Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos
2 de outubro de 2017
Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.
O objetivo geral do procedimento de extração sequencial de sal é caracterizar os perfis de ligação de proteínas à cromatina em massa e avaliar como a ligação é alterada quando a proteína, ou seu ambiente, é manipulado. Este método mede a afinidade relativa dos reguladores epigenéticos com a cromatina e pode ser usado para avaliar como essas interações mudam após a manipulação genética, química e ambiental. A principal vantagem dessa técnica é que é uma maneira rápida e barata de avaliar os perfis de ligação de proteínas de ligação à cromatina.
Indivíduos novos no campo da cromatina geralmente lutam com a imunoprecipitação da cromatina, ou ChIP. A extração sequencial de sal é uma técnica antiga que até mesmo cientistas inexperientes podem usar para responder a muitas das mesmas perguntas. Para iniciar o procedimento, colha 8.000.000 células de cada linha celular de interesse.
Lave cada amostra de célula com cinco mililitros de PBS gelado duas vezes. Ressuspenda cada amostra e um mililitro de um tampão hipotônico com inibidores de protease. Transfira as suspensões celulares para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Gire as suspensões, de cima para baixo, por 10 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, centrifugue a suspensão por cinco minutos a essa mesma temperatura a 6.000 G's. Descarte o sobrenadante. Equipe uma micropipeta com uma ponta de um mililitro.
Adicione ao pellet 200 microlitros de tampão ripa modificado sem sal com inibidores de protease. Bata a ponta da pipeta contra o fundo do tubo da microcentrífuga para puxar o pellet para dentro da ponta. Pipete o pellet para cima e para baixo 15 vezes.
A amostra deve ficar espessa e pegajosa à medida que o pellet se quebra. Homogeneizar cada amostra desta forma e incubar as amostras no gelo durante três minutos. Em seguida, centrifugue as amostras a 6500 G's em quatro graus Celsius por três minutos.
Transfira os sobrenadantes para tubos de microcentrífuga limpos de 1,5 mililitro. A cada pellet, adicionar 200 mililitros de tampão ripa modificado com cloreto de sódio 100 milimolar e com inibidores de protease. Pipete o pellet para cima e para baixo 15 vezes.
Se o pellet for inicialmente difícil de puxar para a ponta da pipeta, bata na ponta na parte inferior do tubo. Repita esse processo para cada amostra e incube as amostras no gelo por três minutos. Centrifugue as amostras a 6500 G's em quatro graus Celsius por três minutos.
Transfira os sobrenadantes para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Continue extraindo amostras em soluções tampão ripa modificadas com concentrações crescentes de cloreto de sódio. Quando o pellet não ficar mais no fundo do tubo, coloque o pellet na tampa do tubo da centrífuga antes de decantar o sobrenadante.
Após a extração de sal em série, para cada amostra, adicione 70 mililitros de corante de carga de proteína quatro vezes a cada uma das cinco frações sobrenadantes. Carregue 30 microlitros de cada fração em um gel de acrilamida SDS. Realize um western blot padrão transferindo as proteínas para uma membrana e colorindo com os anticorpos primários apropriados.
Incube a mancha em anticorpos secundários marcados com um corante infravermelho e obtenha uma imagem da mancha. Use um software de análise de imagem para calcular a intensidade da banda de cada concentração de sal. Traçar a intensidade da banda em relação à concentração de sal para determinar o padrão de eluição da proteína em causa.
A extração sequencial de sais das proteínas ARID1a e Polybromo 1 mostrou eluição consistente com concentrações de sal de 200 e 300 milimolares, respectivamente. A extração não sequencial de sais das mesmas proteínas apresentou resultados menos consistentes. O tempo de incubação deve ser otimizado para cada proteína que está sendo examinada.
