Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

Preparação e corte com um vibratomo. Três blocos de ágar são necessários para estabilizar o cérebro durante o procedimento de corte. Para evitar contaminação, utilize um conjunto de instrumentos autoclavado.

Remova o ágar. Deve ser secado em papel filtro antes de colá-lo na placa metálica com cola cirúrgica de cianoacrilato. Com uma espátula, remova o cérebro e coloque-o cuidadosamente na placa de Petri contendo o meio de preparação.

Em seguida, seque brevemente o cérebro no papel filtro. Cubra a placa metálica com cola cirúrgica de cianoacrilato. Use a pinça e a espátula para posicionar o cérebro no suporte da amostra.

Utilize os dois pedaços de ágar previamente preparados para garantir estabilidade mecânica por ambos os lados. Neste momento, o cérebro deve ser posicionado ao lado do bloco de ágar e estabilizado com mais dois blocos para evitar danos durante o fatiamento. Coloque a placa metálica no vibrátomo e cubra o tecido com meio de preparação frio.

Em seguida, dissecar o tecido horizontalmente em OHSC com espessura de 350 micrômetros utilizando um vibrátomo deslizante. Transferir as fatias para a placa de Petri, usando a parte traseira de uma pipeta de Pasteur quebrada para coletar as fatias. Manter as fatias cerebrais em meio de preparação frio.

Avalie os cortes microscopicamente com um microscópio binocular. Separe a região do hipocampo e entre na camada interna do córtex usando um bisturi com lâmina redonda nº 15. É importante utilizar apenas cortes com citarquitetura intacta, isolados da parte média do hipocampo, entre o hipocampo dorsal e o ventral.

OHSCs de baixa qualidade devem ser descartados imediatamente. Transfira duas a três das fatias obtidas para um inserto de cultura celular com tamanho de poro de 0,4 micrômetro. Aspire o meio de preparação do topo do inserto de cultura celular utilizando uma pipeta de Pasteur.

Coloque o fragmento em uma placa de cultura de seis poços contendo um milímetro de meio de cultura por poço. Incube as placas de seis poços a 35 graus Celsius em atmosfera totalmente umidificada com 5% de CO2 e troque o meio de cultura celular a cada dois dias. Após seis dias em cultura para tecido de rato, ou 14 dias para tecido murino, as reações inflamatórias associadas ao próprio procedimento de corte já terão desaparecido.

Agora é possível realizar experimentos. Resultados representativos para estudos de neuroproteção. A imagem da parte A mostra OHSC sem lesão mantidos em meio de cultura por nove dias in vitro, sem qualquer tratamento, servindo como fatias controle.

Conforme confirmado por microscopia confocal com varredura a laser, os OHSC controle mostraram boa preservação neuronal. As células microgliais positivas para Isolectina B4 estavam principalmente localizadas nas camadas molecular e plexiforme e exibiam um fenótipo ramificado. Na camada de células granulares do giro dentado, apenas um número muito reduzido de células microgliais positivas para Isolectina B4 e praticamente nenhum núcleo positivo para Iodeto de Propídio foram encontrados.

Outro conjunto de OHSC, mostrado na parte B da imagem, foi mantido em meio de cultura por seis dias, lesionado com NMDA 50 micromolar por quatro horas e mantido em meio de cultura por mais três dias. Após a lesão com NMDA, houve uma grande acumulação de células microgliais ativadas, positivas para Isolectina B4, aderidas ao local da lesão neuronal, em todas as camadas do giro dentado.

A análise quantitativa revelou que na camada de células granulares do giro dentado, o número de micróglias positivas para Isolectina B4 era maior nos CHSO lesados em comparação com as condições controle. De maneira semelhante, o número de neurônios degenerativos positivos para Iodeto de Propídio aumentou fortemente na camada de células granulares de fatias lesadas com NMDA. Resultados amostrais para estudos de invasão tumoral.

Todas as imagens retratam resultados do ensaio de invasão tumoral SS utilizando OHSC, obtidos com microscópio confocal de varredura a laser. A cor vermelha marca a arquitetura celular do OHSC e as células tumorais em verde. A imagem A mostra um padrão típico de invasão para células de glioblastoma U138, que tiveram liberdade para invadir por quatro dias.

Tumores claros, esféricos e bem delimitados podem ser observados, e a estrutura do OHSC parece estar intacta, com um giro denteado e Cornu Ammonis claramente visíveis. A imagem B mostra um padrão de invasão diferente, gerado por células de glioblastoma LN229 após quatro dias. Nesse caso, tumores individuais não podem ser claramente diferenciados devido à rede formada que cobre a maior parte do OHSC, embora a arquitetura celular permaneça intacta, com giro denteado e Cornu Ammonis não deformados.

Pode-se ainda concluir que as células LN229 são mais invasivas do que as células U138. As imagens C e D mostram o mesmo resultado de invasão tumoral para as células LN229 após quatro dias de invasão. No lado esquerdo, pode-se observar que a massa tumoral está cobrindo quase todo o campo de visão.

A imagem D mostra a coloração correspondente com iodeto de propídio. Neste lâmina, a citarquitetura já não está mais intacta, já que o cornu ammonis não é mais visível e o giro denteado também está distorcido. Uma possível razão para tal resultado pode ser um OHSC que não estava totalmente intacto no início do experimento, um número excessivo de células tumorais aplicadas ou um tempo de invasão muito longo, que resultou na perda estrutural observada.

Assim, esse tipo de resultado de invasão deve ser descartado. Culturas de fatias hipocampais organotípicas representam um excelente modelo in vitro que reflete a fisiologia do cérebro com conexões neuronais intactas. Como um único modelo, várias culturas de fatias podem ser obtidas, permitindo testar múltiplas condições em tecido de um único animal, e os resultados são altamente reprodutíveis.

Devido ao alto grau de acessibilidade, os cultivos de fatias hipocampais organotípicas são excelentemente adequados para uma infinidade de tipos experimentais. Isso inclui estudos eletrofisiológicos e de neurogênese, mas também experimentos sobre neuroproteção, invasão tumoral e interações de células tumorais com tecido cerebral saudável.