Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas
2 de março de 2017
O método aqui apresentado descreve um sistema de diferenciação -Ready escalável e boas práticas de fabrico (BPF) para gerar células de hepatócitos-like humanos a partir de células-tronco pluripotentes. Ele serve como um sistema eficaz e padronizado para gerar células de hepatócitos-like humanos para a pesquisa básica e aplicada fígado humano.
O objetivo geral deste protocolo é produzir células semelhantes a hepatócitos humanos a partir de células-tronco pluripotentes usando matrizes de laminina recombinante sob condições definidas. Este método permite ao usuário personalizar hepatócitos humanos funcionais para estudar a biologia do fígado no prato. A principal vantagem desta técnica é que sua natureza definida permite a produção em massa de hepatócitos com alto grau de reprodutibilidade experimental. Para iniciar o experimento, descongele 100 microgramas por mililitro de laminina-521 recombinante, ou LN-521, a quatro graus Celsius. Adicione um mililitro da solução de LN-521 de cinco microgramas por mililitro para revestir um poço de uma placa de seis poços e balance a placa para espalhá-la uniformemente no poço. Em seguida, incube as placas em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius 5% CO2 por pelo menos duas horas para uso urgente. Leve a placa revestida da incubadora para a capa de cultura de tecidos. Aspire cuidadosamente a solução de revestimento LN-521 sem danificar a superfície revestida. Em seguida, adicione imediatamente um mililitro de mTeSR pré-aquecido
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para gerar células semelhantes a hepatócitos humanos a partir de células-tronco pluripotentes utilizando matrizes de laminina recombinante. Ele fornece um sistema escalonável e pronto para as Boas Práticas de Fabricação (GMP) para a produção de hepatócitos funcionais destinados à pesquisa hepática.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Diferenciação celular
- Biologia de células-tronco
- Pesquisa hepática
Contexto
- Células semelhantes a hepatócitos humanos são cruciais para o estudo da biologia hepática.
- Células-tronco pluripotentes podem se diferenciar em diversos tipos celulares.
- Matrizes de laminina recombinante suportam a adesão e o crescimento celular.
- Métodos padronizados aumentam a reprodutibilidade na pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método econômico para a produção de células semelhantes a hepatócitos.
- Permitir a produção em larga escala de hepatócitos funcionais.
- Facilitar a pesquisa em biologia hepática e modelagem de doenças.
Métodos Utilizados
- Descongelamento e diluição da laminina-521 recombinante.
- Revestimento de placas de cultura celular com solução de laminina.
- Incubação das placas para promover a adesão celular.
- Adição de mTeSR pré-aquecido para cultura celular.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de células semelhantes a hepatócitos humanos.
- Alta reprodutibilidade na produção de células.
- Características funcionais de células semelhantes a hepatócitos confirmadas.
- Sistema escalonável adequado para diversas aplicações de pesquisa.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para a produção de hepatócitos.
- Ele apoia tanto a pesquisa básica quanto a aplicada em fígado.
- Estudos futuros podem aproveitar este sistema para testes de fármacos e modelagem de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Sistemas de diferenciação definidos reduzem a variabilidade entre lotes na produção de células semelhantes a hepatócitos, aumentando a reprodutibilidade em modelos hepáticos pré-clínicos. Processos escalonáveis e compatíveis com boas práticas de fabricação (GMP) garantem fornecimento consistente para testes de metabolismo e toxicidade de fármacos. Isso resolve um gargalo fundamental na transição de hepatócitos derivados de células-tronco para aplicações industriais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias hepáticas utilizando modelos celulares fisiologicamente relevantes e escalonáveis.
- Valor Operacional: Matrizes definidas de laminina minimizam a variabilidade, melhorando a consistência dos ensaios entre experimentos.
- Valor Preditivo: Alta reprodutibilidade apoia estudos confiáveis de engajamento de alvos e mecanismos de ação.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz células semelhantes a hepatócitos com função metabólica estável para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Condições definidas e livres de soro permitem padronização entre laboratórios e locais de produção.
- Escalabilidade: Compatível com linhagens de hPSC para pesquisa e com qualidade GMP, permitindo fornecimento escalável de células.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: As células exibem fenótipo e função semelhantes às de hepatócitos primários, melhorando a fidelidade do modelo da doença.
- Valor Operacional: O sistema definido reduz a variação entre lotes, apoiando estudos para habilitação de IND.
- Continuidade Translacional: Conecta a diferenciação de células-tronco à validação pré-clínica de terapêuticas direcionadas ao fígado.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se insere no continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer uma fonte escalonável de hepatócitos funcionais para aplicações posteriores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses em biologia hepática utilizando diferenciação definida e reprodutível.
- Triagem: Permite a produção padronizada de células semelhantes a hepatócitos para avaliação consistente de compostos.
- Análises: Gera resultados funcionais quantificáveis (por exemplo, albumina, ureia) para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Oferece continuidade desde a diferenciação até modelos pré-clínicos de doenças hepáticas e resposta a fármacos.
- Reutilização Empresarial: Plataforma definida e escalonável que apoia a reutilização entre projetos e locais, reduzindo a necessidade de reotimização.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: A confiança preditiva na função de hepatócitos reduz a ambiguidade mecanicista em ensaios relacionados ao fígado.
- Valor Operacional: Componentes definidos e processo livre de soro aumentam a reprodutibilidade e a escalabilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de prosseguir/não prosseguir ao reduzir a variabilidade biológica em dados pré-clínicos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de candidatos direcionados ao fígado por meio de sistemas de modelos confiáveis.
Considerações sobre a Implementação
- Experiência em protocolos de cultura e diferenciação de células-tronco.
- Acesso a matrizes de laminina recombinante e meios de diferenciação definidos.
- Padronização dos procedimentos de revestimento e incubação entre as equipes.
- Considerações sobre adaptação para diferentes linhagens de hPSC e formatos de ampliação.
- As limitações incluem a maturação funcional em comparação com hepatócitos primários, conforme observado na fonte.
