Maturação de cardiomiócitos estaminais humanas derivadas de células em Biowires Usando Electrical Stimulation

O objetivo geral deste procedimento é utilizar métodos controlados de cultivo de células tridimensionais em estimulação elétrica para promover a maturação de cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos cardíacos, incluindo como diferentes parâmetros de estimulação elétrica ou período de tempo afetam a função das células cardíacas e o estado de maturação. Os resultados finais são tecidos cardíacos humanos projetados de maturidade aprimorada.

As implicações dessa técnica se estendem a aplicações de diagnóstico, como testar a segurança e a eficácia de novos medicamentos, porque os cardiomiócitos com características maduras, como progresso elétrico, têm maior probabilidade de servir como modelos mais precisos de células cardíacas humanas em estudos de triagem de medicamentos. Combine o monômero PDMS e o agente de cura na proporção de 10:1 e misture bem. Deixe descansar por cinco minutos para desgaseificar.

Em seguida, carregue uma placa de Petri contendo o mestre para o modelo de biofio com a mistura PDMS. Tente minimizar a formação de bolhas de ar. Em seguida, catalise o PDMS a 70 graus Celsius por duas horas.

Em seguida, recupere o molde solidificado usando primeiro uma lâmina afiada nas bordas e depois retirando-o. Em seguida, corte o excesso de PDMS e colete todos os modelos em uma bolsa de esterilização. O vapor autoclava os modelos a 121 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, coloque cada modelo em uma placa de Petri estéril sob a ventilação de um gabinete de biossegurança. Agora, para cada modelo, use uma pinça para montar um pedaço de sutura de seda 6.0 estéril na ranhura que abrange todo o canal. Os modelos estão prontos para a propagação de células.

A sutura servirá como um modelo para a formação de construções 3D que se alinham ao longo do eixo da sutura, imitando a forma das fibras cardíacas. Para cada câmara, faça um par de peças retangulares de policarbonato para servir de moldura para a câmara de estimulação elétrica. Ao longo da linha central de cada peça, faça dois furos de três milímetros de largura, separados por dois centímetros.

Para cada câmara, prepare duas hastes de carbono de 1,5 centímetro de comprimento. Cerca de 3 milímetros da extremidade de cada haste perfure um furo de um milímetro de largura. Em seguida, passe cada orifício com um fio de platina e enrole uma extremidade do fio ao redor da haste.

Em seguida, para cada câmara, insira duas hastes entre duas peças de policarbonato formando uma moldura. Em seguida, despeje cerca de dois mililitros de PDMS em um poço de uma placa de seis poços e coloque a moldura no poço com PDMS, submergindo o fundo das molduras. Catalise o PDMS a 70 graus Celsius por duas horas para que o PDMS prenda a estrutura.

Em seguida, remova a câmara completa da placa com o PDMS conectado. Para testar o funcionamento de uma câmara montada, conecte os fios de platina a uma bateria e use um voltímetro para verificar se a eletricidade está passando pelas hastes. Agora transfira as câmaras funcionais para uma bolsa de esterilização e use 20 minutos de esterilização a vapor a 121 graus Celsius para prepará-las para a cultura de células.

Para preparar o gel, pré-resfrie todos os componentes do gel no gelo antes de misturá-los em um tubo estéril. Certifique-se de adicionar o colágeno e a matriz extracelular por último e misture os componentes usando pipetagem. Pois as células têm cardiomiócitos diferenciados de células-tronco pluripotentes humanas.

Colete as células e, para cada planta de preparação de biofios, prepare 3,5 microlitros de gel de colágeno contendo meio milhão de células. Agora use uma ponta de pipeta P10 para carregar aproximadamente quatro mililitros de suspensão no gabarito de canal de 0,5 centímetro de comprimento em cada prato. Ajuste a posição da sutura usando uma pinça estéril conforme necessário para que fique totalmente esticada.

