Name: Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Aprenda a isolar cadeias TCR alfa e beta de célula única e gerar vetores retrovirais para expressão in vitro e in vivo. Este método de PCR em duas etapas permite análise de repertório sem conhecimento prévio da sequência.

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Este estudo foi financiado pelo 1-FAC-2014-243-A-N JDRF, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 piloto PJ e o Robert e Janice McNair Foundation.
Agradecemos a Sandra Pena e Andrene McDonald para o recrutamento de paciente, Samuel Blum para assistência técnica, Dr. George Makedonas pelo dom de controle usado para otimização de PCR de DNA e anticorpos.

1. identificar a população de células T de interesse.
 Nota: antígeno específica proliferação em combinação com tintura de divisão celular (como Carboxyfluorescein succinimidil éster, CFSE) pode ser usada para isolar as células T com base na sua proliferação em resposta à estimulação antigênica. Se a partir de PBMC, uma expansão de 7 dias em vitro deve ser suficiente para identificar um antígeno específico CFSE baixa população 12.
<ol><li>PBMCs mistura 1:1 com células MHC-combinados do alimentador e etiqueta com tintura de divisão celular 5 µM CFSE.</li>
	<li>Placa de 2 a 2,5 x 10 5 células por poço em um fundo redondo 96 poços cultura placa em 200 µ l 10% FCS completo RPMI mídia. 
	Nota: RPMI completa contém 2 mM l-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 µM MEM não essenciais aminoácidos, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 unidades de 2-Mercaptoetanol, 100 mL de U &#8722; 1 penicilina e 100 µ g mL &#8722; 1 estreptomicina.</li>
	<li>Estimulam as células com antigénios de peptídeo 25 µM.</li>
	<li>No quarto dia da cultura, com cuidado, remova e substitua a 100 µ l de mídia. 
	Nota: Uma abordagem mais ideal para identificação de célula de T antígeno-específicas é o uso de peptídeo-HLA tetrâmeros 13. Tetrâmero coloração permite a avaliação simultânea de especificidade antigénica, bem como a restrição de HLA.</li>
</ol> 2. Configurar o tipo de célula única.
<ol><li>Executar todos os procedimentos em uma capa ou uma área livre de modelo amplificado. Alíquota os reagentes para evitar contaminação, limpe todas as superfícies de trabalho e, se for possível, o equipamento com 10% bleach antes da instalação do PCR. Use dicas de filtro, reagentes livre de RNAse e DNAse e plásticos em todos o PCR e o vetor de clonagem passos. Principais reagentes podem ser encontrados na Tabela de materiais. 
	Nota: A reação de PCR multiplex é altamente sensível, e baixos níveis de contaminação podem resultar em produto amplificado.</li>
	<li>Gerar o mix de transcrição reversa mestre combinando 10 x reação de RT do buffer, 25 X DNTPs, 9 enzima RT U, 0,01% Triton-X, inibidor de RNAse U 0,7 e 383 nM de cada primer RT-TCR (listado na tabela 1) em um reservatório de pipetagem estéril. Para cada placa de 96 poços, compõem suficiente mistura mestre para 10 reações adicionais (106 total), para compensar a perda de líquido durante a pipetagem. Consulte a tabela 2 para componentes de reação e montantes por bem.</li>
	Placa de <li>preparar uma coleção de PCR de 96 poços para célula Classificar por pipetagem µ l 6 da mistura mestre transcrição reversa por alvéolo com uma pipeta multicanal. Manter a placa no gelo ou em um bloco frio.</li>
	<li>Células com anticorpos de marcadores de superfície (tais como CD4 e CD3, ou CD8 e CD3, cada um em 2 µ g/mL, em combinação com tintura de divisão celular ou tetrâmero coloração) da pilha de rótulo.</li>
	<li>De células T do tipo em uma célula por alvéolo, ignorando a décima segunda fila, que servirá como um controle negativo. 
	Nota: A eficiência da classificação dependerá alinhamento de placa precisos coleção dentro do suporte da placa, bem como a manutenção das células e placas em uma baixa temperatura antes da reação de cDNA. Placas de coleção devem ser mantidas no gelo em todos os momentos, exceto durante a classificação, quando eles são fixos dentro da placa de resfriamento. Nem todos os classificadores estão equipados com um suporte de placa regulamentado de temperatura; no entanto, é altamente recomendável o uso de um. Desde que o tipo geralmente leva cerca de 10-15 min por placa, há um aumento potencial de degradação de RNA se a placa não é mantida a uma temperatura baixa.</li>
	<li>Como um controle positivo, adicionar um maior número de células (100) manualmente com uma pipeta para um dos poços nesta fase. Alternativamente, anteriormente isolado RNA das células em pool pode ser usado como controle positivo em 10 ng por alvéolo. 
	Nota: Pipetar controle purificado RNA com precisão e cuidado para evitar contaminação cruzada de outros poços e resultados falso-positivos.</li>
	<li>a placa com a película adesiva do selo e girar para baixo a 1000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Imediatamente transcrever RNA de cDNA por incubar a placa a 25 ° C por 10 min, a 37 ° C por 45 min e 85 ° C por 10 min. 
	Nota: Para garantir a reação de PCR eficiente, é recomendável que a primeira reação de PCR seja realizada no mesmo dia. Alternativamente, as placas transcritas podem ser mantidas em-80 ° C por até 2 meses.</li>
</ol> 3. Realizar o PCR multiplex aninhada Nota: preparar todas as misturas de mestre numa área limpa livre de modelo para evitar contaminação.
Cartilha de <ol><li>reconstituir cada região variável de 100 µM com DNAse e RNAse livre H 2 O. Em seguida, combine 20 µ l de cada um dos 44 primers para gerar o pool de cartilha V-alfa. Para gerar o V-beta piscina cartilha combinar 20 µ l de cada um dos primers V-beta 40 e 80 µ l de DNAse e RNAse livre H 2 O. Primer sequências estão listadas na tabela 1. Uma vez reunidos, a concentração de cada primer na mistura é 2.3 µM.</li>
	<li>Reconstituir os primers região constante a solução estoque de 100 µM com DNAse e RNAse livre H 2 O. dilua os primers região constante 10 solução de trabalho µM e alíquota para uso.</li>
