Name: Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a gerar organoides cerebrais humanos derivados de iPSC para modelar distúrbios do neurodesenvolvimento precoce, incluindo microcefalia. Este método robusto oferece resultados reprodutíveis para estudar neurogênese.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Somos gratos à facilidade de incorporação do tecido e da instalação do núcleo microscópio de CMMC. Estamos gratos pelas discussões e suporte técnico fornecido pelos membros do Laboratório de centrossoma e citoesqueleto Biology. Agradecemos Li Ming Gooi pela revisão do manuscrito.

1. Geração de Cérebro Organóides (23 dias) <ol><li> Iniciação de neuroectoderme (5 dias) Nota: Os seguintes pontos devem ser considerados antes do início da diferenciação. O método de reprogramação (lentiviral- etc, à base de microARN Sendai-a vírus, episomal-, OR) para obter iPSCs humanos devem, idealmente, ser o mesmo para todos os pacientes e controlar linhas IPSC. Vários kits de reprogramação e instruções baseadas em protocolos publicados estão disponíveis 15, 16, 17, 18. A qualidade das linhas de IPSC humanos é a chave para realizar uma diferenciação óptima. Monitorar colónia e morfologia das células com um microscópio e validar pluripotência, testando a expressão de marcadores, tais como OCT3 / 4, Nanog, ou TRA-1-60. <ol><li> iPSCs cultura humanos sob condições isentas de alimentação em meio A em um prato revestido com Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz. NOTA: Cresça iPSCs humanos e para manter uma condição de cultura definido e para evitar um passo adicional para a remoção de células de alimentação de rato embrionários (MEFs) antes do início da diferenciação sem soro livre de alimentador. O número de passagem óptima para iPSCs humanos para iniciar gamas de diferenciação a partir da passagem 15 em cima de reprogramação a passagem 70, no total. Quando passaging, separar colónias hiPSC como células agregação utilizando uma solução de separação celular apropriado com baixo esforço mecânico e uma pipeta serológica 2-mL para transferir agregados a um novo prato. Evitar a dissociação de células individuais, como este pode induzir a diferenciação e apoptose na maioria das linhas IPSC. Foi relatado que a longo prazo, a passagem de célula única poderiam aumentar alterações genómicas em iPSCs humano 19, 20. Evitar procedimentos de destacamento das células, as quais requerem um passo de centrifugação para remover a solução de desprendimento, pois isso reduz a viabilidade global de iPSCs. Testetodas as culturas para contaminações microbianas, particularmente micoplasma, em uma base regular, pois isso pode alterar a qualidade das iPSCs e sua capacidade de diferenciação. <ol><li> O revestimento de um tecido 60 milímetros prato de cultura com matriz EHS de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Descongelar uma aliquota de 1 x 10 6 iPSCs humanos. Semear as iPSCs em uma placa de cultura de tecidos de 60 mm revestidas com matriz EHS e contendo 5 mL de meio A (ver a Tabela Materiais). Alterar a forma e diariamente após a passagem de 5 a 7 dias, quando as células atingem ~ 80% de conflucia. NOTA: Passagem das iPSCs descongeladas a 80% de confluência utilizando métodos padrão, tais como o descolamento isenta de enzima de colónias de 21, pelo menos uma vez antes de iniciar a diferenciação. Em breve, remover o meio CIPS, lave as células uma vez com pré-aquecida até 37 Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ° C: Mistura de Nutrientes F12 (DMEM / F12), e incuba-se as iPSCs seguindo o fabricante deinstruções usando o reagente A (ver a tabela de materiais). Não exceda o tempo de incubação recomendado para evitar a dissociação de células individuais. iPSCs humanos deve ser destacado e que flutua na forma de agregados, as células não é tão simples. Eles podem então ser transferidas para novas placas revestidas com matriz de EHS; por exemplo, iPSC agrega a partir de um prato de 60 mm pode ser distribuído a 4 novos pratos de 60 mm. </li><li> Verifique para micoplasma com um kit de detecção de micoplasma de acordo com as instruções do fabricante. Use iPSCs única isentos de micoplasma, como micoplasma pode alterar a capacidade de diferenciação iPSCs. </li></ol></li><li> Dissociar iPSCs (80% confluentes) e preparar uma suspensão de célula única usando o reagente B. <ol><li> Lavam-se as iPSCs uma vez com pré-aquecido (37 ° C) de DMEM / F12. </li><li> Adicionar pré-aquecido reagente B (por exemplo, 1 ml de uma placa de 60 mm) e incuba-se as iPSCs durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Flick 20 vezes com a ponta dos dedos sobre o lado inferior e deo prato para separar as iPSCs. Entrada para o destacamento de células sob o microscópio. </li><li> Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo no prato 5 vezes com uma micropipeta 1 ml. </li><li> Adicionar 3 ml de meio A para diluir 1 mL de reagente B e recolher a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL. </li><li> Suavemente girar para baixo as iPSCs (500 xg) durante 4 min temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio B e contar o número de células com um hemocitómetro. NOTA: Lembre-se de utilizar apenas meio B para a ressuspensão. Evitar o uso de