Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como o repertório TCR alfa e beta da população específica de um antígeno, bem como a funcionalidade in vivo dos TCRs humanos. As principais vantagens desta técnica são a eficiência relativamente alta da reação de PCR, bem como sua compatibilidade com a clonagem TCR subsequente. Este protocolo usa uma PCR de duas etapas para amplificar as cadeias TCR alfa e beta de uma única célula sem conhecimento prévio da sequência TCR.

A primeira PCR é uma reação multiplex usando um conjunto de primers específicos da região variável alfa ou beta em conjunto com um primer específico para a região constante. A segunda PCR é uma reação aninhada que se prepara da sequência do adaptador incorporada nas cinco extremidades principais do produto da PCR, bem como uma sequência interna de região constante. Esses primers também incorporam locais de restrição exclusivos nas cinco extremidades principais e três principais do produto de PCR para facilitar a clonagem subsequente.

Uma vez clonada no vetor modelo, a sequência TCR codificada é quimérica, consistindo em regiões variáveis humanas com regiões constantes de espelhamento. A construção quimérica do TCR permite a interação entre o TCR e o complexo de sinalização CD3 de espelhamento, tornando este protocolo de clonagem de TCR compatível com estudos funcionais subsequentes em linhagens celulares de espelhamento e em modelos de camundongos humanizados. Configure para a classificação de célula única preparando os reagentes de transcrição reversa em uma área limpa e sem molde.

Geralmente, indivíduos novos no método de PCR de célula única terão dificuldades devido aos baixos níveis de modelo. Por outro lado, a sensibilidade da PCR aninhada multiplex é sensível a baixos níveis de contaminação do modelo. Portanto, é necessário limpar completamente as áreas nas quais você configurará as reações de PCR.

Uma mistura de três primers reversos específicos para a região constante das cadeias alfa e beta são usados nesta reação. Preparar a master-mix de transcrição inversa combinando os reagentes num reservatório de pipetagem. Para contabilizar o erro de pipetagem, faça mistura de reação suficiente para dez poços extras.

Use um multicanal para pipetar seis microlitros por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Cubra o prato frouxamente com um selo e mantenha o prato no gelo. Prepare as células T para a classificação de uma única célula, colorindo as células com anticorpos para marcadores de superfície celular.

Classifique as células T de uma só vez por poço, deixando as doze linhas vazias, o que servirá como um controle negativo. Sele a placa com filme adesivo e gire a 1000g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Execute imediatamente a reação de transcrição reversa.

Se possível, execute a primeira reação de PCR no mesmo dia. Para executar a reação multiplex, misture separadamente as misturas principais de PCR V alfa e V beta em reservatórios de pipetagem. Mantenha a placa com cDNA no gelo ou em um bloco frio.

Transfira 22,5 microlitros de reação TCR beta para uma nova placa de PCR de 96 poços. Em seguida, use um multicanal para transferir 2,5 microlitros de cDNA para a placa de PCR. Use um multicanal para pipetar 22,5 microlitros de reação TCR alfa diretamente na placa que contém o restante do cDNA.

Sele as placas com adesivo, bata suavemente e gire brevemente para baixo. Execute a primeira reação de PCR. As placas podem ser armazenadas a 20 graus Celsius.

No dia seguinte, prepare as segundas reações de PCR aninhadas. Usando um multicanal, pipete as misturas principais para as reações TCR alfa e TCR beta a 22,5 microlitros por poço em duas novas placas de PCR de 96 poços. Adicione o modelo de reação de PCR multiplex a 2,5 microlitros por poço.

Sele as placas, bata suavemente e gire brevemente para baixo. A primeira reação de PCR restante deve ser selada e armazenada a 20 graus Celsius para servir como fonte de modelo de backup. Execute a segunda reação de PCR.

Após a conclusão da segunda reação de PCR aninhada, esgote cinco microlitros da reação em um gel de agarose a 1%. Inclua os poços de controle positivo e negativo. A banda esperada deve ter cerca de 500 pares de bases de tamanho.

Purifique o restante da segunda reação, vinte microlitros, usando um kit de purificação por PCR no formato de 96 poços e execute o sequenciamento de Sanger. As sequências de TCR obtidas podem ser analisadas usando software imunogenético disponível online. As informações da sequência podem ser usadas para avaliar o repertório e a clonalidade da população de células T.

As sequências alfa e beta do TCR emparelhadas podem ser usadas em análises funcionais adicionais. Execute ligações consecutivas de TCR beta e TCR alfa no vetor de modelo. O modelo TCR beta e TCR alfa são substituídos pelas cadeias amplificadas por PCR.

Na primeira ligação, o modelo TCR beta é substituído pela cadeia beta amplificada por PCR. Após a inserção bem-sucedida do TCR beta ter sido verificada por sequenciamento de resumo de teste, substitua o modelo TCR alfa pela cadeia alfa amplificada por PCR. HEK293T células são usadas para testar o emparelhamento bem-sucedido da cadeia TCR e a expressão da superfície celular.

HEK293T células são cotransfectadas com o vetor TCR marcado pelo repórter fluorescente ametrino e um vetor que codifica o complexo CD3 marcado por GFP. A expressão superficial do TCR quimérico é verificada por citometria de fluxo, colorindo as células com anticorpo CD3 anti-camundongo. O nível de expressão de CD3 de superfície em células transfectadas com a construção quimérica de TCR deve ser comparável àquelas transfectadas com o vetor de modelo de controle totalmente espelhado.

Em resumo, descrevemos um protocolo eficiente baseado em PCR para a identificação e clonagem de cadeias TCR pareadas a partir de células únicas. Prevemos que esta será uma ferramenta valiosa para estudar as respostas das células T humanas na autoimunidade, vigilância de tumores e eliminação de patógenos. A principal vantagem do protocolo de PCR aqui descrito é sua compatibilidade com estudos in vitro e in vivo subsequentes.