Assim, o SSE foi usado para examinar os perfis de eluição após comprimentos de incubação variados. Um ativador transcricional, Polybromo 1, mostrou perfis de eluição semelhantes quando incubado por três minutos e 10 minutos. O repressor transcricional, Polycomb Repressive Complex 1, indicado pelo BMI1, precisou de mais de três minutos para ser liberado da cromatina.
As interações proteína-proteína foram investigadas examinando a mudança nos perfis de eluição. Na presença de um inibidor, o bromodomínio contendo a proteína quatro aludiu em concentrações mais baixas de sal do que sem o inibidor. Diferenças nos padrões de histonas foram observadas quando as células foram tratadas com um inibidor da histona desacetilase, alterando a paisagem da cromatina.
Mudanças na ligação às proteínas quando as células sofreram estresse genômico também foram refletidas nos perfis de eluição. Aqui, o aumento na concentração de sal necessária para a eluição sugeriu que o Polybromo 1 se liga mais fortemente à cromatina após danos ao DNA com doxorrubicina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a três horas se for executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, lembre-se de ser o mais consistente possível com o tratamento de cada amostra. Este procedimento pode ser usado nas etapas iniciais de um estudo para elucidar o mecanismo e a regulação de uma proteína de ligação à cromatina. Isso economiza tempo e dinheiro em estudos desnecessários de todo o genoma.
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Visão Geral
O procedimento de Extração Sequencial com Sal é projetado para caracterizar perfis de ligação proteica à cromatina em massa e avaliar como essas ligações são alteradas por diversas manipulações. Este método é particularmente útil para avaliar a afinidade de reguladores epigenéticos pela cromatina.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia da cromatina
- Interações proteicas
- Epigenética
Antecedentes
- A Extração Sequencial com Sal é uma técnica para estudar proteínas que se ligam à cromatina.
- Oferece uma alternativa rápida e econômica à imunoprecipitação da cromatina (ChIP).
- Este método é acessível mesmo para cientistas inexperientes.
- Permite a avaliação de como as interações proteicas mudam com fatores genéticos, químicos e ambientais.
Objetivo do Estudo
- Caracterizar os perfis de ligação de proteínas ligadoras de cromatina.
- Avaliar os efeitos de diversas manipulações sobre a ligação proteica.
- Fornecer um método simples para pesquisadores na área de cromatina.
Métodos Utilizados
- Coleta de 8.000.000 de células de cada linhagem celular de interesse.
- Extração sequencial com sal para isolamento de proteínas ligadas à cromatina.
- Avaliação da afinidade de ligação de proteínas à cromatina.
- Avaliação de alterações nos perfis de ligação sob diferentes condições.
Resultados Principais
- O método caracteriza efetivamente os perfis de ligação proteica.
- Ele demonstra como as afinidades de ligação podem ser alteradas por fatores ambientais.
- Os resultados indicam a utilidade desta técnica tanto para pesquisadores experientes quanto para iniciantes.
- Fornece insights sobre as interações dos reguladores epigenéticos com a cromatina.
Conclusões
- A extração sequencial com sal é uma ferramenta valiosa para o estudo das interações da cromatina.
- O método é eficiente e acessível para diversas aplicações de pesquisa.
- Ele aprimora a compreensão da dinâmica de ligação proteica na biologia da cromatina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A Extração Sequencial com Sal (SSE) fornece um método rápido e econômico para avaliar a afinidade de proteínas ligadoras de cromatina, permitindo a validação precoce de alvos na descoberta de fármacos com foco em epigenética. Ao quantificar como perturbações genéticas, químicas ou ambientais alteram as interações entre proteínas e cromatina, a SSE auxilia na desmistificação mecanicista de complexos modificadores de cromatina antes de se comprometer com ensaios que consomem muitos recursos. Essa abordagem melhora a confiança preditiva na identificação de compostos líderes ao distinguir efeitos diretos de ligação de respostas celulares indiretas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Mede as alterações relativas na afinidade de ligação quando subunidades do complexo são perdidas ou domínios são inativados, esclarecendo as contribuições funcionais de proteínas individuais no engajamento com a cromatina.
