Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

O objetivo geral deste experimento é visualizar a formação de vasos sanguíneos In Vivo em andaimes tridimensionais em tempo real por microscopia multifóton. Estes medidos são questões-chave no campo gerador de osso, como neutralizar e enganar a formação de vasos sanguíneos in vivo em andaimes tridimensionais em tempo real. A única vantagem dessa técnica é que ela permite neutralizar simultaneamente o CERES, as métricas extracelulares e as redes moleculares circundantes in vivo.

Para começar, prepare uma solução homogênea contendo 20 gramas de PLGA e 20 mililitros de 1,4 dioxano. Em seguida, adicione dois gramas de nHAP em pó à solução. Usando um agitador magnético, misture a suspensão vigorosamente a 1500 rpm em temperatura ambiente por 16 horas para formar uma pasta uniforme que será usada para imprimir andaimes PLGA NHAP porosos.

Depois de impressos, liofilize os andaimes por 48 horas para remover completamente qualquer solvente. E então esterilize-os em etanol a 75% por uma hora. Depois, lifalize-os mais uma vez para obter material anti-séptico neutro.

Em seguida, adicione quatro vírgula cinco vezes 10 elevado ao quinto das partículas lentivirais a cada andaime e deixe as partículas serem absorvidas em uma incubadora umidificada mantendo 37 graus Celsius por duas horas. Agora que a partícula lentiviral foi absorvida nos andaimes, lave os andaimes duas vezes com dois mililitros de PBS para remover quaisquer resíduos não ligados. Congele os andaimes lavados em nitrogênio líquido.

E depois de lifalyzing mais uma vez, armazene-os a menos 80 graus Celsius para estudos posteriores. Transfira andaimes 3d previamente revestidos com quatro vírgula cinco vezes dez para a quinta partículas lentivirais carregando proteína fluorescente verde em frascos criogênicos de dois vírgula zero mililitro preenchidos com um mililitro de DMEM completo e incube-os a 37 graus Celsius com agitação por cinco dias. A cada doze horas de incubação, coletar amostras de um mililitro do meio contendo partículas lentivirais liberadas dos andaimes e substituí-las por um mililitro de meio fresco.

Para transduzir HEK293T células, primeiro remova o meio das células HEK293T cultivadas em uma placa de 12 poços e lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione um mililitro do meio coletado anteriormente às células HEK293T lavadas e incube a placa por 48 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada. Após 48 horas de incubação, medir o número de células HEK293T positivas para GFB por citometria de fluxo para determinar o número de partículas lentivirais bioativas.

Para começar, divida aleatoriamente os camundongos C57 pretos seis em três grupos de tratamento: controle, PH e PHp de 14 animais cada. Raspe a pele da cabeça de um camundongo anestesiado e desinfete a superfície com uma tintura de iodo e, em seguida, uma solução alcoólica a 75%. Coloque a cabeça do rato em um instrumento estereotáxico e dimensione a pele com um bisturi e, em seguida, usando uma tesoura, faça um corte linear de um centímetro.

Usando um cotonete estéril, raspe o periósteo do osso craniano para revelar sua superfície. Em seguida, no lado esquerdo do crânio, crie com uma broca de trefina um defeito de tamanho crítico de quatro milímetros de diâmetro. Transplante o andaime para o lado do defeito ósseo.

Use uma pinça oftálmica para cobrir suavemente o local da cirurgia com o periósteo. Depois, feche a ferida aplicando três pontos por cada centímetro de incisão. Por fim, administre o analgésico buprenorfina para controlar a dor pós-operatória e mantenha o animal em uma almofada térmica para manter a temperatura corporal até acordar.

Quando o camundongo recuperar a consciência, forneça comida e água e monitore sua atividade diária até o final do experimento. Depois de montar o sistema de microscopia multifóton para imagens TPEF e SHG, ajuste o laser de safira de titânio de femtossegundo para 860 nanômetros. Para visualizar os vasos sanguíneos recém-formados, injete no camundongo por via intravenosa 200 microlitros de uma solução de dextrana de 10 miligramas por mililitro em solução salina e, em seguida, usando o instrumento estereotáxico, imobilize o animal anestesiado em uma placa de aquecimento para manter sua temperatura corporal em 37 graus Celsius.

Injete no camundongo 200 microlitros de solução salina por via intraperitoneal para evitar a desidratação. Finalmente, forneça ao animal uma mistura de três por cento de isoflurano em oxigênio a 100 por cento para manter anestesia e analgesia suficientes durante a imagem. Para começar a criar imagens, escaneie um par de espelhos de galvo para criar uma área de amostragem de 512 por 512 micrômetros.

Em seguida, usando uma lente objetiva de imersão em água NA de um ponto O, focalize o feixe de excitação na amostra e colete o sinal TPEF HSG espalhado de volta. Defina o campo de visão para cobrir a área óssea normal e a borda do defeito no grupo controle, mas apenas o andaime implantado ao obter imagens do animal do grupo PH ou PHp. Em seguida, escaneie cinco locais diferentes do defeito.

Adquira pilhas de imagens a cada 12 segundos durante um período de imagem de duas horas. Aqui é apresentada uma fotografia do andaime preparado com a técnica de impressão 3D, juntamente com uma imagem de micro-CT mostrando a porosidade geral do material preparado. A estrutura microporosa do andaime é mostrada em uma imagem SEM adquirida com ampliação de 5000 vezes.

Como mostrado, HEK293T células tratadas com meios contendo partículas lentivirais liberadas dos andaimes expressaram eficientemente a proteína fluorescente verde. Conforme estimado por citometria de fluxo, o número total de partículas liberadas atingiu aproximadamente 40%. O efeito de liberação mais robusto foi observado nas primeiras 24 horas do estudo e diminuiu gradualmente ao longo do tempo, confirmando que as partículas lentivirais revestidas nos scaffolds mantêm sua atividade biológica por até 96 horas.

A análise in vivo dos vasos sanguíneos formados dentro de um defeito ósseo da calvária mostrou que novos vasos sanguíneos, embora indetectáveis no grupo controle de camundongos, eram claramente visíveis nos grupos PH e PHp oito semanas após o transplante de andaime. Além disso, enquanto nos grupos PH e PHp muitos locais de deposição de colágeno foram detectados, apenas no grupo PHp um número crescente de vasos menores crescendo em andaimes pôde ser observado e a área geral dos vasos sanguíneos foi significativamente diferente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de imobilizar a cabeça do mouse para mantê-lo imóvel durante a varredura para evitar artefatos. Após este procedimento, outros métodos, como imagens fotoacústicas, podem ser realizados para fornecer dados adicionais, como imagens de tecidos profundos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de regeneração óssea investigarem a angiogênese em transplantes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a formação de plasma in vivo em andaimes 3D em tempo real e microscopia de microfótons.