Name: Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a isolar e enriquecer células B antígeno-específicas raras do sangue periférico humano usando nanopartículas magnéticas para análise fenotípica e funcional. Esta técnica avançada supera problemas geométricos e de fluxo.

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Este trabalho foi apoiado por doações da JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) e dos Institutos Nacionais de Saúde (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 e F30OD021477).

1. Isolamento de PBMC humanas <ol><li> Colete de 30-50 ml de sangue, utilizando tubos de coleta de sangue heparinizado. NOTA: A quantidade de sangue usado depende da questão experimental particular e frequência no sangue de células B específicas para o antigénio de interesse. O sangue heparinizado podem ser processados ​​imediatamente ou agitadas suavemente durante a noite à temperatura ambiente, durante o processamento do dia seguinte. O atraso no processamento tem muito pouco efeito sobre a eficácia do enriquecimento e está associada com o mínimo de perda de viabilidade. </li><li> Misture sangue completo a 1: 1 com solução estéril, de magnésio e de cálcio temperatura ambiente livre de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). </li><li> Num tubo de 50 ml estéril, adicionar 10 ml de solução de gradiente de densidade temperatura ambiente. Armazene as garrafas de gradiente de densidade abertos no escuro a 4 ° C, mas quente à temperatura ambiente antes do uso. </li><li> Se possível definir a arma pipeta para o ajuste lento e / ou aplicar muito pouco, mas consistente, a pressão de gatilho para lentamentecamada de 30-35 ml de sangue diluído em cima do gradiente de densidade, tendo cuidado para não misturar os dois. NOTA: Colocar a ponta da pipeta contra o bordo das 50 ml cónica, enquanto a adição do sangue diluído irá ajudar a assegurar um fluxo constante consistente. </li><li> Centrifuga-se a 400 xg durante 30 min a 20 ° C, com o travão de desligado. </li><li> Retirar a camada superior, que contém plasma e plaquetas, tendo o cuidado de não perturbar a camada de células mononucleares abaixo. </li><li> Usando uma pipeta estéril, recolher a camada de células mononucleares (buffy coat) e coloque em um tubo de 50 ml estéreis diferentes. </li><li> Adicionar PBS à suspensão de células até um volume de 50 ml. Centrifuga-se a 400 xg durante 10 min a 20 ° C, com travão. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 10 ml de PBS. Contagem de células e determinar a viabilidade utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado. </li><li> Ressuspender as células em 10 7 células / ml e colocar em gelo até estar pronta para posterior processamento.</li></ol> 2. Coloração de células <ol><li> Remover 1-2 x 10 6 células para cada compensação de fluorescência / controle FMO necessário, se for o caso. Centrifugar restante das células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio. </li><li> Ressuspender as células em tampão estéril filtrada, frio FACS (PBS + 1% de albumina de soro bovino (BSA) + 0,01% de azida de sódio) a 3-6 x 10 7 células / ml (em remover um tubo de centrífuga de 1,5 ml). Certifique-se de que o tampão FACS é frio e mantê-lo em gelo durante todo o processo de coloração. <ol><li> Dividir a população de células em quartos (AD) quando optimizar o ensaio. Use fracção A para enriquecer as células B específicas do antigénio de interesse, usa frações B e C para determinar a especificidade do enriquecimento / coloração (ver 2.5 e 2.6 abaixo), e fração de uso D para determinar a frequência eo número de células antígeno-específicas em a população não enriquecido para permitir o cálculo de rendimento e dobre-enriquecimento. </li></ol></li><li> Adicionar re bloqueando FcyR humanaagente de fracções AD em gelo para evitar a ligação de anticorpos aos receptores de Fc. NOTA: Siga as instruções do fabricante para as condições adequadas. </li><li> Adicionar anticorpos fluorocromo-conjugados com antigénios de superfície celular de interesse para AD fracções durante 30 minutos em gelo no escuro, tendo cuidado para não incluir fluorocromos que podem reagem de forma cruzada com os anticorpos anti-corante vermelho-distante-fluorescente acopladas a nanopartículas magnéticas. NOTA: Estes incluem anticorpos conjugados a corantes fluorescentes infravermelho próximo, Cy5, Cy5.5, e Cy7. Qualquer mancha de viabilidade que são adicionados deve ser compatível com o uso de um fixador. Se não se pretende analisar as células que utilizam FACS, mas determinar a frequência secretoras de anticorpo, por exemplo, por ELISPOT, a coloração da superfície com anticorpos é desnecessária. </li><li> Para testar a especificidade do ensaio, incubar Fracção B com uma quantidade suficiente de antigénio não marcado durante 30 min em gelo, de tal modo que a maioria dos receptores, com uma afinidade de pelo menos10 -6 M estão bloqueadas. NOTA: Tipicamente, uma boa concentração de partida de um excesso de 50-100 vezes a quantidade de antigénio considerado suficiente no ponto 2.6 abaixo (por exemplo 50-100 mM). Isto deve bloquear as células B com uma elevada afinidade para o antigénio não marcado para se ligar ao antigénio biotinilado, que é adicionado no passo 2.6 abaixo, permitindo, assim, a confirmação da especificidade das células enriquecidas. Esta etapa pode ser completada em conjunto com o passo 2.4 acima. </li><li> Adicionar antigénio