	<li>Preparar duas mixagens mestre separadas para amplificação de TCR-alfa e beta-TCR. Gerar as mixagens mestre combinando 5x buffer, pool de cartilha de 2 µM de dNTPs, 3% DMSO, 80 µM (concentração final de 46 nM para cada primeira demão), 200 nM TCR-constante região inversa da primeira demão, 1 U DNA-polimerase e DNAse e RNAse livre H 2 O (tabela 2 
	Nota: Os cálculos são baseados em volume final de 25 µ l por alvéolo, onde 22,5 mistura µ l de mestre-PCR é combinada com o modelo de cDNA 2,5 µ l PCR.</li>
	<li>Manter a placa com cDNA no gelo ou em um bloco frio. Use um multicanal para pipetar 22,5 µ l de reação de TCR-beta em uma nova placa PCR de 96 poços. Em seguida, use um multicanal para transferir 2,5 µ l de cDNA em placa de PCR.</li>
	<li>Usar um multicanal para pipetar 22,5 µ l de reação de TCR alfa diretamente para a placa contendo o restante do cDNA.</li>
	<li>Selar as placas com adesivo, delicadamente vórtice e rotação para baixo a 1000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Executar a reação de PCR multiplex com os seguintes ciclos: 5 min a 95 ° C seguido de 34 ciclos de 20 s a 95 ° C, 30 s 54 ° c e a 1 minuto a 72 ° C, seguiram por 7 min em 72 ° C.</li>
	<li>Transportar para fora a reação de PCR aninhada em um volume final de 25 µ l, utilizando 2,5 µ l da mistura de PCR multiplex como modelo.
	<ol><li>Reconstituir os primers internos e adaptador de 100 µM com DNAse e RNAse livre H 2 O. fazer 10 µM alíquotas para as ações de trabalho.</li>
		<li>Preparar duas mixagens mestre separadas para TCR-alfa e beta-TCR amplificação. Mix 5 X tampão, 25 X DNTP, 3% DMSO, cartilha de adaptador frente 200 nM, 200 nM reversa aninhados primer, 1 U DNA polimerase e DNA polimerase e livre de nuclease H 2 O, para um volume final de 22,5 µ l (tabela 2). Para cada placa de 96 poços, compõem suficiente mistura mestre para 10 reações adicionais (106 total), para compensar a perda de líquido durante a pipetagem. 
		Nota: Na segunda utilização do PCR reação a 5 X PCR de buffer contendo corante de carregamento para facilitar o carregamento do gel do agarose.</li>
		<li>Usando um multicanal, pipetar as mixagens mestre para as reações de TCR-alfa e beta-TCR em 22,5 µ l por alvéolo em duas novas placas PCR de 96 poços.</li>
		<li>Adicionar o modelo de reação de PCR multiplex em 2,5 µ l por alvéolo. 
		Nota: A primeira reação de PCR restante deve ser selada e armazenada a-20 ° C, para servir como uma fonte de modelo adicional, se for necessário (ver passo Nota 4,3).</li>
		<li>Selar as placas, delicadamente vórtice e rotação para baixo a 1000 x g por 5 min em 4 ° C.</li>
		<li>Executar a reação de PCR aninhada com os seguintes ciclos: 5 min a 95 ° C seguido de 34 ciclos de 20 s a 95 ° C, 30 s a 56 ° C e 1 min a 72 ° C, seguiram por 7 min em 72 ° C.</li>
		<li>Executar 5 µ l da reação final para fora em uma agarose a 1% do gel contendo brometo de etídio (incluindo os poços de controle negativo e positivo). 
		Nota: A banda esperada deve ser executado em cerca de 500 tamanho de bp. Uma reação de exemplo é mostrada na Figura 2.</li>
		<li>Purificar o restante da segunda reação (20 µ l) usando um formato kit de purificação de PCR de 96 poços, eluir com 15 µ l de 70 ° C H 2 O por alvéolo e executar Sanger sequenciamento. Use o apropriado TCR-alfa ou beta-TCR adaptador frente primer para sequenciamento (tabela 1). 
		Nota: As sequências podem ser analisadas com software de Imunogenética disponível on-line.</li>
	</ol></li></ol> 4. Sub clonagem cadeias PCR alfa e beta.
 Nota: A piscina de frente primers utilizados na primeira reação e os primers reversos na segunda reação PCR são usados para incorporar sítios de restrição. Portanto, os obtidos alfa e beta da cadeia os produtos de PCR estão prontos para ser sequencialmente sub clonado no vetor retroviral modelo ( Figura 1).
Produtos <ol><li>Digest o PCR purificado do beta aninhada reação com BstbI e MfeI (tabela 3). 
	Nota: Não exceda 5 inserção µ g.</li>
	<li>Em paralelo, digerir o vetor modelo com BstbI e MfeI (tabela 3). Use 1-2 µ g do vetor modelo por TCR. Execute o vetor digerido em um gel de agarose e isolar a maior banda (~ 7500 bp). Purificar o vetor com um gel kit de purificação de DNA. 
	Nota: Durante a síntese da enzima de restrição, a região variável modelo murino TCR-beta é removido, permitindo a adição da região variável humana de TCR-beta.</li>
	<li>Purificar os produtos PCR digeridos usando um kit de purificação de PCR. 
	Nota: Verificar a capacidade de purificação de DNA das colunas incluídas no kit; Use várias colunas se necessário. A quantidade mínima de uma inserção purificada necessária para uma reação de sucesso da ligadura é 50 ng em uma concentração mínima de 10 ng / µ l. Se a quantidade de inserção purificado não é suficiente para uma bem sucedida da ligadura, a segunda reação de PCR pode ser repetida.</li>
	<li>Tratar o vetor modelo com 10 enzima U CIP para 1 h a 37 ° C para evitar Auto ligadura, seguida por inativação de calor durante 10 minutos a 75 ° C. Purify o DNA com um kit de purificação de PCR (tabela 3).</li>
	<li>Ligam TCR-beta inserir e vetoriais usando DNA ligase em um volume total de 20 µ l em 6 excesso molar da inserção por 30 min à temperatura ambiente. 
	Nota: No total, a reação da ligadura deve conter cerca de 150 ng de DNA (tabela 3).</li>
	<li>Para transformações, misture 8 µ l de reação da ligadura com 80 µ l de células quimicamente competentes de Escherichia coli DH5α (Tabela de materiais) e incubar no gelo por 30 min. choque térmico a 42 ° C por 45 s. µ l adicionar 500 Super Caldo ideal com Catabolite supressão (S.O.C) médio e agitar durante 1,5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Placa fora 250 µ l de cultura bacteriana em uma ampicilina contendo placa de ágar caldo lisogenia (LB). Incubar a placa durante a noite (~ 16 h) a 37 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte escolha colônias bacterianas e eles cresce meio de 3 mL LB contendo ampicilina durante a noite. Isolar o DNA do plasmídeo usando o kit de purificação de plasmídeo de DNA.</li>
