Recombinante α-β e γ-Synucleins estimular a proteína fosfatase 2A subunidade catalítica atividade ensaios em células grátis

Sinucleínas alfa, beta e gama recombinantes estimulam a atividade da subunidade catalítica da proteína fosfatase 2A em ensaios livres de células. Olá, meu nome é Sovanarak Lek. Sou estudante de medicina no Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.

Neste vídeo, demonstrarei um ensaio colorimétrico bifásico de fosfatase proteica utilizando proteínas de sinucleína recombinantes. Preparação de tampões e reagentes. Preparação do tampão de fosfato de p-nitrofenol.

Para preparar 50 mililitros de tampão pNPP, dissolva a base Trizma em 25 mililitros de água desionizada ultrapura em um béquer. Adicione uma barra de agitação limpa e coloque sobre o agitador magnético. Após a dissolução da Trizma, adicione cloreto de cálcio com agitação contínua.

Ajuste o pH para 7,0. Transfira a solução para um cilindro graduado. Complete o volume final até 50 mils com água desionizada ultrapura.

Preparação da solução de verde de malaquita. A solução de verde de malaquita requer três soluções, partes A, B e C. A solução A é ácido clorídrico quatro molar. A solução B é uma combinação de molibdato de amônio mais a solução A. A solução C é o sal oxalato de verde de malaquita a 0,045%.

Para preparar a solução D, misture uma parte da solução B com três partes da solução C, numa proporção de um para três. Agite durante uma hora à temperatura ambiente. Por fim, filtre a solução D através de uma membrana de 22 micrômetros e armazene a quatro graus Celsius.

Proteger da luz. Preparação do ativador. O ativador é uma solução a um por cento de Tween 20.

Pipete 10 microlitros de Tween 20 em 990 microlitros de água desionizada ultrapura. Vortex até que o Tween 20 se dissolva completamente. Preparando a solução de trabalho de verde de malaquita com Tween 20.

Adicione o ativador à solução D em uma proporção de um para cem. Preparação do fosfopéptido de treonina. Para preparar uma solução estoque de pT a dois mM, adicione 550 microlitros de água desionizada ultrapura a um miligrama de pT.

Agite em vórtex até que o fosfopeptídeo esteja completamente dissolvido. Coloque em gelo para uso imediato. Armazene alíquotas extras de pT a menos 20 graus Celsius.

Preparação da sinucleína. Reconstitua um miligrama de sinucleína em um mililitro de água ultrapura desionizada, obtendo uma concentração final de um miligrama por mililitro. Agite suavemente em vórtex para dissolver.

Use imediatamente e armazene as alíquotas não utilizadas a menos 80 graus Celsius. Preparação de padrões de fosfato. Primeira etapa da preparação de padrões de fosfato.

Para preparar uma solução estoque de fosfato 1 mM, dissolva o fosfato de potássio em água desionizada ultrapura em um béquer com um bastão de agitação. Transfira para um cilindro graduado e complete o volume final até 100 mililitros. Esta é uma solução 10 mM.

Filtre toda a solução através de um filtro de 22 micrômetros usando uma seringa grande. Dilua isso de 1 para 100 para obter uma solução de fosfato 1 mM a ser usada como padrões para o ensaio. Padrões de fosfato, etapa dois.

Adicione a quantidade apropriada de fosfato mais água desionizada ultrapura a tubos de 1,5 mL conforme a tabela. Isso produzirá tubos com 150, 300, 600, 1.200 e 2.400 pmol de fosfato. Armazene as alíquotas a menos 20 graus Celsius.

Ensaio de atividade da PP2A. Prepare o ensaio da PP2A em tubos de 1,5 mL sobre gelo. Adicione 43 microlitros de tampão pNPP.

Adicione um microlitro de PP2Ac recombinante humano. Adicione sinucleína e incube PP2A mais sinucleína por 30 minutos em um Nutator a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 16 microlitros de pT 2 mM.

Incubar por 10 minutos a 30 graus Celsius em banho-maria. Em uma placa de 96 poços com fundo plano, adicione 25 microlitros de cada padrão de fosfato em duplicata, do mais baixo ao mais alto. Pipete 24 microlitros de cada ensaio de PP2A em duplicata na mesma placa de 96 poços com os padrões.

Pipete 75 microlitros da solução D contendo Tween 20 para cada amostra e padrão. Após a adição de MGT, você observará uma mudança de cor nas cavidades quando fosfatos livres estiverem presentes. Análise fotométrica.

Analisar em um espectrofotômetro ajustado a 630 nanômetros. Resultados representativos. Aqui temos um ensaio representativo de PP2A e o gráfico demonstrando a curva padrão.

À esquerda estão os padrões de fosfato. Quanto mais fosfato os poços contêm, mais escura é a tonalidade de verde. À direita temos a PP2A que foi incubada com sinucleínas alfa, beta ou gama em diferentes concentrações molares.

Concentrações mais elevadas foram mais eficazes na estimulação da atividade da subunidade catalítica da PP2A. Aqui observamos a representação gráfica da atividade da PP2A em resposta a concentrações variáveis de alfa sinucleína, beta sinucleína e gama sinucleína. A alfa sinucleína, a beta sinucleína e a gama sinucleína foram todas estimuladoras significativas da atividade da PP2A na concentração de um a dois micromolares.

Apenas a alfa sinucleína e a beta sinucleína foram estimuladores significativos da atividade da PP2A na concentração de 0,5 micromolar. A figura três mostra a interação da PP2Ac com sinucleínas endógenas no cérebro de camundongo. Em A, as alfa, beta e gama sinucleínas recombinantes são mostradas como controles positivos.

Em B, foi realizada uma co-imunoprecipitação utilizando o anticorpo específico para PP2Ac, 1D6, que precipitou PP2Ac e também precipitou uma quantidade considerável de alfa sinucleína interagente, mas quase nenhuma beta sinucleína. Nenhuma gama sinucleína foi co-precipitada com PP2Ac na co-imunoprecipitação. Esses dados de co-imunoprecipitação sugerem que a alfa sinucleína é o modulador endógeno de PP2Ac in vivo.

Queremos agradecer a todos que nos ajudaram na produção deste vídeo. Assim, em conclusão, esta é Ruth Perez. Sonavarak Lek.

Javier Vargas. Desejando-lhe grande sucesso. Adeus e boa sorte.