Name: Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprenda uma técnica microcirúrgica para injetar células tumorais colorretais no ceco de camundongos imunocomprometidos, isolando células tumorais circulantes. Este modelo reprodutível permite estudar metástase e progressão tumoral.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Os experimentos com animais apresentados aqui foram revisados ​​e permitidos de forma independente por um comitê institucional e governamental de Cuidados e Uso de Animais e foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Federação de Associações de Ciências de Animais de Laboratório (FELASA). Todas as medidas possíveis foram tomadas para minimizar o sofrimento, incluindo anestesia e analgesia ou, se necessário, eutanásia prematura. 1. Preparação de células e organismos orgânicos NOTA: Use um volume de 20 μL com 100.000 células para cada injeção. Use a matriz da membrana basal (BMM) para evitar vazamentos e garantir a injeção padronizada. Para garantir resultados reprodutíveis, realize ensaios de autenticação de linha celular ( por exemplo , via perfil STR) em intervalos regulares. <ol><li> Preparação de suspensões celulares primárias de tecido fresco NOTA: sempre trabalhe em condições estéreis. Transferência imediata do recém-chegadoO tecido ressecado da sala de operação para o laboratório em gelo é necessário para assegurar uma alta viabilidade das células. O bem-estar do paciente e o tratamento ideal sempre devem ser a primeira prioridade. Portanto, amostras de tecido para pesquisa devem ser obtidas de maneira que não interfira com o subsequente tratamento patológico e o estadiamento do tumor ressecado. Na maioria dos casos, é razoável ter as amostras para pesquisas obtidas por um patologista treinado para garantir a não interferência no diagnóstico patológico. <ol><li> Imediatamente após a remoção estéril do espécime ressecado (idealmente ~ 1 cm 3 ), coloque a amostra de tecido em um tubo de 50 mL pré-cheio com 20-30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Armazene o tubo no gelo e transfira-o imediatamente para o laboratório. </li><li> Coloque o tecido em uma placa de Petri e lave-o duas vezes com uma abundância de PBS para remover o sangue restante. </li><li> Corte o tecido em pequenos pedaços (~ 2-4 mm) com uma scaLpel ( por exemplo , com uma lâmina # 20 ou # 36). </li><li> Use o dissociador de acordo com as instruções do fabricante para dissociar ainda mais o tecido do tumor a uma suspensão de célula única. Alternativamente, use outros protocolos de digestão de tumores enzimáticos. </li><li> Contar as células da suspensão de célula única resultante ( por exemplo , em um contador de cunha ou um hemocitómetro). </li><li> Centrifugação (5 min a 1.500 xg) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS. </li><li> Ressuspender as células no BMM em uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo. </li></ol></li><li> Preparação de linhas celulares para injeção <ol><li> Cultive todas as linhas celulares de câncer colorretal sob condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO 2 ) e prepará-las no dia da cirurgia. </li><li> Colhe as células de acordo com os protocolos de cultura de células padrão, conte as células ( por exemplo , em um contador de cúpula ou um hemocitómetro) e calcule a reqQuantidade estimada para todas as injeções, dependendo do número de animais a serem injetados. </li><li> Prepare 3-5x do volume realmente necessário para explicar as perdas de pipetagem e o volume morto da seringa de injeção. </li><li> Centrifugação (5 min a 1.500 g) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS. </li><li> Ressuspender as células no BMM em uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo. </li></ol></li><li> Preparação de orgóides NOTA: Todas as culturas de organoides 3D são cultivadas sob condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO 2 ). Protocolos detalhados para a cultura de organoides foram publicados antes. 18 , 19 , 20 Semelhante às linhas celulares convencionais, recomendamos um volume de 20 μL de BMM com 100.000 células por injeção. Os organoides são preparados no dia da cirurgia da seguinte forma: <ol><li> Prepare o seguinte meio (no seguintePara DMEM / F12 +++): Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% de glutamina (200 mM) + 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Preencha os tubos de 15 mL com 1 mL de DMEM / F12 +++. </li><li> Elimine cuidadosamente os organoides da superfície da placa de cultura e transfira os conteúdos de 3 a 5 poços para um tubo de 15 mL. </li><li> Corte cuidadosamente os organoids em pedaços menores, pipetando-os para cima e para baixo com uma pipeta de vidro estendida. </li><li> Adicionar 5 mL de DMEM / F12 +++ ao tubo, seguido de centrifugação a 1000 xg durante 5 min. </li><li> Após centrifugação, remova o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 600 μL de tampão de dissociação enzimática e transfira a suspensão para um poço de uma placa de 6 poços. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1-5 minutos e, em seguida, cuidadosamente pipetar a suspensão para cima e para baixo para dissolver os organoides. NOTA: Verifique a digestão através do microscópio; Está completo quando todos os clusters celulares foram dissociadosD para células individuais. </li><li> Após a digestão bem sucedida, adicione 1,4 mL de DMEM / F12 +++ para parar a digestão. Em seguida, transferir todos os poços de organoides digeridos para um tubo de 50 mL. </li><li> Contar as células e calcular a quantidade necessária para todas as injeções. </li><li> Prepare 3 - 5x do volume realmente necessário para contabilizar as perdas de pipetagem e o volume morto da seringa de injeção </li><li> Centrifugação (5 min a 1.500 xg) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS. </li><li> Ressuspendeu as células em BMM para uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo. </li></ol></li></ol> 2. Orthotopic Mouse Model <ol><li> Preparação de animais receptores para cirurgia NOTA: Use ratos NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) de 6-8 semanas de idade como destinatários. 21 NSG estão entre os camundongos mais imunocomprometidos, sem células maduras B, T e NK, juntamente com múltiplos outros imunes deFects. 