Depois de semear as células, certifique-se de sempre ressuspender a mistura de células de gel antes de tomar a autoclave para obter resultados consistentes. Depois de carregar os canais, cubra o fundo do prato com PBS estéril, certificando-se de não tocar no gel. Isso garantirá que os biofios não desidratem durante a polimerização.

Depois de incubar os biofios a 37 graus Celsius por 30 minutos, substitua o PBS por meio de cultura suficiente para cobrir as células. 12 mililitros geralmente são suficientes. Em seguida, cultive o prato por uma semana, substituindo o meio a cada dois dias.

Em um gabinete de biossegurança, adicione dois mililitros de PBS a cada poço de uma placa de seis poços que abrigará uma câmara de estimulador elétrico. Em seguida, use uma pinça estéril para colocar suavemente os dispositivos de autoclave nos poços. Uma vez na posição, descarte o PBS e substitua-o por cinco mililitros de meio quente que deve cobrir completamente as hastes de carbono.

Antes de cultivar as células por 24 horas, observe a contratilidade dos cardiomiócitos em resposta à estimulação elétrica para garantir que as células estejam captando o estímulo elétrico e respondendo com contrações. Em seguida, coloque os biofios na câmara do estimulador elétrico e oriente os canais perpendicularmente às hastes de carbono. Estenda os fios de platina para longe da placa e cubra as placas.

Conecte os fios a um estimulador elétrico. Defina o estimulador para fornecer pulsos bifásicos de um milissegundo a um hertz e a três volts por centímetro. Em seguida, transfira as preparações no estimulador elétrico para uma incubadora a 37 graus Celsius.

Aumente a taxa de estimulação incrementalmente a cada 24 horas de um hertz no dia zero para seis hertz no dia seis. Durante esta semana de cultura, mude o meio a cada dois dias. E observe a contratilidade dos cardiomiócitos diariamente.

Após sete dias de pré-cultivo no biofio, as células remodelaram o gel ao redor da sutura. As células se reuniram ao longo do eixo da sutura para formar tecido cardíaco alinhado. As células expressas em proteínas contráteis cardíacas apresentaram bandagem sarcomérica no aparelho contrátil e suas miofibrilas estavam alinhadas ao longo do eixo da sutura.

As células do biofio exibiram taxas de proliferação mais baixas do que as células dos corpos embrióides. O manuseio do cálcio foi significativamente melhorado nos cardiomiócitos cultivados em biofios. O tratamento com cafeína induziu uma liberação abrupta de cálcio do retículo sacroplasmático.

Tais transientes foram encontrados apenas em células estimuladas. Houve também uma frequência de estimulação significativamente maior dependendo das amplitudes de liberação de cálcio. Além disso, os cardiomiócitos cultivados em biofios mostraram densidades de corrente hERG e retificadora interna melhoradas em comparação com o cultivo em corpos embrióides, que foi aprimorado ainda mais pela estimulação elétrica.

A corrente retificadora interna melhorada foi consistente com o aumento da expressão do canal retificador interno de potássio jean, KCN J2. A automaticidade da capacidade de bater espontaneamente foi significativamente maior em cardiomiócitos derivados do corpo embrióide em comparação com biofios controlados. O controle mostrou automaticidade comparável à preparação de biofios submetidos ao regime de seis hertz. Uma vez dominado, a configuração dos biofios pode ser feita em meio dia.

A configuração da estimulação elétrica levará algumas horas e os resultados finais podem ser alcançados em duas semanas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os cardiomiócitos diferenciados de diferentes linhagens celulares ou por diferentes protocolos podem variar ligeiramente em sua maturidade e pureza. Portanto, pode ser necessário otimizar os parâmetros experimentais, como a taxa de estimulação de suas células.

Após este procedimento, outras condições, incluindo a variação da composição celular e a utilização de cardiomiócitos mutantes, podem ser otimizadas para responder a um bando de perguntas adicionais.