Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

O objetivo geral desta técnica microcirúrgica é injetar células tumorais colorretais na parede cecal para induzir tumores colorretais reprodutíveis e metastáticos em camundongos. Este método pode responder a questões-chave no campo da biologia de células tumorais circulantes, suas principais vantagens são os tumores altamente reprodutíveis e uniformes, permitindo uma previsão confiável do estágio e previsão de células tumorais circulantes. Comece usando uma pinça atraumática para exteriorizar cuidadosamente o ceco de um camundongo imunocomprometido de seis a oito semanas de idade.

Colocar a extremidade cega do ceco no abdômen de modo que a bolsa aponte cranialmente. Para a injeção intracecal, monte uma seringa padrão de um mililitro equipada com uma canella de calibre 30 e carregue-a com as células tumorais em uma bomba de microinjeção montada em um micromanipulador. Em seguida, use a pinça atraumática para segurar cuidadosamente a ponta do ceco e use uma segunda pinça, umedecida com solução salina morna para alisar suavemente o ceco com movimentos descendentes.

Agora mova o animal sob um microscópio cirúrgico binocular e com a canella diretamente paralela e acima do ceco, use duas pinças atraumáticas para esticar cuidadosamente o tecido em ambas as extremidades da extremidade exteriorizada do ceco. Puxe lentamente o ceco sobre a canela, tomando cuidado para não perfurar todo o cinturão da parede ou a serosa além do ponto inicial de penetração e coloque a canela acima dos vasos sanguíneos e sob a fina membrana translúcida dentro do cinturão da parede. Quando a canella estiver no lugar, use um pedal para injetar 20 microlitros de células em um período de 20 segundos.

Entre o fino revestimento translúcido da serosa, acima dos vasos sanguíneos intramurais e da muscular. Quando todas as células tiverem sido injetadas, remova cuidadosamente a canella e coloque uma troca seca sob o ceco. Para evitar a disseminação peritoneal artificial, lise as células vazadas com um enxágue completo com água destilada e retorne suavemente o ceco à cavidade abdominal.

Feche a parede abdominal com suturas contínuas de rápida absorção, na pele com clipes de ferida cirúrgica. Em seguida, coloque o mouse em uma esteira de aquecimento ajustada para 38 graus Celsius com monitoramento até a decúbito total. Para isolar as células tumorais circulantes, no ponto final experimental apropriado, encha tubos cônicos de 15 mililitros com cinco mililitros de meio de gradiente de densidade por tubo e transfira cuidadosamente amostras de sangue total coletadas de animais portadores de tumor para as camadas de gradiente de densidade.

Separe as células por centrifugação e recupere cuidadosamente a interface que contém as células mononucleares. Pipetar as células mononucleares para um novo tubo de 15 mililitros para uma segunda centrifugação. Seguido por lavagens de tubos em PBS.

Após a segunda lavagem, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de PBS, suplementado com EDTA e adicione quatro microlitros de anticorpo anti-ampere a cada amostra, para incubação de 20 minutos em gelo no escuro. Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo de aproximadamente um centímetro em uma placa de Petri estéril de seis centímetros por amostra e adicione 700 microlitros de tampão de coleta a cada círculo, seguido por 50 microlitros de suspensão celular. Use um microscópio para verificar a densidade das células e deixe as amostras assentarem por cerca de cinco minutos.

Em seguida, rastreie a gota de células para positividade do acampamento de ampères e use o micromanipulador para transferir as células de interesse para 15 microlitros do tampão apropriado para a análise subsequente a jusante pretendida. O uso de células colorretais neste modelo resulta de forma confiável em camundongos mais abundantes dentro de 35 dias após a injeção de células tumorais, com os tumores primários medindo cerca de 10 milímetros de tamanho, e com metástase hepática e pulmonar e células tumorais circulantes, quase invariavelmente presentes. Além disso, as células tumorais circulantes podem ser facilmente isoladas para análise a jusante.

Uma vez dominada e se realizada corretamente, essa técnica pode ser realizada em 10 minutos, facilitando a formação de tumores uniformes e metastáticos que podem ser usados tanto para estudos terapêuticos quanto moleculares. As limitações do modelo incluem sua dependência da lise celular, que tem suas próprias limitações, bem como a imunodeficiência dos camundongos, ambas as quais podem ser superadas pelo uso de células cancerígenas colorretais mutantes. Devido à sua simplicidade, este modelo pode ser um adendo valioso aos modelos atualmente disponíveis de câncer colorretal.