21 Eles crescem de forma confiável, mesmo que sejam baixados números de células e sejam altamente propensos a metástases à distância. Os ratos NSG são criadores excelentes e podem ser mantidos em unidades convencionais de patógenos livres (SPF). <ol><li> Antes da primeira incisão, injete 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea. </li><li> Use sevoflurano em 3-3,5 vol% para anestesia geral. Uma perda do reflexo de pinça do dedo do pé indica anestesia suficiente. </li><li> Cubra os olhos dos ratos anestesiados com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea. </li><li> Conduza os camundongos em posição supina numa pequena mesa. </li><li> Raspar o abdômen com uma máquina de barbear elétrica (o creme depilatório pode ser usado alternativamente) e desinfectar com pelo menos 3 vezes clorhexidina / iodo e 70% de álcool alternativamente. </li><li> Cubra o campo cirúrgico com cortinas estéreis. NOTA: O uso de antibióticos perioperatórios é opcional e está sujeito a diretrizes institucionais. </li></ol></li><li> Laparotomia da linha média e exposição do ceco <ol><li> Use tesoura (os escalpelos podem ser usados ​​alternativamente) para fazer uma pequena incisão da linha média (3 - 5 mm) da pele na parte inferior do abdômen. Pegue a musculatura da parede abdominal com fórceps e cuidadosamente o incise com uma tesoura, abrindo assim a cavidade abdominal. </li><li> Identificar e externalizar cuidadosamente o ceco com fórceps atraumáticos. Posicione a bolsa final cega do ceco no abdômen apontando de forma cranial. </li><li> Uma vez exteriorizado, mantenha o cecum úmido usando esfregões salinos quentes em todos os momentos. </li></ol></li><li> Injeção ortotópica, fechamento do abdômen e recuperação pós-operatória <ol><li> Para injeção intracecal, use uma seringa padrão de 1 mL com uma cânula de 30 G. Monte esta seringa em uma bomba de microinjeção, que por sua vez é montada em um micromanipulador. </li><li> Cuide cuidadosamente a ponta do ceco com fórceps atraumáticos e suavemente alise-a acariciando-aD com um segundo conjunto de fórceps umedecido com solução salina quente. </li><li> Posicione a cânula diretamente acima do ceco. </li><li> Execute as seguintes etapas sob controle visual com um microscópio cirúrgico binocular. </li><li> Cuide cuidadosamente o ceco com duas pinças atraumáticas em ambas as extremidades da parte exteriorizada do ceco, estique-a ligeiramente e depois puxe-a lentamente sobre a cânula que está posicionada em paralelo e diretamente acima. É crucial não perfurar toda a parede do intestino (assim, injetar as células no lúmen), bem como não perfurar a serosa além do ponto inicial de penetração, pois isso levaria a vazamento e disseminação peritoneal. <ol><li> Mova o intestino em direção à cânula, não a cânula em direção ao intestino. Segure e estique o intestino entre duas fórceps. As mãos do cirurgião devem descansar sobre uma superfície para reduzir o tremor. </li></ol></li><li> Injetar as células entre a serosa (vista como revestimento muito fino e translúcido acima daE vasos sanguíneos intramurais) e muscularis. Por conseguinte, a cânula deve ser colocada visualmente acima dos vasos sanguíneos e embaixo da fina membrana translúcida. </li><li> Use um interruptor de pé para iniciar a injeção para reduzir o tremor enquanto a cânula está dentro da parede do intestino. </li><li> Uma vez que a cânula está em posição, comece a injeção. Use uma duração de 20 s, resultando em 1 μL / s de configuração na unidade de controle da bomba. NOTA: A injeção dentro ou perto de um vaso sanguíneo danificado conduz a disseminação intravascular direta e metástase à distância e, portanto, deve ser evitada. </li><li> Após a conclusão da injeção, remova cuidadosamente a cânula puxando-a para trás. </li><li> Coloque um cotonete seco sob o ceco e, em seguida, enxágue completamente o ceco com água destilada para liar células vazias e, assim, evite a disseminação peritoneal artificial. </li></ol></li><li> Encerramento do abdômen e recuperação pós-operatória <ol><li> Depois deInsistente, gentilmente retorna o ceco à cavidade abdominal. </li><li> Feche a parede abdominal com suturas de roda rapidamente absorvíveis de 6-0. </li><li> Feche a pele com os clipes da ferida cirúrgica. </li><li> Coloque o mouse em um mapa de aquecimento configurado para 38 ° C até se recuperar completamente da anestesia. </li><li> Observe de perto a condição pós-operatória dos ratos nas 48 horas seguintes. Em caso de angústia, tratar com 0,05 mg / kg de buprenorfina a cada 12 h. </li><li> Monitore os ratos pelo menos uma vez por dia para detectar sinais de angústia devido ao crescimento do tumor. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento de células tumorais circulantes de amostras de sangue inteiro NOTA: Obtenha sangue por punção cardíaca transcutânea em ratos anestesiados, seguido de eutanásia. Idealmente, 1000 μL de sangue são empurrados para uma seringa pré-cheia com 100 μL de um anticoagulante (ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) ou heparina). Use um anti-humano-EpCAM (adesão de células epiteliaisMolécula) anticorpo para identificar os CTCs. Isso funciona muito bem se as linhas de células epiteliais humanas forem usadas no modelo do mouse. Para outros aparelhos, diferentes anticorpos podem ser necessários. <ol><li> Enriquecimento de CTC: <ol><li> Preencha os tubos de 15 mL com meio de gradiente de densidade de 5 mL e transfira cuidadosamente o sangue para o tubo de 15 mL. </li><li> Centrifugação (30 min a 300 xg sem freio) e remova cuidadosamente o sobrenadante superior. </li><li> Despeje o resto em um novo tubo de 15 mL e centrifugue (15 min, 300 xg com freio). </li><li> Recupere a interfase que contém as células mononucleares (descarte o resto) e lave as células duas vezes com PBS. </li><li> Ressuspender o sedimento em 200 μL de PBS / 1% de EDTA e adicionar 4 μL de anticorpo EpCAM. Incube 20 min no gelo no escuro. </li></ol></li><li> Triagem e escolha <ol><li> Prepare o seguinte buffer (a seguir denominado buffer de seleção): PBS + 10% de soro de vitelo fetal (FCS) + 1% de penicilina / STreptomicina (1%) + 0,8% de EDTA. </li><li> Use uma caneta PAP para desenhar um círculo de ~ 1 cm em uma placa de Petri estéril de 6 cm (evita que o fluido se disperse no prato) e pipetar 700 μL de tampão de colheita para este círculo. </li><li> Adicione 50 μL de suspensão celular ao tampão de picking de 700 μL dentro do círculo. Verifique a densidade das células com o microscópio. Divida a amostra em pratos diferentes se for muito denso. </li><li> Aguarde as células se acalmarem (~ 5 min). </li><li> Teste a queda da suspensão celular para células coradas (= EpCAM-positivas). </li><li> Uma vez que uma célula é encontrada, escolha a célula com o micromanipulador e coloque-a em tampão de 50 μL, dependendo da análise a jusante pretendida ( p . Ex. , Tampão de extração de RNA ou meio de cultura). </li><li> Dependendo das análises a jusante pretendidas, isole células e / ou medidores negativos para EpCAM como controles negativos. </li><li> Proceda com análises a jusante ( por exemplo , cultura celular, PCR). </li></ol></li></ol>