meio A, uma vez que contém uma muito alta concentração de bFGF, que pode inibir a diferenciação. </li></ol></li><li> Dilui-se a suspensão de células a 4,5 x 10 5 culas por ml em meio B suplementado com 10 ^ M-rho associado inibidor de proteína cinase (Y-27632). </li><li> Adicionar 100 por po de uma forma não-aderente, de fundo em v, placa de 96 poços. NOTA: Certifique-se as células são igualmente distribuídos no SUSpensão por agitação do tubo de cada vez para retirar porções de 100 uL. É importante que cada cavidade deve conter um número de células equivalente, a fim de obter neuroesferas homogéneas em tamanho e forma (redondos, superfícies definidas). </li><li> Suavemente girar para baixo a placa com as células a 500 xg e a temperatura ambiente durante 3 min e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Mudar a forma diariamente através da remoção de 50 mL e adicionar 50 mL de meio fresco B em cada cavidade para os próximos 5 dias. </li></ol></li></ol> 2. Incorporação de neuroesferas em EHS Matriz (4 dias) <ol><li> Preparar o meio neuroesfera por mistura do seguinte: uma mistura de DMEM / F12 e meio C (v / v), 1:: 200 (v / v) suplemento 1, 1: 1 100 (v / v) suplemento 2 sem (w / o) A vitamina A, 1: 100 de L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos não essenciais (MEM), 100 U / mL de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1,6 g / l de insulina, e mM β-mercaptoetanol 0,05. </li><li> Recolher o wit neurospheresha 200 mL micropipeta com uma ponta ~ 2 milímetros previamente cortado com tesoura estéreis. </li><li> Coloque as neuroesferas aproximadamente 5 mm de distância umas das outras no filme de parafina (3 x 3 cm2) numa placa vazia 100 mm e remover cuidadosamente tanto do meio restante quanto possível. </li><li> Adicionar uma gota (7 uL) de matriz para cada EHS único neuroesfera. </li><li> Incubar a matriz EHS gotas com as neuroesferas durante 15 minutos em uma incubadora. </li><li> Lavam-se as neuroesferas cuidadosamente a partir da película de parafina por rubor-los com meio neuroesfera. Para lavar, usar uma micropipeta 1 ml e um novo 100 milímetros placa de Petri contendo 10 ml de meio de neuroesfera. </li><li> Incubar as neuroesferas para os 4 dias seguintes e adicionar 2 mL de meio fresco neuroesfera no dia 2. NOTA: Certifique-se de que as prateleiras na incubadora são planas para que os neurospheres incorporado de matriz EHS não vai se aglutinarem em um lado do prato. </li></ol> 3. Organóides numa suspensão rotativaCultura (14 dias) <ol><li> Prepare cérebro médio organï¿½de por mistura do seguinte: uma mistura de DMEM / F12 e meio C (v / v), 1:: 200 (v / v) suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento de 2 W / o um A vitamina A, 1: 100 de L-glutamina, MEM 0,05 mM, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, 0,5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542, e mM β-mercaptoetanol 0,05. </li><li> Adicionar 100 mL de cérebro organï¿½de meio a cada bal rotativo através dos seus braços laterais e colocá-los em uma incubadora para o pré-aquecimento durante pelo menos 20 min. </li><li> Defina-se um programa de agitação a 25 rpm, de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: Antes de transferir os neurospheres incorporado de matriz EHS em frascos spinner, certifique-se que todos eles estão separados. Se dois ou mais estão ligados através da matriz de EHS, separá-los por corte da matriz de ligação com um bisturi. </li><li> transferir cuidadosamente as neuroesferas incorporado-matriz EHS em frascos de agitação contendo 100 mL de meio nos organï¿½deing uma pipeta serológica 2 mL. Utilizar os braços laterais do balão rotativo para transferir as neuroesferas para o balão. </li><li> Colocar os frascos rotativos numa plataforma de agitação magnética numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2; este é dia 0 da cultura organóides. </li><li> Alterar o meio de uma vez por semana (ou mais frequentemente quando há uma mudança de cor), removendo metade do meio e adicionando a mesma quantidade de meio fresco. NOTA: Quando tirar os frascos spinner fora da incubadora, espere 3-5 minutos para permitir que os Organóides afundar até o fundo do frasco. Remover o meio, colocando a ponta da pipeta de vidro (ligada a uma bomba) sobre a superfície do líquido; Aspirar o meio cuidadosamente através de uma abertura lateral / braço do balão. Estas manipulações deve ser feito sob a capa laminar. </li></ol> 4. Análise do cérebro Organóides <ol><li> Fixação de Organóides <ol><li> Recolher os Organóides no dia 14 de cultura o wi bal rotativoth um corte de 1 mL micropipeta (corte a 5 mm). Coloque todos eles em um prato de 60 mm, e lavá-los uma vez com 5 mL de DMEM morno / F12, durante 3 min. </li><li> Preparar um tubo de 1,5 mL com 500 uL de paraformaldeído a quente 4% (PFA). Cuidado: use pele e proteção para os olhos e trabalhar sob um capuz de segurança ao manusear PFA fixador. </li><li> Colocar cada organï¿½de separadamente em cada tubo e corrigi-los por pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Não corrigir os Organóides por mais de 60 min. Para mover os Organóides, utilizar uma ansa de inoculação ou qualquer outro conceber que é conveniente. </li><li> Remover o PFA e lavar os Organóides