	<li>Confirmar a inserção bem sucedida da cadeia beta de um teste em pequena escala-digest com as enzimas de restrição, BstbI e MfeI. Em um volume de reação total 12 µ l, combine 200-500 µ g plasmídeo, 0,25 µ l de cada enzima e buffer de enzima 10 X (tabela 3). Executar a reação fora em um gel de agarose 1% contendo brometo de etídio para confirmar o tamanho da banda inserir (~ 500 bp).</li>
	<li>Depois de confirmar a presença da inserção, sequenciar a seção TCR-beta do vetor usando o primer reverso IRES (tabela 1).</li>
	<li>Após a confirmação da sequência da inserção da TCR-beta, realizar um processo semelhante para a inserção da região variável alfa. Digerir os produtos PCR purificados da reação aninhada alfa e a inserção de TCR-beta recentemente gerada contendo o vetor, com SnaBI e SacII. 
	Nota: Durante a síntese da enzima de restrição, a região variável modelo murino TCR-alfa é removido, permitindo a adição da região variável de TCR-alfa humana.</li>
	Alfa <li>ligam insere-se em vetores TCR codificação correspondente região variável beta usando o ligase do DNA em um volume total de 20 µ l em 6 excesso molar da inserção por 30 min à temperatura ambiente. 
	Nota: No total, a reação da ligadura deve conter cerca de 150 ng de DNA (tabela 3).</li>
	<li>Para transformações, misture 8 µ l de reação da ligadura com 80 µ l de células quimicamente competentes de Escherichia coli DH5α (Tabela de materiais) e incubar no gelo por 30 min. choque térmico a 42 ° C por 45 s. adicionar 500 µ l S.O.C médio e agitar durante 1,5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Placa fora 250 µ l de cultura bacteriana em uma ampicilina contendo placa de ágar caldo lisogenia (LB). Incubar a placa durante a noite (~ 16 h) a 37 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte escolha colônias bacterianas e eles cresce meio de 3 mL LB contendo ampicilina durante a noite. Isolar o DNA do plasmídeo usando o kit de purificação de plasmídeo de DNA.</li>
	<li>Confirmar a inserção bem sucedida da cadeia alfa de um teste em pequena escala-digest com as enzimas de restrição, SnaBI e SacII. Em um volume de reação total 12 µ l combine 200-500 µ g plasmídeo, 0,25 µ l de cada enzima e buffer de enzima 10 x (tabela 3). Executar a reação fora em um gel de agarose 1% contendo brometo de etídio para confirmar o tamanho da banda inserir (~ 500 bp).</li>
	<li>Depois de confirmar a presença da inserção, sequenciar a seção TCR-alfa do vetor usando o primer MSCV2-para diante (tabela 1).</li>
	<li>Uma vez que a sequência de cadeia alfa é validada, verificar a completa inserção TCR de sequenciação com IRES-ré e TCR-beta-reverso primer (tabela 1).</li>
</ol> 5. Verifique se a expressão de superfície celular TCR e especificidade.
 Nota: HEK293T células são usadas para testar o sucesso TCR cadeia pariNG e célula de superfície de expressão ( Figura 3A) 8. Peptídeo-MHC tetrâmero coloração também pode ser realizada em células transfectadas HEK293T para testar para retenção de isolamento ( Figura 3B) gene TCR do post especificidade antigênica.
<ol><li>Placa HEK293T células em placas de cultura de tecidos de 12-poços em 1 x 10 5 células por poço em 1ml completa DMEM mídia contendo 5% FCS e cultura durante a noite a 37 ° C. Plate fora células suficientes para designou poços separados para cada nova TCR , controle modelo TCR vetor, CD3 vetor somente, controle vetorial TCR única e uma não-transfectadas bem. 
	Nota: Transfection com um totalmente rato modelo TCR vector (mTCR-pMIA) em combinação com mCD3εγδζ-pMIG vector, vector mTCR-pMIA sozinho, e mCD3εγδζ-pMIG vector sozinho são usados como controles positivos e negativos. 
	Nota: DMEM completa contém 2 mM 1 mM piruvato de sódio, L-glutamina, 100 µM não essenciais aminoácidos, 5 mM HEPES buffer, 5,5 x 10 -5 unidades de 2-Mercaptoetanol, 100 U/ml penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>No dia seguinte, transfect as células com um reagente de transfeccao baseada em lipossomas, seguindo as instruções do fabricante, 1 vetor de CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) de rato µ g e 1 µ g quimérico h/mTCR-pMIA vetor.</li>
	<li>Para cada TCR, adicionar o reagente de transfeccao 6 µ l para 100 µ l da temperatura ambiente, DMEM isento de soro. Brevemente o vórtice e incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Em separado 1,5 mL tubos combinam 1 µ g de TCR-pMIA vector com 1 µ g do mouse CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vetor, ou 1 µ g de cada vetor separado para controles.</li>
	<li>Dropwise, adicionar a solução DMEM/reagente de Transfeccao para os tubos contendo o DNA do vetor. Incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Dropwise, adicionar a solução de DNA/DMEM/reagente de Transfeccao para as células HEK293T. Bata levemente a placa para misturar. Incubar a 37 ° C por 24 h.</li>
	<li>Após 24 h substituir os meios de comunicação e manter as células em cultura para adicionais 24 h.</li>
	<li>Remover células da placa pipetando vigoroso e mancha as células com anticorpos de anti-rato CD3 (2,5 µ g/mL) para verificar a expressão de superfície de quimérico-TCR por citometria de fluxo.</li>
	<li>a fim de comparar a expressão CD3 entre células que foram transfectadas para um nível semelhante, portão a análise de células expressando um alto nível similar de moléculas de repórter fluorescente (GFP para complexo CD3 e Ametrine para vetor de expressão de TCR). Idealmente, a análise deve ser fechada na GFP + Ametrine + células dentro de 10 4 10 5 fluorescente intensidade ( Figura 3A). 
	Nota: O nível de expressão CD3 em células transfectadas com o constructo quimérico deve ser comparável do vetor de rato (modelo original) de controle ( Figura 3A). Vetores retrovirais TCR gerados são compatíveis com sistemas de expressão em vivo como descrito anteriormente 4.</li>
</ol>