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<li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Apesar de sua atividade pré-clinicamente comprovada em modelos de ratos subcutâneos, a grande maioria dos novos compostos falha em ensaios clínicos e nunca atinge a clínica. 11 Esta óbvia insuficiência de modelos subcutâneos de ratos para simular com precisão a biologia e os padrões de crescimento dos tumores levou ao desenvolvimento de modelos de ratos ortotópicos baseados na injeção de células tumorais diretamente no órgão original. Os modelos de ratos ortotópicos s...

O câncer colorretal (CRC) é uma das causas mais comuns de morte por câncer nos países ocidentais. 1 Embora o tumor primário possa ser frequentemente ressecado, a ocorrência de metástases à distância piora dramaticamente o prognóstico e muitas vezes leva à morte. 2 , 3 A correlação biológica da metástase é a circulação de células tumorais (CTCs), que se destacam do tumor, sobrevivem em circulação, se juntam ao epitélio no órgão alvo, invadem o órgão e, finalmente, superam novas lesões. 4 Embora os CTCs sejam de relevância prognóstica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , sua biologia é parcialmente entendida como resultado de sua extrema raridade no CRC. 10 Os modelos de mouse são um poderoso tOol para estudar vários aspectos da biologia do câncer. Os modelos clássicos de tumor subcutâneo são produzidos por injeção subcutânea de células tumorais em camundongos receptores, que podem ser imunocompetentes (se forem utilizadas células de tumor murino singenésicas) ou imunodeficientes. Os modelos de tumor subcutâneo são baratos e produzem dados rapidamente; Seu crescimento de tumor de ponto final pode ser medido facilmente e não invasivamente. No entanto, 88% dos novos compostos que demonstraram atividade antitumoral em tais modelos falham nos ensaios clínicos. 11 Isto é em parte devido a diferenças entre espécies entre humanos e camundongos; No entanto, uma grande parte dessa falha é devido ao baixo valor preditivo de modelos subcutâneos de mouse. Os modelos de ratos ortotópicos, nos quais as células tumorais são injetadas no órgão de origem e, portanto, crescem em seu microambiente original, são, portanto, cada vez mais utilizados na pesquisa do câncer. 11 , 12 , </sUp&gt; 13 , 14 Os modelos ortotópicos não apenas simulam as condições locais de crescimento tumoral; Como resultado do sítio anatômico correto do crescimento tumoral, os modelos de ratos ortotópicos também permitem a simulação realista de metástases e, portanto, são usados ​​para estudar biologia 8 , 15 e 16 de CTC ou sua resposta a diferentes tratamentos em CRC. 13 , 17 Uma grande desvantagem dos modelos de mouse ortotópicos é a sua complexidade técnica. Dependendo do órgão em que as células devem ser injetadas, a curva de aprendizado até que o experimentador seja capaz de induzir tumores reprodutíveis é bastante longa. Isto aplica-se especialmente aos modelos de câncer colorretal, uma vez que as células tumorais precisam ser injetadas na parede intestinal, o que muitas vezes resulta em perfuração, vazamento de células tumorais ou perda de células tumorais endoluminais. Isso é umO artigo pretende descrever o método de preparação celular a partir de amostras de tecido primário, linhas celulares 2D e cultura organo 3D e sua injeção no ceco de camundongos. A técnica descrita aqui leva a tumores altamente uniformes e, dependendo da biologia do tumor da linha celular usada para injeção, a formação reprodutível de metástases à distância e CTC nos camundongos receptores. 15