fixas duas vezes durante 10 minutos cada um com 1 mL de PBS. </li><li> Armazenar os Organóides em 1 ml de PBS a 4 ° C durante até 7 dias, até à sua utilização. </li></ol></li><li> Incorporar os Organóides para cryosectioning <ol><li> Remover o PBS e adicionar 1 ml de sacarose a 30% em solução de água destilada por cada tubo para desidratar os Organóides antes cryofreezing-los; após a adição sucrosolução si, os Organóides deve ser flutuante na superfície. Armazenar os Organóides durante a noite em solução de sacarose a 4 ° C; no dia seguinte, as Organóides deve ter afundado até o fundo do tubo. NOTA: Organóides pode ser armazenado durante até 3-5 dias a 4 ° C numa solução de sacarose, se necessário. </li><li> Encher um molde de espécime de vinilo com 400 uL de temperatura de corte óptima composto (OCT) e utilizar uma ansa de inoculação a colocar um organóide no centro do molde. Rotular o aro do molde com o nome da amostra. </li><li> Congelar o molde contendo organï¿½de-se a -80 ° C até cryosectioning. </li><li> cryoslides vidro do revestimento com 0,1% de solução de lisina de poli-L-(PLL) em PBS durante 5 min à temperatura ambiente e deixar secar as lâminas durante 3 h. Armazenar os slides a 4 ° C e aquecê-los até temperado ambiente antes do uso. NOTA: PLL-revestimento é um passo importante, uma vez que irá evitar que as fatias de organï¿½de flutuando para longe. Recolha e armazenamento da solução de PLL, a 4 ° C durante até 3meses. Antes de reutilização, filtra-se com uma seringa de 0,22 um e deixe aquecer até à temperatura ambiente. </li><li> Organóides secção cryofrozen em fatias 20-50 um de espessura em um vidro revestido de PLL-cryoslides 22. Deixe as lâminas com as secções secar durante 1 h à temperatura ambiente. Armazenar as secções a -80 ° C até processamento adicional. </li></ol></li></ol> 5. imunofluorescência Coloração de secções organóides NOTA: Para a caracterização geral de Organóides, coloração com a nestina, um marcador de células progenitoras neurais, e TUJ1, um marcador pan-neuronal, é recomendado. Como exemplos adicionais, a coloração imunofluorescente com fosfo-vimentina (p-Vim), os marcadores de células gliais radiais apicais mitóticos, e Arl13b, para cílio, são descritos. Para testar a apoptose, utilizar o ensaio terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP Nick-End Rotulagem (TUNEL). Colocar as lâminas em uma caixa de plástico durante as incubações para protegê-los da poeira, luz,e secar. <ol><li> Descongelar as lâminas durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com 200 ul de PBS-glicina (0,225 g de glicina em PBS) durante 3 minutos para extinguir a autofluorescência induzida PFA. </li><li> Permeabilizar as secções com 200 uL de 0,5% de Triton X100 a 0,1% / tween em solução de PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar duas vezes com 200 uL de solução de PBS-glicina durante 3 min. </li><li> Incubar deles com 200 uL de 0,5% de gelatina de peixe / 0,1% de Triton X100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C para bloquear a ligação não específica de antigénio. NOTA: Se um ensaio de TUNEL for necessário, realizar o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante. Comece com o ensaio TUNEL antes de realizar a imunocoloração, como ele pode interferir com os anticorpos secundários e extinguir fluoróforos quando utilizado posteriormente. </li><li> Dilui-se os anticorpos em solução com as seguintes concentrações de bloqueio: nestina, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; e anticorpos secundários, 1: 1.000. </li><li> Incubar com 200 uL do primeiro anticorpo primário (por exemplo, nestina) durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Dilui-se a primeira (anti-ratinho 488) Anticorpo secundário 1: 1000 em solução de bloqueio e incubar a corrediça em 200 ul durante 1-2 h à temperatura ambiente. De agora em diante, sempre proteger os slides da luz. </li><li> Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Incubar com 200 uL do anticorpo primário ao lado (por exemplo, TUJ1) durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Adicionar 200 uL da próxima anticorpo secundário (anti-coelho de 647) durante 1-2 h à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 x 3 min. com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Adicionar 200 uL de 4&#39; , 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a uma conc nM 30entration em PBS durante 15 min à temperatura ambiente para coloração nuclear. </li><li> Lavar 2 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio. </li><li> Lavar 1 x 1 min com 200 mL de água destilada e deixar as secções secar durante 10-20 minutos, até que nenhuma gota de água é óbvia visível mais. </li><li> Montar as secções com meio de inclusão. Armazená-los ao abrigo da luz a 4 ° C durante até várias semanas. </li><li> Prosseguir com a análise microscópica para a imagem uma visão geral da zona organóides, ventricular, placa cortical primitiva, e outras áreas de interesse. </li><li> Usar um microscópio confocal com um óleo de 63X filtros objectivos e fluorescentes, escolhido de acordo com os anticorpos secundários etiquetados com corante fluorescente utilizado 1, 10. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