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<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo atual, descrevemos um método eficiente para amplificação de TCR unicelulares e subsequente sub clonagem de cadeias de alfa e beta TCR emparelhadas em um vetor retroviral expressão do modelo. Embora, desenvolveram-se vários protocolos PCR de célula única, nenhum até agora têm sido compatíveis com imediata sub clonagem em um vetor de expressão. Na maioria dos casos, uma sequência parcial, englobando as regiões CDR3 altamente variáveis é amplificada, com suficiente sequência de extrapolar a região variável. Este...

O receptor de células T (TCR) dita decisão de destino T celular durante o desenvolvimento, estado estacionário/homeostase e estimulação antigênica na periferia1,2,3. Recente expansão de tecnologias de sequenciamento de profundidade descobriu uma diversidade TCR subvalorizada anteriormente dentro respostas de célula T específica do antígeno. Diversidade TCR sugere um potencial de respostas funcionalmente amplo de célula T. Para integrar a análise de repertório do TCR sequência com ensaios funcionais de TCR, as abordagens de sequenciamento devem ser projetadas para ser compatível com sistemas experimentais e na vivo modelos utilizados para posterior análise funcional de select TCRs. Desenvolvemos uma abordagem eficiente para o isolamento de sequência humana TCR e racionalizado sub clonagem em um vetor de modelo TCR quimérico humano/rato compatível com expressão de TCR em ratos HLA-humanizado4. Isolamento das correspondentes cadeias alfa e beta de heterodimérica TCRs requer amplificação por PCR de ambas as correntes de uma única célula. Apesar de vários protocolos TCR da célula única clonagem foram desenvolvidos e utilizados, nenhum até agora foram facilmente compatível com elevado-throughput simplificada clonagem direto do desconhecido Vα/Vβ TCRs em vetores retrovirais necessárias para re-expressão in vivo 4,5,6,7. Estudos anteriores já utilizaram duas abordagens principais, tanto para amplificar seletivamente uma parte limitada da TCR suficiente para extrapolar a sequência, ou amplificar a sequência TCR inteira4,5,6 , 7. análise funcional a jusante das sequências TCR, obtidos através da primeira abordagem requer dispendiosos em silico montagem e novo de construção da TCR. Enquanto a segunda abordagem fornece a sequência completa de TCR, região constante humana não é compatível com expressão na vivo das TCRs clonados em modelos do rato. Nossa abordagem é especificamente projetada para ser compatível na vivo análise funcional de TCRs em modelos do rato. Desenvolvemos uma única célula simplificada e eficiente protocolo PCR que permite o sub clonagem direto de fragmentos do PCR em vetor de expressão do modelo.
Nossa abordagem utiliza uma altamente sensível aninhada multiplex PCR reação é executada em duas etapas. Na primeira reação de multiplex passo uma de 40 primers específicos para todas as cadeias de V-beta e uma piscina de 44 primers específicos para todas as cadeias de V-Alfa são usadas para amplificar o TCR-alfa ou beta-TCR sem o conhecimento prévio da sequência (tabela 1). O primer para a frente tem uma sequência de adaptador, que é incorporada a 5' do produto do PCR. O primer reverso baseia-se na região constante da TCR. Nós identificamos sites única restrição que são ausentes de variável humana ou junção TCR regiões e incorporada no redesenhado TCRα e TCRβ primers (Figura 1). Na segunda reação aninhada, um primer específico para a sequência de adaptador e um primer reverso aninhado dentro da região constante são usados para amplificar ainda mais as cadeias TCR com maior especificidade (tabela 1, Figura 1). Após o isolamento de célula única, duas rodadas de PCR (reação de primeira com uma piscina de primers tanto Vα e Vβ e a segunda com primers adaptador) resultam em um produto PCR que pode diretamente ser sub clonado no vetor retroviral modelo. Construção de TCR final irá codificar, em uma moldura única leitura aberta (ORF), regiões variáveis humanas, combinadas com regiões de constante do mouse conectadas pela 'self chicotada' sequência de proteína, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. A sequência de P2A tem sido usada em vários sistemas e foi extensivamente testada especificamente para a expressão de TCRs8,9,10,11. Embora, após tradução, a maioria dos restos sequência P2A anexada ao C-terminal da cadeia alfa, conectado por um vinculador flexível, enquanto a sequência de sinal de cadeia beta tem uma prolina adicional, esta alteração não tem nenhum efeito prejudicial na função TCR. A região constante do mouse é usada na construção em vez de humanos para evitar potenciais interações alteradas com componentes de sinalização downstream quando re-expressa em células de rato. O único ORF irá resultar em estequiométrico expressão separada da de9,de cadeias alfa e beta11. O protocolo atual é baseado em reagentes e abordagens que estão amplamente disponíveis e é projetado para ser executada de maneira otimizada e eficiente. Embora especificamente usamos essa técnica para ensaiar TCRs de células T auto-reativas implicadas na diabetes auto-imune, prevemos que este protocolo pode ser amplamente aplicável para identificação e avaliação funcional de humanos TCRs específicos para epítopos auto-imunes, câncer epítopos ou respostas a patógenos e vacinas.