biotinilado para as Fracções A, B e D. Incubar em gelo durante 30 min. NOTA: A concentração de antigénio biotinilado deve ser titulado para determinar a quantidade óptima necessária para assegurar a detecção e a separação de células a partir de células espectadoras ligação não-específica adequada. Tipicamente, uma boa concentração de partida de teste é 1-5 uM. NOTA: Para as Fracções A e D, este passo pode ser realizado simultaneamente com a etapa 2.4 acima. Para Fracção B, esta etapa deve ser feito após o passo 2.5 (lavagem em betwpassos een é desnecessária). </li><li> Omitir antigénio biotinilado de Fracção C, a fim de determinar qualquer ligação de células B a outros reagentes no protocolo, tais como estreptavidina corante vermelho-distante-fluorescente e as esferas magnéticas. </li><li> Lavar as células duas vezes por suspensão das células em 1 ml de tampão FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugação a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Após a lavagem final, dilui-se suspensão de células de concentrado em 1 ml de 2% de formaldeído por 5 x 10 7 células e deixar assentar no escuro em gelo durante 5 min. NOTA: A fixação das células neste ponto assegura que o antigénio biotinilado permanece ligado ao BCR para o restante do processo. Para as células viáveis ​​- para análise a jusante, como em ELISPOTs ou transferências adoptivas, omitir o passo de fixação. </li><li> Lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender em 1 ml FACS frio tampão por 5 x 107 células. </li><li> Adicionar corante 1-2 ug de estreptavidina-far-vermelho fluorescente / ml e incubar em gelo durante 20 min no escuro. Titula-se a quantidade de estreptavidina para cada aplicação. </li><li> Lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão de FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. preparação Fracção D é completado neste ponto, uma vez que não irá sofrer enriquecimento utilizando as esferas magnéticas. NOTA: Este exemplo vai ser utilizada para determinar a frequência e o número de células B específicas do antigénio na amostra. Isto irá ser utilizado para determinar o rendimento e dobra-enriquecimento alcançado por enriquecimento. </li></ol> 3. Magnetic Enriquecimento à base de nanopartículas <ol><li> Ressuspender as células a partir de amostras de CA em 1 ml de tampão frio de separação (PBS + BSA a 0,5% + EDTA a 2 mM) por 5 x 10 7 células e passar através de um filtro de 40 um para eliminar quaisquer aglomerados que podem obstruir a coluna. </li><li> Adicionar Anti-Cy5 / nanopartículas de corante Anti-far-vermelho-fluorescente. for resultados óptimos, a concentração de nanopartículas deve ser titulada para cada utilização, mas um bom ponto de partida é de 50 ul por suspensão de 5 x 10 7 células / ml. Girar no escuro a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Lavar duas vezes com 1 ml de tampão de separação a frio a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 1 ml de tampão frio separação por 5 x 10 7 células. </li></ol> 4. Enriquecimento Magnetic Usando LS ou colunas LD <ol><li> Coloque três LS ou colunas LD no campo magnético de um separador magnético e adicionar 3 ml de tampão de separação para molhar as colunas (ver descrição do produto para determinar qual o tipo de coluna é o mais adequado). Permitir que todos os 3 ml de passar através da coluna e descartar após a sua recolha. Nota: Embora a separação de células de nanopartículas magnéticas marcado pode ser realizada utilizando qualquer um dos dispositivos de separação magnéticos que estão comercialmente disponíveis, o laboratório teve o maior sucesso com a utilização de colunas LS, em Terms de rendimento, pureza e eficiência do enriquecimento. </li><li> Colocar os tubos três cónicos de 15 ml etiquetados &quot;Fracção A / (B) / (C) negativo&quot;, para células seleccionadas negativamente, sob a coluna. Adicionar a partícula magnética células marcadas com a respectiva coluna e permitir que todo o volume para passar através. </li><li> Adicionar 3 ml de tampão de separação a frio na parte superior, e permitir que esta passe através da coluna e repetir com 2 ml. Coletar as células selecionadas negativamente e reserve em gelo. </li><li> Retirar a coluna do campo magnético e colocar na parte superior de um tubo cónico de 15 ml rotulados &quot;Fracção A / (B) / (C) positivas&quot;, para células seleccionadas positivamente. </li><li> Encher a coluna ao topo com cerca de 6 ml de tampão de separação e imediatamente mergulhar este volume através da coluna para recolher as células que tinham ligado ao campo magnético utilizando o êmbolo fornecida. </li><li> Para aumentar a pureza, as células positivamente seleccionadas pode ser ainda mais enriquecido utilizando uma segunda coluna limpo, repetindo o procedidure. </li><li> Girar ambas as fracções negativamente e positivamente seleccionadas a 400 xg durante 10 min a 4 ° C e suspender em volume final desejado. Prosseguir com a análise a jusante, tais como FACS, ELISPOT ou transferência adoptiva. </li></ol>

<ol><li>de Wildt, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+analysis+and+production+of+monoclonal+antibody+fragments+originating+from+single+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells.</a> J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).</li>
<li>Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fractionation+and+arrangement+on+fibers%2C+beads%2C+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).</li>