MCPH é um distúrbio neurológico humano complexo que não pode ser recapitulado em modelos animais in vivo, ou em cultura de células humanas simples abordagens in vitro. A manifestação clínica da MCPH começa a aparecer durante o primeiro trimestre, quando no início neurogênese começa. Assim, Organóides cerebrais 3D representam um sistema experimental confiável para modelar desenvolvimento MCPH. Além disso, 3D Organóides cérebro humano são uma abordagem ideal uma vez que i) que permita a adaptação de um e...

desordens do neurodesenvolvimento, tais como humanos, microcefalia, só pode ser pobremente estudado em modelos animais, devido ao facto de que os cérebros humanos têm uma superfície cortical estendida, uma característica única que difere a partir de animais não-humanos. Este aspecto torna o desenvolvimento do cérebro humano de um processo complexo que não pode ser suficientemente estudado num 2D, no sistema de cultura de células in vitro. Emergentes técnicas de cultura 3D permitem a geração de Organóides de tecido semelhante a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). A diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes numa cultura em suspensão em 3D permite a formação de vários tipos de células de uma maneira atempada e específico de região, dando origem a, um tecido organizado estratificada 1, 2, 3. Graças a laboratórios que foram pioneiros tecnologias de cultura 3D e desmistificadas a complexidade da formação de órgãos, começando a partir de células estaminais,foi desenvolvido um método robusto de gerar Organóides cerebrais para delinear eventos precoces do desenvolvimento do cérebro humano e para modelar microcefalia in vitro 1, 2, 3. É digno de nota que nós adaptamos o método original desenvolvido por Lancaster et al. para gerar Organóides cerebrais 1. Este método foi modificado de acordo com as necessidades experimentais. O objectivo de um estudo de Gabriel et al. foi analisar os mecanismos celulares e moleculares da manutenção de células estaminais neurais durante o desenvolvimento do cérebro. A fim de fazer isso, um estudo mecanicista foi realizada através da análise de células progenitoras neurais (NPCs) em Organóides cerebrais 3D derivadas de um paciente microcefalia 4. Este paciente levou uma mutação em CPAP, uma proteína conservada centrosomal necessário para a biogénese centrossoma 5. Uma hipoglicemia amplamente aceitotese é que microcefalia é o resultado de um esgotamento do pool de NPC, e isto pode ser devido tanto a morte celular ou a diferenciação precoce 1, 6, 7, 8, 9. Ao analisar as zonas ventriculares (vzs) de Organóides cerebrais microcefalia, mostrou-se que um número significativo de NPCs sofrem divisão celular assimétrica, ao contrário Organóides cerebrais derivadas de um dador saudável 4. Análises microscópicas e bioquímicas extensas de Organóides cerebrais microcéfalos revelou um papel inesperado para CPAP em cílios oportuna desmontagem 4. Especificamente, CPAP mutado está associada com a desmontagem cílio retardado e a re-entrada do ciclo celular retardada, levando à diferenciação precoce de NPCs 4. Estes resultados sugerem um papel para cílios em microcefalia e thenvolvimento eir durante a neurogênese e tamanho do cérebro de controle 10. A primeira parte deste protocolo é uma descrição de um método de três passos para gerar Organóides cerebrais homogéneas. Como mencionado anteriormente, o protocolo Lancaster original foi adaptado e modificado para se adequar a uma finalidade. Em primeiro lugar, iPSCs humanos são cultivados num estado livre de alimentador definido em Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz. Este passo evita as variações de culturas de culas estaminais pluripotentes dependente de alimentação. Neste protocolo, a indução de diferenciação neuronal para formar epitélio neural começa directamente a partir iPSCs. Por saltando a etapa de formação de corpos embrióides (EB), os rendimentos de diferenciação neuronais de uma maneira mais controlada e orientada. Esta abordagem limita a formação espontânea e não-dirigida de outras camadas de células germinais, tal como mesoderme e endoderme. Ao aplicar este protocolo, neuroesferas contendo rosetas neurais podem ser colhidas no dia 5 para EHS incorporação matriz e cultura de suspensão estacionária. O meio utilizado para o organóide terceiro passo do nosso protocolo é suplementado com dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin é um inibidor de molécula pequena de proteína morfogénica do osso (BMP), e SB431542 inibe a via do TGFp / activina / nodal sinalização. A combinação destes factores poderia promover a diferenciação neuronal de forma mais eficiente do que o ácido retinóico sozinho 11, 12, 13, 14. Em conjunto, estas alterações permitem que a geração reprodutível de Organóides cerebrais, com variações mínimas através Organóides. Importante, este método foi aplicado para gerar robustamente Organóides cerebrais microcéfalos de iPSCs paciente, que transportam mutaes nos genes que afectem centrossomas e dinâmica do ciclo celular. A segunda parte deste protocolo dá instruções para preparar brain Organóides para a análise e interpretação dos defeitos celulares em microcefalia. Isto inclui a fixação, cryosectioning, coloração de imunofluorescência, e análise microscópica confocal. Este protocolo irá fornecer ao leitor uma descrição detalhada dos resultados previstos e com orientação para interpretação.