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp;</td><td>eBiociência&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-humano CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD3 humano (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-camundongo CD3 AF647</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Inibidor de RNAse recombinante biotech grd 2.5KU&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Kit de RT de cDNA de alta capacidade&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (enzima RT)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Água livre de nuclease 1000mL</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polimerase 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Well Half Skirt PCR Plate</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Clear Adhesive Film&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>4306311</tr><tr><td>Agarose UltraPura&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (inserir) 30 U (vetor)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (inserir) 80 U (vetor)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (inserir) 80 U (vetor)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (inserto) 80 U (vetor)</td></tr><tr><td>Fosfatase Intestinal de Bezerro (CIP)</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Ligase rápida&nbsp;</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps sistemas de purificação de DNA&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps sistemas de purificação de DNA&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA clean & concentrator-25 kit</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA limpo e concentrador-5 kit</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td>Kit de extração de gel QIAquick <td>11-306A</td><td></td></tr><tr>Kit de<td>purificação</td> de <td>PCR Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td></td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Eficiência de Subclonagem DH5a Células Competentes&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>18265017</tr><tr><td>Transit LT-1 Reagent 1mL (reagente de transfecção)</td><td>Mirus&nbsp;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (classificador)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (citômetro de fluxo)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aerodinâmico única célula tcr isolamento e geração de vetores retrovirais para in vitro e in vivo de expressão de tcrs humanas