<table><tbody><tr><td>Meios e componentes de cultura celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Glutamax-I Supplement (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Penicilina/ Estreptomicina (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ meio</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>meio básico de linhagens celulares 2D (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>meio básico de linhagens celulares 2D (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Tampão de dissociação enzimática TrypLE Express</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Matrigel (BMM, sem vermelho de fenol)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%, Vermelho de fenol)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6/48 poços com tampa</td><td>Balão de cultura de células CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2;, 250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>frasco de cultura de células 150 cm&sup2;, 600 mL</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>tubos Eppendorf 1,5 mL / 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL, 50 mL</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Lâminas de contagem (para máquina de contagem TC20)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur (vidro, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>finamente puxadas usando um bico de bunsen</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>para preparação de tecido tumoral primário</td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>para preparação de tecido tumoral primário</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>para preparação de tecido tumoral</td></tr><tr><td>primário Kit de Dissociação de Tumor Humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>para preparação</td></tr> <tr><td>de tecido tumoral primárioFalcon 70 &micro; m Cell Strainer</td><td>Corning BV Life Sciences</td><td>352350</td><td>para preparação de tecido tumoral primário</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento cirúrgico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co. KG</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Oxigênio médico</td><td>Air Liquide Medical GmbH</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Buprenorfina</td><td>Temgesic-Bepanthen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- pomada oftálmica</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina normal 0,9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL (sem volume morto) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>agulha de injeção 30G</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>swabs de celulose</td><td>Lohmann & Fórceps Micro-Adson Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FST - Ferramentas Fine Science</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Íris - ToughCut</td><td>FST - Ferramentas Fine Science</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas Olsen-Hegar</td><td>FST - Ferramentas Fine Science</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Kit AutoClip</td><td>FST - Ferramentas Fine Science</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (cirúrgico sutura)</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de Anestesia de Pesquisa de Mesa com Descarga de O2 e Vaporizador de Sevoflurano</td><td>Bomba Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicro com Controlador</td><td>Micro4 Equipamento World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td>para injeção ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Pedal para Controlador SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>15867</td><td>equipamento para injeção ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Micromanipulador manual de três eixos</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td>equipamento para injeção ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Suporte magnético para micromanipulador</td><td>World Precision Instruments</td><td>Equipamento M10</td><td>para injeção ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Placa de base de aço para suporte magnético M10</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>equipamento para injeção ortotópica altamente controlada</td></tr><tr><td>Placa Quente 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Barbeador de cabelo</td><td>AESCULAP - Braun-Microscópio</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cirúrgico Binocular</td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Isolamento CTC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente de densidade médio &ndash; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-humano CD326 (EpCAM) Anticorpo clone 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Anticorpo clone G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, &oslash; 60 x 15 mm, 21 cm&sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Cultura de Células de Fluorescência</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r Micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td> Bomba de aspiração <td>Eppendorf</td><td></td><td>conectada ao micromanipulador</td></tr><tr><td>Dmz Universal Microelectrode Extrator</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>necessária para a fabricação de micro capilares para aspiração de célula única</td></tr><tr><td>Prism Glass Capilaries</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caneta PAP</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato de Dulbecco Salina</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>tampão de coleta</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>tampão de coleta</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>tampão de coleta</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>buffer de coleta</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Imunohistoquímica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clone de anticorpo anti-humano purificado CD326 (EpCAM) 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM imuno-histoquímica (cf, fig. 2C)</td></tr><tr><td>HRP coelho anti-camundongo IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM imuno-histoquímica (cf, fig. 2C)</td></tr></tbody></table>

isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Apesar das vantagens de uma fácil aplicabilidade e custo-eficácia, os modelos de ratos subcutâneos têm limitações severas e não simulam com precisão a biologia do tumor e a disseminação de células tumorais. Modelos de mouse ortotópicos foram introduzidos para superar essas limitações; No entanto, esses modelos são tecnicamente exigentes, especialmente em órgãos vazios, como o intestino grosso. Para produzir tumores uniformes que crescem e metastatizam de forma confiável, são críticas técnicas padronizadas de preparação e injeção de células tumorais. Desenvolvemos um modelo de câncer colorretal ortopsico (CRC) que desenvolve tumores altamente uniformes e pode ser utilizado para estudos de biologia tumoral, bem como ensaios terapêuticos. As células tumorais de ambos os tumores primários, linhas celulares bidimensionais (2D) ou organoides tridimensionais (3D) são injetadas no ceco e, dependendo do potencial metastático das células tumorais injetadas, formam tumores altamente metastáticos. Além do que, além do mais,Os CTCs podem ser encontrados regularmente. Aqui descrevemos a técnica de preparação de células tumorais a partir de linhas celulares 2D e organoídeos 3D, bem como tecido tumoral primário, técnicas cirúrgicas e de injeção, bem como o isolamento de CTCs dos camundongos portadores de tumor e dicas atuais para solução de problemas.

A geração bem sucedida e reprodutível de tumores colorretais neste modelo depende criticamente da injeção precisa das células sem derramamento ou vazamento. Se isso for alcançado, este modelo é extremamente confiável e muito raramente resulta em disseminação peritoneal artificial. A cinética de crescimento dos tumores, bem como os seus padrões de disseminação, dependem da biologia dos organoídeos e células utilizados. 15 Enquanto as células HCT116 apresentam metás...