<table><tbody><tr><td>Anti-camundongo 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>IgG anti-camundongo de cabra (H+L) Anticorpo secundário, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-coelho 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>IgG de cabra anti-coelho (H+L) Anticorpo secundário, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B anticorpo policlonal de coelho&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema CELLSPIN</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato; vários fornecedores</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mistura de Nutrientes F-12&nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Composto C; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Meio de incorporação</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; meio de incorporação; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Matriz Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matriz qualificada por hESC; importante: Gelatina de peixe qualificada por hESC</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatina de pele de peixe de água fria; vários fornecedores; autoclave após adicionar ao PBS para dissolver e esterilizar, armazenar a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine para biologia molecular; vários fornecedores&nbsp;</td></tr><tr><td>Alça de inoculação com agulha, descartável (1 &micro; L)</td> <td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>fornecedores múltiplos&nbsp;</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>I3536-100MG</td><td>vários fornecedores</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco, EUA</td><td>25030081</td><td>L-glutamina (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (meio hiPSC)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>#05835</td><td>Meio de indução neural (NIM); meio de diferenciação neural</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Meio Basal Neural</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, solução de</td><td></td><td>aminoácidos não essenciais MEM dos EUA 11140035 (100x)</td></tr><tr><td>Kit de detecção de micoplasma MycoAlert</td><td>Lonza, Suíça</td><td>#LT07-218</td><td>Kit de detecção de micoplasma; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo Nestin (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% em PBS, solução de loja em -20 & C; Cuidado: Use proteção para a pele e os olhos e trabalhe sob o capuz&nbsp;</td></tr><tr><td>Comprimidos PBS</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>Veja o fabricante&acute; s instruções; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>Solução de poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Fosfo-Vimentina (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagente A&nbsp;</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td># 05872</td><td>Nota ao Protocolo 1.1.1.2; ReLSR (reagente de seleção e passagem de células ES e iPS humanas livres de enzimas); Por favor, siga o fabricante&acute; s protocolo; produtos alternativos de vários fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>Reagente B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>A6964-100ML</td><td>A solução Accutase é uma solução enzimática para dissociação de célula única; vários fornecedores; protocolo 1.1.2 "solução de dissociação de células enzimáticas" &nbsp;</td></tr><tr><td>Pesquisa Criostato Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>Frasco giratório 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus lâminas de microscópio</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>As lâminas devem ser rotuladas com um "+" e carregadas positivamente</td></tr><tr><td>Suplemento 1</td><td>Gibco, suplemento US</td><td>17502048</td><td>N-2 (100x)</td></tr> <tr><td>Suplemento 2 sem Vitamina A</td><td>Gibco, suplemento US</td><td>12587010</td><td>B-27 (50x), menos vitamina A; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&beta;-Tubulina III (coelho policlonal)</td></tr><tr><td>Ensaio TUNEL</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Tween 20 para biologia molecular</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>de folha à prova d'água</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilme " M&rdquo;; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inibidor (Y-27632 2HCL); vários fornecedores</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco, EUA</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoetanol (50 mM); vários fornecedores</td></tr></tbody></table>