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Embora, desenvolveram-se vários métodos de sequenciamento de emparelhados T cell receptor (TCR) alfa e beta cadeias de células T únicas, nenhum até agora têm sido propício à jusante na vivo análise funcional de TCR heterodímeros. Nós desenvolvemos um protocolo melhorado baseado em um Two-Step aninhada multiplex PCR, o que resulta em um produto PCR que abrange regiões inteiras de variável de um humano TCR alfa e beta cadeias. Identificando locais da limitação original e incorporando-os aos primers PCR, fizemos o produto do PCR compatível com sub clonagem direto para o vetor retroviral do modelo. A construção resultante retroviral codifica um quimérico humano/mouse TCR com um domínio intracelular do mouse, que é funcional em células de rato ou em modelos de rato na vivo . No geral, o protocolo descrito aqui combina humana única célula emparelhada TCR alfa e beta cadeia identificação com geração simplificada de vetores retrovirais facilmente adaptávelas para expressão de TCR in vitro e in vivo . O vídeo e o material que acompanha são projetados para dar uma descrição minuciosa da única célula PCR, para que os passos críticos podem ser seguidas e potenciais armadilhas evitadas. Além disso, nós fornecemos uma descrição detalhada das etapas necessárias para gerar o vetor de expressão clonagem. Uma vez dominado, todo o processo de célula única classificação a expressão TCR poderia ser realizado em um curto período de duas semanas.