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

O objetivo geral dessa técnica microcirúrgica é injetar células tumorais colorretais na parede cecal para induzir tumores colorretais reprodutíveis e metastáticos em camundongos. Este método pode responder perguntas-chave na área da biologia de células tumorais circulantes; suas principais vantagens são os tumores altamente reprodutíveis e uniformes, permitindo previsão confiável do estágio tumoral e da presença de células tumorais circulantes. Comece utilizando pinças não traumáticas para exteriorizar cuidadosamente o ceco de um camundongo imunocomprometido com idade entre seis e oito semanas.Posicionar a extremidade cega do ceco sobre o abdômen de modo que a bolsa aponte cranialmente. Para a injeção intra-cecal, acople uma seringa padrão de um mililitro equipada com uma cânula de 30 graus e carregue-a com as células tumorais em uma bomba de injeção micro que esteja montada em um micromanipulador. Em seguida, use a pinça não traumática para segurar cuidadosamente a ponta do ceco e utilize uma segunda pinça, umedecida com solução salina morna, para suavizar o ceco com movimentos suaves para baixo.Agora, mova o animal para sob um microscópio cirúrgico binocular e, com a cânula diretamente paralela e acima do ceco, use duas pinças não traumáticas para esticar cuidadosamente o tecido em ambas as extremidades da porção exteriorizada do ceco. Puxe lentamente o ceco sobre a cânula, tomando cuidado para não perfurar toda a faixa da parede ou a serosa além do ponto inicial de penetração, e posicione a cânula acima dos vasos sanguíneos e sob a membrana fina e translúcida dentro da faixa da parede. Quando a cânula estiver no lugar, use um pedal para injetar 20 microlitros de células ao longo de um período de 20 segundos.Entre a fina camada serosa translúcida, acima dos vasos sanguíneos intramurais e a muscularis. Quando todas as células tiverem sido injetadas, remova cuidadosamente a cânula e coloque um cotonete seco sob o ceco. Para prevenir disseminação peritoneal artificial, lise quaisquer células vazadas com uma lavagem completa com água destilada e retorne suavemente o ceco à cavidade abdominal.Feche a parede abdominal com suturas contínuas rapidamente absorvíveis e a pele com clipes cirúrgicos para feridas. Em seguida, coloque o camundongo sobre uma plataforma aquecida ajustada a 38 graus celsius com monitoramento até a recuperação completa da posição de decúbito. Para isolar as células tumorais circulantes, no ponto final experimental apropriado, encha tubos cónicos de 15 mililitros com cinco mililitros de meio de gradiente de densidade por tubo e transfira cuidadosamente as amostras de sangue total coletadas de animais portadores de tumor sobre as camadas de gradiente de densidade.Se pare as células por centrifugação e recupere cuidadosamente a interface contendo as células mononucleares. Pipete as células mononucleares para um novo tubo de 15 mililitros para uma segunda centrifugação. Em seguida, lave os tubos com PBS.Após a segunda lavagem, re-suspenda os pellets em 200 microlitros de PBS, suplementado com EDTA, e adicione quatro microlitros de anticorpo anti-amp camp a cada amostra, incubando por 20 minutos no gelo e no escuro. Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo de aproximadamente um centímetro de diâmetro em uma placa de Petri estéril de seis centímetros por amostra e adicione 700 microlitros de tampão de coleta a cada círculo, seguidos por 50 microlitros de suspensão celular. Use um microscópio para verificar a densidade das células e deixe as amostras sedimentarem por cerca de cinco minutos.Em seguida, analise a gota de células quanto à positividade para amp camp e use o micromanipulador para transferir as células de interesse para 15 microlitros do tampão apropriado para a análise subsequente pretendida. O uso de células colorretais neste modelo resulta de forma confiável em camundongos mais abundantes dentro de 35 dias após a injeção das células tumorais, com tumores primários medindo cerca de 10 milímetros de tamanho, e com metástases hepáticas e pulmonares, bem como células tumorais circulantes, quase invariavelmente presentes. Além disso, as células tumorais circulantes podem ser facilmente isoladas para análise posterior.Uma vez dominada e se realizada corretamente, esta técnica pode ser executada em até 10 minutos, facilitando a formação de tumores uniformes e metastáticos que podem ser utilizados tanto em estudos terapêuticos quanto moleculares. As limitações do modelo incluem sua dependência de lisados celulares, que possuem suas próprias limitações, bem como a imunodeficiência dos camundongos, ambas as quais podem ser superadas pelo uso de células mutantes de câncer colorretal. Devido à sua simplicidade, este modelo pode ser um valioso complemento aos modelos atualmente disponíveis de câncer colorretal.