geração de ipsc-derivado do cérebro organóides humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

A disponibilidade restrita de modelos in vitro adequados que podem representar de forma confiável o desenvolvimento complexo do cérebro humano é um gargalo significativo que limita a tradução da pesquisa básica do cérebro em aplicação clínica. Embora as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) tenham substituído as células-tronco embrionárias humanas eticamente questionáveis, os estudos de diferenciação neuronal baseados em iPSC permanecem descritivos no nível celular, mas não fornecem adequadamente os detalhes que poderiam ser derivados de um complexo tecido cerebral humano 3D. 
Essa lacuna agora é preenchida por meio da aplicação de organoides cerebrais 3D derivados de iPSC, "Cérebros em um prato", que modelam muitas características do desenvolvimento complexo do cérebro humano. Aqui, é descrito um método para gerar organoides cerebrais 3D derivados de iPSC. Os organoides podem ajudar a modelar a microcefalia primária autossômica recessiva (MCPH), um distúrbio raro do neurodesenvolvimento humano. Uma explicação amplamente aceita para a malformação cerebral no MCPH é o esgotamento do pool de células-tronco neurais durante os estágios iniciais do desenvolvimento do cérebro humano, um defeito de desenvolvimento que é difícil de recriar ou provar in vitro. 
Para estudar o MCPH, geramos iPSCs a partir de fibroblastos derivados de pacientes portadores de uma mutação na proteína centrossomal CPAP. Ao analisar a zona ventricular dos organoides cerebrais 3D de microcefalia, mostramos a diferenciação prematura dos progenitores neurais. Esses organoides cerebrais 3D são um poderoso sistema in vitro que será fundamental na modelagem de distúrbios cerebrais congênitos induzidos por produtos químicos neurotóxicos, infecções virais neurotróficas ou mutações genéticas hereditárias.