A eficiência da reação de PCR multiplex aninhada é verificada na etapa 3.2.7 (Figura 2), a esgotar-se 5µL da segunda reação em um gel de agarose. Em média, a eficiência de amplificação de TCR-beta é esperada em cerca de 80%, enquanto a eficiência da reação de TCR-alfa é geralmente baixa, em torno de 50%4. Só emparelhadas cadeias TCR-alfa e beta-TCR podem ser usadas para a expressão de TCR; no entanto, todos os produtos PCR podem ser se...

O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como o repertório TCR alfa e beta da população específica de um antígeno, bem como a funcionalidade in vivo dos TCRs humanos. As principais vantagens desta técnica são a eficiência relativamente alta da reação de PCR, bem como sua compatibilidade com a clonagem TCR subsequente. Este protocolo usa uma PCR de duas etapas para amplificar as cadeias TCR alfa e beta de uma única célula sem conhecimento prévio da sequência TCR.A primeira PCR é uma reação multiplex usando um conjunto de primers específicos da região variável alfa ou beta em conjunto com um primer específico para a região constante. A segunda PCR é uma reação aninhada que se prepara da sequência do adaptador incorporada nas cinco extremidades principais do produto da PCR, bem como uma sequência interna de região constante. Esses primers também incorporam locais de restrição exclusivos nas cinco extremidades principais e três principais do produto de PCR para facilitar a clonagem subsequente.Uma vez clonada no vetor modelo, a sequência TCR codificada é quimérica, consistindo em regiões variáveis humanas com regiões constantes de espelhamento. A construção quimérica do TCR permite a interação entre o TCR e o complexo de sinalização CD3 de espelhamento, tornando este protocolo de clonagem de TCR compatível com estudos funcionais subsequentes em linhagens celulares de espelhamento e em modelos de camundongos humanizados. Configure para a classificação de célula única preparando os reagentes de transcrição reversa em uma área limpa e sem molde.Geralmente, indivíduos novos no método de PCR de célula única terão dificuldades devido aos baixos níveis de modelo. Por outro lado, a sensibilidade da PCR aninhada multiplex é sensível a baixos níveis de contaminação do modelo. Portanto, é necessário limpar completamente as áreas nas quais você configurará as reações de PCR.Uma mistura de três primers reversos específicos para a região constante das cadeias alfa e beta são usados nesta reação. Preparar a master-mix de transcrição inversa combinando os reagentes num reservatório de pipetagem. Para contabilizar o erro de pipetagem, faça mistura de reação suficiente para dez poços extras.Use um multicanal para pipetar seis microlitros por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Cubra o prato frouxamente com um selo e mantenha o prato no gelo. Prepare as células T para a classificação de uma única célula, colorindo as células com anticorpos para marcadores de superfície celular.Classifique as células T de uma só vez por poço, deixando as doze linhas vazias, o que servirá como um controle negativo. Sele a placa com filme adesivo e gire a 1000g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Execute imediatamente a reação de transcrição reversa.Se possível, execute a primeira reação de PCR no mesmo dia. Para executar a reação multiplex, misture separadamente as misturas principais de PCR V alfa e V beta em reservatórios de pipetagem. Mantenha a placa com cDNA no gelo ou em um bloco frio.Transfira 22,5 microlitros de reação TCR beta para uma nova placa de PCR de 96 poços. Em seguida, use um multicanal para transferir 2,5 microlitros de cDNA para a placa de PCR. Use um multicanal para pipetar 22,5 microlitros de reação TCR alfa diretamente na placa que contém o restante do cDNA.Sele as placas com adesivo, bata suavemente e gire brevemente para baixo. Execute a primeira reação de PCR. As placas podem ser armazenadas a 20 graus Celsius.No dia seguinte, prepare as segundas reações de PCR aninhadas. Usando um multicanal, pipete as misturas principais para as reações TCR alfa e TCR beta a 22,5 microlitros por poço em duas novas placas de PCR de 96 poços. Adicione o modelo de reação de PCR multiplex a 2,5 microlitros por poço.Sele as placas, bata suavemente e gire brevemente para baixo. A primeira reação de PCR restante deve ser selada e armazenada a 20 graus Celsius para servir como fonte de modelo de backup. Execute a segunda reação de PCR.Após a conclusão da segunda reação de PCR aninhada, esgote cinco microlitros da reação em um gel de agarose a 1%. Inclua os poços de controle positivo e negativo. A banda esperada deve ter cerca de 500 pares de bases de tamanho.Purifique o restante da segunda reação, vinte microlitros, usando um kit de purificação por PCR no formato de 96 poços e execute o sequenciamento de Sanger. As sequências de TCR obtidas podem ser analisadas usando software imunogenético disponível online. As informações da sequência podem ser usadas para avaliar o repertório e a clonalidade da população de células T.As sequências alfa e beta do TCR emparelhadas podem ser usadas em análises funcionais adicionais. Execute ligações consecutivas de TCR beta e TCR alfa no vetor de modelo. O modelo TCR beta e TCR alfa são substituídos pelas cadeias amplificadas por PCR.Na primeira ligação, o modelo TCR beta é substituído pela cadeia beta amplificada por PCR. Após a inserção bem-sucedida do TCR beta ter sido verificada por sequenciamento de resumo de teste, substitua o modelo TCR alfa pela cadeia alfa amplificada por PCR. HEK293T células são usadas para testar o emparelhamento bem-sucedido da cadeia TCR e a expressão da superfície celular.HEK293T células são cotransfectadas com o vetor TCR marcado pelo repórter fluorescente ametrino e um vetor que codifica o complexo CD3 marcado por GFP. A expressão superficial do TCR quimérico é verificada por citometria de fluxo, colorindo as células com anticorpo CD3 anti-camundongo. O nível de expressão de CD3 de superfície em células transfectadas com a construção quimérica de TCR deve ser comparável àquelas transfectadas com o vetor de modelo de controle totalmente espelhado.Em resumo, descrevemos um protocolo eficiente baseado em PCR para a identificação e clonagem de cadeias TCR pareadas a partir de células únicas. Prevemos que esta será uma ferramenta valiosa para estudar as respostas das células T humanas na autoimunidade, vigilância de tumores e eliminação de patógenos. A principal vantagem do protocolo de PCR aqui descrito é sua compatibilidade com estudos in vitro e in vivo subsequentes.