- Valor Científico: Perfila padrões de eluição sob concentrações crescentes de sal para diferenciar a ligação específica à cromatina de associações inespecíficas, reduzindo falsos positivos na validação de alvos.
- Valor Operacional: Permite que não especialistas gerem dados quantitativos de ligação sem expertise especializada em ChIP, acelerando testes iniciais de hipóteses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera perfis de eluição reprodutíveis que servem como leituras quantitativas para triagem de efeitos de compostos sobre alterações na paisagem da cromatina.
- Valor Operacional: Utiliza infraestrutura padrão de western blot e análise de imagem, facilitando a padronização do ensaio entre laboratórios e reduzindo a variabilidade técnica.
- Valor Operacional: Exige apenas equipamentos básicos de centrifugação e eletroforese, reduzindo as barreiras para adoção em cascatas de triagem de moduladores epigenéticos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona alterações no ambiente da cromatina (por exemplo, por meio de inibidores de HDAC) a mudanças no acoplamento de proteínas, apoiando estudos mecanicistas alinhados a biomarcadores em sistemas relevantes para doenças.
- Valor Científico: Avalia mudanças no acoplamento sob estresse genômico (por exemplo, danos no DNA induzidos por doxorrubicina), fornecendo subsídios para modelos preditivos do engajamento de alvos em condições fisiopatológicas.
- Valor Operacional: Complementa ensaios celulares e bioquímicos ao fornecer validação ortogonal da continuidade das interações com a cromatina, desde a fase de descoberta até as etapas pré-clínicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A SSE se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, oferecendo uma conexão mecanicista entre ensaios bioquímicos de ligação e leituras fenotípicas celulares em programas de epigenética.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao quantificar como alterações complexas afetam a ligação à cromatina, permitindo a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos de alvos epigenéticos.
- Triagem: Fornece perfis de eluição dependentes de sal como saídas quantitativas para comparar alterações no estado da cromatina induzidas por compostos entre campanhas de triagem.
- Análises: Gera dados de intensidade de banda plotados em função da concentração de sal, fornecendo desvios calculáveis na afinidade de ligação que orientam discussões sobre relações estrutura-atividade.
- Pesquisa Translacional: Conecta alterações na ligação in vitro a modificações na paisagem da cromatina celular, apoiando o alinhamento de biomarcadores translacionais quando combinado com leituras funcionais.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade padronizada e de baixo custo aplicável a múltiplos alvos de cromatina, promovendo a reutilização da plataforma em pipelines de descoberta de fármacos epigenéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao distinguir a ligação direta à cromatina de efeitos celulares indiretos por meio da eluição controlada com sal.
- Valor Operacional: Fornece perfis de ligação quantitativos e reprodutíveis utilizando equipamentos de laboratório amplamente disponíveis, melhorando a padronização entre equipes.
- Valor Estratégico: Reduz a dependência de ChIP de baixo rendimento para avaliações iniciais de ligação, melhorando a eficiência do capital em projetos iniciais de epigenética.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de complexos modificadores da cromatina com base na resistência quantitativa da ligação frente a perturbações ambientais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em bioquímica da cromatina e na quantificação de western blot para garantir a interpretação precisa do perfil de eluição.
- Depende do acesso a centrífugas refrigeradas, tubos de microcentrífuga e instrumentação padrão de SDS-PAGE/western blot.
- Necessita de protocolos padronizados de colheita e lise celular para minimizar a variabilidade entre amostras e assegurar resultados comparáveis nas extrações com sal.
- Envolve a otimização dos tempos de incubação para cada proteína-alvo, já que a cinética de liberação da ligação varia entre os complexos modificadores da cromatina.
- Limita-se a comparações relativas de afinidade; constantes absolutas de ligação exigem métodos biofísicos complementares para validação.