A geração de Organóides cerebrais requer pelo menos três semanas de cultura contínua (Figura 1A). Para conseguir resultados reproduzíveis, recomendamos que o pesquisador documenta cada passo e, sobretudo, evita quaisquer alterações em relação componentes do meio, pontos de tempo e manipulação de célula. Aqui, damos um resumo de como avaliar se marcos críticos são atingidos a fim de obter Organóides de qualidade suficiente no final do experimento. A formação de neuroesfer...

A modelagem do desenvolvimento do cérebro humano foi prejudicada devido à complexidade sem precedentes do tecido epitelial neural. Aqui, é descrito um método para a geração robusta de organoides cerebrais para delinear eventos iniciais do desenvolvimento do cérebro humano e modelar a microcefalia in vitro.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

O objetivo geral deste protocolo para a geração de organoides cerebrais humanos derivados de iPSCs é modelar distúrbios neurodesenvolvimentais humanos precoces. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento cerebral humano, como o papel dos sintesomas e dos cílios na neurogênese e na microcefalia primária. A principal vantagem desta técnica é que ela constitui um modelo robusto e rápido para obter resultados reprodutíveis a partir de organoides cerebrais derivados de iPSCs de pacientes.Demonstrará o procedimento Elke Gabriel, pós-doutoranda do meu laboratório no Centro de Medicina Molecular, Colônia. Para iniciar este procedimento, colete as neuroesferas com uma micropipeta de 200 microlitros utilizando uma ponteira de dois milímetros previamente cortada com tesoura estéril. Em seguida, coloque as neuroesferas a aproximadamente cinco milímetros de distância umas das outras sobre uma película de parafina em uma placa de 100 mililitros.E remova cuidadosamente o máximo possível do meio remanescente. Em seguida, adicione uma gota de matriz EHS sobre cada neuroesfera individual. Incube as gotas de matriz EHS com as neuroesferas por 15 minutos a 37 graus Celsius.Depois disso, lave cuidadosamente as neuroesferas do filme de parafina lavando-as com meio para neuroesferas. Posteriormente, incube as neuroesferas pelos próximos quatro dias e adicione dois mililitros de meio fresco para neuroesferas no segundo dia. Neste procedimento, adicione 100 mililitros de meio para organoides cerebrais a cada frasco agitador através de seus braços laterais.Pré-aqueça o meio no incubador a 37 graus Celsius por pelo menos 20 minutos. Em seguida, certifique-se de que as neuroesferas estejam todas separadas. Se duas ou mais estiverem conectadas através da matriz EHS, separe-as cortando a matriz de conexão com um bisturi.Configure um programa de agitação a 25 RPM. Transfira cuidadosamente as neuroesferas embutidas na matriz EHS para os frascos agitadores contendo 100 mililitros de meio de organoides. Em seguida, posicione os frascos agitadores sobre uma plataforma de agitação magnética no incubador por 14 dias a 37 graus Celsius.Este é o dia zero do cultivo de organoides. Troque o meio uma vez por semana, removendo metade do meio e adicionando a mesma quantidade de meio fresco. Nesta etapa, colete os organoides do cultivo em frasco agitador no dia 14 com uma micropipeta pré-cortada de um mililitro.Coloque todos em uma placa de 60 milímetros e lave-os uma vez com cinco mililitros de DMEM F12 morno durante três minutos. Em seguida, prepare um tubo de 1,5 mililitro com 500 microlitros de PFA a 4% morno. Coloque cada organoide separadamente em cada tubo e fixe-os por 30-60 minutos à temperatura ambiente.Posteriormente, utilize um alça de inoculação para remover os organoides. Em seguida, remova o PFA e lave os organoides fixados duas vezes, por 10 minutos cada vez, com um mililitro de PBS. Posteriormente, armazene os organoides em um mililitro de PBS a quatro graus Celsius por até 7 dias para uso posterior.Para embutir os organoides para crio-seccionamento, remova o PBS e adicione 1 mililitro de solução de sacarose a 30% em cada tubo para desidratar os organoides antes de criopreservá-los. Após a adição da solução de sacarose, os organoides devem flutuar na superfície. Armazene os organoides durante a noite na solução de sacarose a quatro graus Celsius.No dia seguinte, os organoides deverão ter afundado até o fundo do tubo. Em seguida, preencha uma forma de espécime de vinil com 400 mililitros de composto OCT. E utilize um alça de inoculação para posicionar um organoide no centro da forma.Rotule a borda do molde com o nome da amostra. Em seguida, congele o molde contendo os organoides a menos 80 graus Celsius até o corte criostático. Posteriormente, recubra as lâminas de vidro criostáticas com PLL 0,1% e PBS por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, deixe as lâminas secarem por três horas. Armazene as lâminas a quatro graus Celsius e aqueça-as até a temperatura ambiente antes do uso. Após isso, seccione os organoides congelados em cortes com espessura de 20 a 50 micrômetros nas lâminas de vidro revestidas com PLL.Deixe as seções secarem por uma hora à temperatura ambiente e armazene-as a menos 80 graus Celsius até o processamento posterior. Imagem imunofluorescente de organoides crioseccionados exibindo uma zona ventricular típica e a placa cortical primitiva. A zona ventricular estende-se do lado apical ao lado basal.Observe que as células dentro da zona ventricular exibem núcleos dispostos em palissada, sugerindo que são células gliais radiais. O painel direito mostra a coloração por imunofluorescência de NPCs positivas para nestina dentro da zona ventricular e neurônios positivos para TUJ1 na placa cortical primitiva. São apresentados aqui dois exemplos de zonas ventriculares coradas com PVIM e ARL 13B.As regiões marcadas por quadrados brancos estão ampliadas. Células gliais radiais apicais que se dividem no lado apical da ZV são positivas para PVIM. O plano de divisão de uma célula em anáfase é horizontal em relação à linha da superfície do lúmen, que é marcada pela coloração de ARL 13B.Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 23 dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de realizar verificações periódicas de qualidade e de microplasma nas culturas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de desenvolvimento em neurobiologia explorarem os mecanismos do neurodesenvolvimento em organoides cerebrais humanos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar organoides cerebrais humanos a partir de diversas linhagens celulares de iPSC, incluindo linhagens celulares de pacientes com funções celulares comprometidas.