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

A manipulação da expressão gênica temporal na diferenciação de células-tronco embrionárias (ESCs) pode ser alcançada usando sistemas gênicos induzíveis. No entanto, a geração dessas linhagens celulares é cara e demorada. Este protocolo alcança a expressão rápida de um transgene na diferenciação de células derivadas de ES e subsequente análise da diferenciação hematopoiética a jusante.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Apresentamos um protocolo rápido e flexível para um único sistema de expressão in vivo baseado em receptor de células T (TCR) retroviral.  Vetores retrovirais são usados para transduzir células progenitoras da medula óssea para estudar o desenvolvimento de células T e a função de um único TCR in vivo como uma alternativa aos camundongos transgênicos TCR.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

Descreve-se aqui um novo método para gerar receptores de células T específicas para o antigénio (TCR) por emparelhamento a TCRα ou TCRβ de um TCR existente, possuindo a especificidade do antigénio de interesse, com hemichain complementar do repertório do receptor de células T periféricas. Os TCRs gerados de novo manter-antigénio com especificidade uma afinidade variável.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Apresentamos protocolos aprimorados para transdução retroviral de receptores de tráfego e homing competitivo para estudar o posicionamento de linfócitos específicos de órgãos e microambientes mediados por receptores. Este método oferece informações valiosas sobre os mecanismos de tráfego de células imunes e tem aplicações potenciais em futuras pesquisas básicas e terapêuticas.

Transdução retroviral eficiente e homing competitivo para investigar a localização de células T mediadas por GPCR em diversos microambientes teciduais

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

Este protocolo descreve as etapas essenciais para o cultivo das células T primárias, incluindo seu isolamento, ativação, expansão e transfecção transitória por eletroporação de mRNA. Além disso, é proposto um fluxo de trabalho e um painel de anticorpos para análise citométrica de fluxo do fenótipo, marcadores de ativação, viabilidade e expressão do receptor de antígeno quimérico (CAR).

Isolamento, cultivo e transfecção transitória de células T humanas primárias para gerar células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

Aprenda a isolar cadeias TCR alfa e beta de célula única e gerar vetores retrovirais para expressão in vitro e in vivo. Este método de PCR em duas etapas permite análise de repertório sem conhecimento prévio da sequência.

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

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