Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

O objetivo geral deste protocolo para a geração de organoides cerebrais humanos derivados de iPSCs é modelar distúrbios neurodesenvolvimentais humanos precoces. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento cerebral humano, como o papel dos sintesomas e dos cílios na neurogênese e na microcefalia primária. A principal vantagem desta técnica é que ela constitui um modelo robusto e rápido para obter resultados reprodutíveis a partir de organoides cerebrais derivados de iPSCs de pacientes.

Demonstrará o procedimento Elke Gabriel, pós-doutoranda do meu laboratório no Centro de Medicina Molecular, Colônia. Para iniciar este procedimento, colete as neuroesferas com uma micropipeta de 200 microlitros utilizando uma ponteira de dois milímetros previamente cortada com tesoura estéril. Em seguida, coloque as neuroesferas a aproximadamente cinco milímetros de distância umas das outras sobre uma película de parafina em uma placa de 100 mililitros.

E remova cuidadosamente o máximo possível do meio remanescente. Em seguida, adicione uma gota de matriz EHS sobre cada neuroesfera individual. Incube as gotas de matriz EHS com as neuroesferas por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Depois disso, lave cuidadosamente as neuroesferas do filme de parafina lavando-as com meio para neuroesferas. Posteriormente, incube as neuroesferas pelos próximos quatro dias e adicione dois mililitros de meio fresco para neuroesferas no segundo dia. Neste procedimento, adicione 100 mililitros de meio para organoides cerebrais a cada frasco agitador através de seus braços laterais.

Pré-aqueça o meio no incubador a 37 graus Celsius por pelo menos 20 minutos. Em seguida, certifique-se de que as neuroesferas estejam todas separadas. Se duas ou mais estiverem conectadas através da matriz EHS, separe-as cortando a matriz de conexão com um bisturi.

Configure um programa de agitação a 25 RPM. Transfira cuidadosamente as neuroesferas embutidas na matriz EHS para os frascos agitadores contendo 100 mililitros de meio de organoides. Em seguida, posicione os frascos agitadores sobre uma plataforma de agitação magnética no incubador por 14 dias a 37 graus Celsius.

Este é o dia zero do cultivo de organoides. Troque o meio uma vez por semana, removendo metade do meio e adicionando a mesma quantidade de meio fresco. Nesta etapa, colete os organoides do cultivo em frasco agitador no dia 14 com uma micropipeta pré-cortada de um mililitro.

Coloque todos em uma placa de 60 milímetros e lave-os uma vez com cinco mililitros de DMEM F12 morno durante três minutos. Em seguida, prepare um tubo de 1,5 mililitro com 500 microlitros de PFA a 4% morno. Coloque cada organoide separadamente em cada tubo e fixe-os por 30-60 minutos à temperatura ambiente.

Posteriormente, utilize um alça de inoculação para remover os organoides. Em seguida, remova o PFA e lave os organoides fixados duas vezes, por 10 minutos cada vez, com um mililitro de PBS. Posteriormente, armazene os organoides em um mililitro de PBS a quatro graus Celsius por até 7 dias para uso posterior.

Para embutir os organoides para crio-seccionamento, remova o PBS e adicione 1 mililitro de solução de sacarose a 30% em cada tubo para desidratar os organoides antes de criopreservá-los. Após a adição da solução de sacarose, os organoides devem flutuar na superfície. Armazene os organoides durante a noite na solução de sacarose a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, os organoides deverão ter afundado até o fundo do tubo. Em seguida, preencha uma forma de espécime de vinil com 400 mililitros de composto OCT. E utilize um alça de inoculação para posicionar um organoide no centro da forma.

Rotule a borda do molde com o nome da amostra. Em seguida, congele o molde contendo os organoides a menos 80 graus Celsius até o corte criostático. Posteriormente, recubra as lâminas de vidro criostáticas com PLL 0,1% e PBS por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, deixe as lâminas secarem por três horas. Armazene as lâminas a quatro graus Celsius e aqueça-as até a temperatura ambiente antes do uso. Após isso, seccione os organoides congelados em cortes com espessura de 20 a 50 micrômetros nas lâminas de vidro revestidas com PLL.

Deixe as seções secarem por uma hora à temperatura ambiente e armazene-as a menos 80 graus Celsius até o processamento posterior. Imagem imunofluorescente de organoides crioseccionados exibindo uma zona ventricular típica e a placa cortical primitiva. A zona ventricular estende-se do lado apical ao lado basal.

Observe que as células dentro da zona ventricular exibem núcleos dispostos em palissada, sugerindo que são células gliais radiais. O painel direito mostra a coloração por imunofluorescência de NPCs positivas para nestina dentro da zona ventricular e neurônios positivos para TUJ1 na placa cortical primitiva. São apresentados aqui dois exemplos de zonas ventriculares coradas com PVIM e ARL 13B.

As regiões marcadas por quadrados brancos estão ampliadas. Células gliais radiais apicais que se dividem no lado apical da ZV são positivas para PVIM. O plano de divisão de uma célula em anáfase é horizontal em relação à linha da superfície do lúmen, que é marcada pela coloração de ARL 13B.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 23 dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de realizar verificações periódicas de qualidade e de microplasma nas culturas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de desenvolvimento em neurobiologia explorarem os mecanismos do neurodesenvolvimento em organoides cerebrais humanos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar organoides cerebrais humanos a partir de diversas linhagens celulares de iPSC, incluindo linhagens celulares de pacientes com funções celulares comprometidas.