Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

O objetivo geral do procedimento de extração sequencial de sal é caracterizar os perfis de ligação de proteínas à cromatina em massa e avaliar como a ligação é alterada quando a proteína, ou seu ambiente, é manipulado. Este método mede a afinidade relativa dos reguladores epigenéticos com a cromatina e pode ser usado para avaliar como essas interações mudam após a manipulação genética, química e ambiental. A principal vantagem dessa técnica é que é uma maneira rápida e barata de avaliar os perfis de ligação de proteínas de ligação à cromatina.

Indivíduos novos no campo da cromatina geralmente lutam com a imunoprecipitação da cromatina, ou ChIP. A extração sequencial de sal é uma técnica antiga que até mesmo cientistas inexperientes podem usar para responder a muitas das mesmas perguntas. Para iniciar o procedimento, colha 8.000.000 células de cada linha celular de interesse.

Lave cada amostra de célula com cinco mililitros de PBS gelado duas vezes. Ressuspenda cada amostra e um mililitro de um tampão hipotônico com inibidores de protease. Transfira as suspensões celulares para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Gire as suspensões, de cima para baixo, por 10 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, centrifugue a suspensão por cinco minutos a essa mesma temperatura a 6.000 G's. Descarte o sobrenadante. Equipe uma micropipeta com uma ponta de um mililitro.

Adicione ao pellet 200 microlitros de tampão ripa modificado sem sal com inibidores de protease. Bata a ponta da pipeta contra o fundo do tubo da microcentrífuga para puxar o pellet para dentro da ponta. Pipete o pellet para cima e para baixo 15 vezes.

A amostra deve ficar espessa e pegajosa à medida que o pellet se quebra. Homogeneizar cada amostra desta forma e incubar as amostras no gelo durante três minutos. Em seguida, centrifugue as amostras a 6500 G's em quatro graus Celsius por três minutos.

Transfira os sobrenadantes para tubos de microcentrífuga limpos de 1,5 mililitro. A cada pellet, adicionar 200 mililitros de tampão ripa modificado com cloreto de sódio 100 milimolar e com inibidores de protease. Pipete o pellet para cima e para baixo 15 vezes.

Se o pellet for inicialmente difícil de puxar para a ponta da pipeta, bata na ponta na parte inferior do tubo. Repita esse processo para cada amostra e incube as amostras no gelo por três minutos. Centrifugue as amostras a 6500 G's em quatro graus Celsius por três minutos.

Transfira os sobrenadantes para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Continue extraindo amostras em soluções tampão ripa modificadas com concentrações crescentes de cloreto de sódio. Quando o pellet não ficar mais no fundo do tubo, coloque o pellet na tampa do tubo da centrífuga antes de decantar o sobrenadante.

Após a extração de sal em série, para cada amostra, adicione 70 mililitros de corante de carga de proteína quatro vezes a cada uma das cinco frações sobrenadantes. Carregue 30 microlitros de cada fração em um gel de acrilamida SDS. Realize um western blot padrão transferindo as proteínas para uma membrana e colorindo com os anticorpos primários apropriados.

Incube a mancha em anticorpos secundários marcados com um corante infravermelho e obtenha uma imagem da mancha. Use um software de análise de imagem para calcular a intensidade da banda de cada concentração de sal. Traçar a intensidade da banda em relação à concentração de sal para determinar o padrão de eluição da proteína em causa.

A extração sequencial de sais das proteínas ARID1a e Polybromo 1 mostrou eluição consistente com concentrações de sal de 200 e 300 milimolares, respectivamente. A extração não sequencial de sais das mesmas proteínas apresentou resultados menos consistentes. O tempo de incubação deve ser otimizado para cada proteína que está sendo examinada.

Assim, o SSE foi usado para examinar os perfis de eluição após comprimentos de incubação variados. Um ativador transcricional, Polybromo 1, mostrou perfis de eluição semelhantes quando incubado por três minutos e 10 minutos. O repressor transcricional, Polycomb Repressive Complex 1, indicado pelo BMI1, precisou de mais de três minutos para ser liberado da cromatina.

As interações proteína-proteína foram investigadas examinando a mudança nos perfis de eluição. Na presença de um inibidor, o bromodomínio contendo a proteína quatro aludiu em concentrações mais baixas de sal do que sem o inibidor. Diferenças nos padrões de histonas foram observadas quando as células foram tratadas com um inibidor da histona desacetilase, alterando a paisagem da cromatina.

Mudanças na ligação às proteínas quando as células sofreram estresse genômico também foram refletidas nos perfis de eluição. Aqui, o aumento na concentração de sal necessária para a eluição sugeriu que o Polybromo 1 se liga mais fortemente à cromatina após danos ao DNA com doxorrubicina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a três horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, lembre-se de ser o mais consistente possível com o tratamento de cada amostra. Este procedimento pode ser usado nas etapas iniciais de um estudo para elucidar o mecanismo e a regulação de uma proteína de ligação à cromatina. Isso economiza tempo e dinheiro em estudos desnecessários de todo o genoma.