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Duas técnicas podem ser usadas para estabelecer esse modelo: injeção de uma suspensão de células de câncer na parede cecal ou transplante de um pedaço de tumor subcutâneo para o ceco. Este modelo é útil para estudar a progressão natural do câncer colo-retal e testes de novos agentes terapêuticos contra o câncer colorretal.

Modelo rato ortotópico de câncer colorretal

Este vídeo descreve o protocolo para estabelecer um modelo de camundongo com metástase espontânea de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer colorretal ou PDXs. Esses modelos de xenoenxerto imitam parcialmente as características dos carcinomas humanos e entendem os aspectos críticos das malignidades humanas, incluindo invasão e metástase.

Modelos de camundongos com metástase espontânea: uma plataforma para estudar o potencial metastático de células de câncer colorretal injetadas ortotopicamente

Este vídeo descreve o protocolo para gerar metástases pelos organoides CRC derivados de PDX marcados com lentivírus GFP no baço de um camundongo imunodeficiente. As micrometástases de câncer que colonizam outros órgãos podem ser detectadas usando um microscópio de fluorescência para avaliar a expressão de GFP.

Estabelecendo modelo de camundongo com metástases experimentais: implantando células organoides CRC que expressam GFP no modelo PDX para detectar micrometástases

O vídeo descreve a técnica de injeção intracecal de células cancerígenas para desenvolver um modelo de camundongo ortotópico com tumores altamente uniformes. Portanto, o modelo ortotópico de camundongo permite a simulação realista de metástases, fornecendo uma ferramenta valiosa para estudar as mudanças fenotípicas durante o crescimento e disseminação do tumor.

Injeção de células tumorais intracecais: uma técnica para entregar células cancerígenas para estabelecer o modelo ortotópico de camundongo com câncer colorretal

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar células tumorais circulantes da amostra de sangue total de um modelo de camundongo com tumor colorretal sacrificado. Essas CTCs isoladas podem ser cultivadas e usadas para análise downstream pretendida.

Isolamento CTC de uma amostra de sangue total: um método para obter CTCs de modelo de câncer colorretal murino

As células tumorais circulantes (CTCs) demonstraram desempenhar um papel importante na metástase tumoral. Aqui, um método para o isolamento e propagação de CTCs a partir do sangue total de um modelo de tumor singênico de camundongo de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC) é descrito.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Para permitir a detecção altamente sensível do câncer colorretal humano divulgação células (CRC) colonizar os tecidos, mostramos aqui um protocolo para transdução eficiente de particulas de Lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) em células de organoides CRC PDX-derivado antes da sua injeção em ratos destinatários, com a observação microscópica de estéreo-fluorescência.

Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

A injeção de veia portal de organoides de câncer colorretal (CRC) gera metástase hepática rica em estroma. Este modelo de camundongos de metástase hepática crc representa uma ferramenta útil para estudar interações tumorais-estroma e desenvolver novas terapêuticas dirigidas a estroma, como terapias genéticas mediadas por vírus associados ao adeno.

Portal Injeção de Veia de Organoides de Câncer Colorretal para Estudar o Estroma metástase hepática

Este protocolo descreve o implante ortotópico de células cancerosas derivadas de pacientes na parede do ceco de camundongos imunodeficientes. O modelo recapitula a doença metastática avançada do câncer colorretal e permite a avaliação de novas drogas terapêuticas em um cenário clinicamente relevante de metástases pulmonares e hepáticas.

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

Este estudo se concentra na indução subcutânea in vivo de células cancerígenas colorretais luminescentes em um modelo murino e na subsequente medição de luminescência usando um sistema de imagem. O procedimento visa estabelecer um modelo de crescimento tumoral reprodutível para monitoramento em tempo real e avaliação terapêutica.

Injeção subcutânea de células de câncer colorretal humano em camundongos nus atímicos para avaliar a eficácia antitumoral

Aprenda uma técnica microcirúrgica para injetar células tumorais colorretais no ceco de camundongos imunocomprometidos, isolando células tumorais circulantes. Este modelo reprodutível permite estudar metástase e progressão tumoral.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

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