópio estereoscópico, com uma fonte de luz transmitida por subestágios de intensidade ajustável.

Usando uma ampliação de 15 a 20x, examine a placa de Petri sistematicamente, grade por grade. Se nenhuma estrutura suspeita for encontrada, mova suavemente o fluido no prato de forma circular para permitir que quaisquer larvas de Trichinella, que foram potencialmente esquecidas, se acumulem no centro do prato. Repita o exame.

Se uma estrutura suspeita for encontrada, aumente a ampliação para 40 a 100x. Remova as larvas de triquinas do prato com uma pipeta e colete em um recipiente. Depois de examinar toda a placa, repita o procedimento de exame microscópico, começando com a agitação suave da placa.

Repita o procedimento pelo menos três vezes. Ou até que não sejam encontradas mais larvas. Determine o número de larvas por grama de tecido muscular.

Se houver muitas larvas presentes no fluido de digestão para determinar o número de larvas de forma confiável, retorne o fluido contendo as larvas ao cilindro medidor. Lave o prato com água da torneira de um frasco de lavagem e deixe as larvas assentarem no fundo. Após um tempo de sedimentação de 10 minutos, reduza o fluido de digestão para um volume definido, transferindo as larvas do fundo do cilindro medidor em incrementos de um mililitro para um novo cilindro.

Suspenda as larvas homogeneamente nos 10 mililitros por agitação vigorosa. Durante o movimento de agitação, pipetar 12 gotas de 20 microlitros de suspensão larval em uma placa de Petri. Examine cada gota de 20 microlitros por microscopia e calcule o número total de larvas conforme descrito no protocolo de texto.

Antes do exame microscópico das larvas de Trichinella, é importante lavar cada amostra o suficiente para remover os detritos que possam impedir a identificação das larvas. As larvas de triquinela têm 0,7 a 1,5 milímetros de comprimento e aproximadamente 0,3 milímetros de largura. O esôfago é estreito com uma extremidade ligeiramente arredondada.

O esticossomo é uma estrutura na metade anterior da cavidade corporal, comprometida por um tubo longo e delgado cercado por uma fileira de 45 a 55 células grandes. O reto também é arredondado sem projeções ou apêndices. Após a digestão, a forma das larvas musculares infecciosas pode variar, dificultando a identificação.

As formas típicas incluem larvas em movimento bem enroladas e levemente enroladas, ou em forma de C, ou larvas completamente desenroladas. Outras estruturas além das larvas de Trichinella podem ser encontradas após a digestão muscular. Exemplos de achados incidentais de javalis incluem um pêlo semelhante a cerdas de uma minhoca, o trematódeo Alaria alata, uma fibra muscular, um nematóide do gênero Metastrongylus, fibra vegetal e larvas da lombriga Toxocara.

Uma vez dominada, a técnica pode ser feita em aproximadamente duas horas, se for feita corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar larvas de Trichinella na carne pelo método do agitador magnético. Levando em consideração os pontos críticos de controle mais importantes.