generation-ipsc-derived-human-brain-organoids-to-model-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O vídeo demonstra um método para gerar organoides cerebrais humanos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas. Ele mostra como a neuroesfera forma uma camada neuroectodérmica, que suprime a formação de outras camadas germinativas. As neuroesferas são incorporadas em uma matriz de gel 3D e formam brotos neuroepiteliais. Quando incubados com meios organoides, esses brotos neuroepiteliais se diferenciam em regiões cerebrais específicas, resultando na formação de organoides cerebrais...

Um método in vitro para gerar organoides cerebrais humanos

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Descrevemos um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos pelo homem e seu uso na modelagem de doenças mitocondriais.

Geração de Organoides cerebrais humanos para modelagem de doenças mitocondriais

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

Neste estudo, fornecemos uma técnica detalhada para um sistema de cultura organoide cortical simples, mas robusto, usando culturas hPSC padrão sem alimentador. Este é um protocolo rápido, eficiente e reprodutível para gerar organoides que modelam aspectos da senescência cerebral in vitro.

Geração robusta e altamente reprodutível de organoides cerebrais corticais para modelar senescência neuronal cerebral in vitro

Apresentamos um protocolo para gerar um organoide cerebral humano com microglia residente, incorporando células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) no desenvolvimento de organoides.

Derivação de um organoide do cérebro humano com desenvolvimento de microglia

Desenvolvimento neurológico processos tais como consequência natural do axônio, migração e proliferação são frequentemente perturbadas em doenças neuropsiquiátricas. Assim, apresentamos protocolos para rapidamente e reproducibly avaliar estes processos de desenvolvimento neurológico em NPCs de iPSC-derivado humanos. Estes protocolos permitem também a avaliação dos efeitos da terapêutica e fatores de crescimento relevantes no desenvolvimento do NPC.

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

Aprenda a gerar organoides cerebrais humanos derivados de iPSC para modelar distúrbios do neurodesenvolvimento precoce, incluindo microcefalia. Este método robusto oferece resultados reprodutíveis para estudar neurogênese.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

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