<li>Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+simple+method+for+the+preparation+of+lymphocytes+bearing+specific+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors.</a> Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).</li>
<li>Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+centrifugation+procedure+for+the+purification+of+sheep+erythrocyte+antigen-binding+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells.</a> J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).</li>
<li>Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-enriched+b+cells.+I.+Purification+and+response+to+thymus-independent+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens.</a> J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).</li>
<li>Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+antigen-specific+B+lymphocytes+by+means+of+immunomagnetic+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles.</a> Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).</li>
<li>Smith, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+anergic+B+cells+in+prediabetic+and+new-onset+type+1+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients.</a> Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).</li>
<li>Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+specificity+contributes+to+the+outcome+of+diabetes+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice.</a> J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).</li>
<li>Woda, M., Mathew, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+dengue+viruses+as+probes+to+identify+antigen-specific+memory+B+cells+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).</li>
<li>Nair, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+fluorescent+labeling+to+identify+memory+B+cells+specific+for+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+vaccine+antigens+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo.</a> Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).</li>
<li>Amanna, I. J., Slifka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+rare+memory+B+cell+populations+by+two+independent+and+complementary+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches.</a> Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).</li>
<li>Scheid, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+identification+of+HIV+gp140+binding+memory+B+cells+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood.</a> Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).</li>
<li>Doucett, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+characterization+of+virus-specific+B+cells+by+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry.</a> Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).</li>
<li>Malkiel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+for+Autoreactive+B+Cells+in+Peripheral+Blood+of+Lupus+Patients+Assessed+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry.</a> Arthritis Rheumatol. , (2016).</li>
<li>Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+B+cell+populations+mediate+early+and+late+memory+during+an+endogenous+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response.</a> Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).</li>
<li>Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD20+positive+human+B+lymphocytes+separated+with+the+magnetic+cell+sorter+%28MACS%29+can+be+induced+to+proliferation+and+antibody+secretion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.</a> Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos aqui um novo método para realizar o isolamento e enriquecimento de células B de ligação ao antigénio a partir de sangue periférico humano. O método é facilmente aplicável a ratinhos e a outros tecidos, tais como o baço e nos nódulos linfáticos, e é compatível com a análise pós-enriquecimento de fenótipo e função (manuscrito em preparação) célula. O utilizador deve ter conhecimento de um número de variáveis ​​que podem afectar o sucesso deste procedimento. A partir da experiência ...

Diluição limitante análise de frequência do precursor de células secretoras de anticorpos sugerem que as células B reactivas a um antigénio particular ocorre tipicamente a uma frequência de 0,05 a 0,005% no repertório normal, dependendo do estado de vacinação e tamanho / número de epítopos presentes no antigénio. A baixa frequência destas células tornou difícil para estudar alterações do seu estatuto durante o desenvolvimento de respostas imunitárias, tais como a seguir a vacinação ou a exposição a um antigénio estranho, ou durante o desenvolvimento da auto-imunidade. Anteriormente, os investigadores assumiram isolamento das células B de antigénio reactivo usando técnicas que vão desde a placas revestidas com antigénio ou adsorventes de coluna, para reajuste de glóbulos vermelhos revestidos com o antigénio, a célula de triagem 1, 2, 3, 4, 5, 6 fluorescência-activado. though estas técnicas têm tido êxito na identificação e isolamento de células de antigénio-reactivo B, os resultados variaram em termos de rendimento, pureza e escalabilidade. Recentemente, desenvolveram um novo método para detectar e enriquecer subpopulações de linfócitos B raros usando nanopartículas magnéticas. O método permite o enriquecimento com um rendimento relativamente elevado e pureza a partir de grandes populações de partida, e é compatível com a análise das respostas ao antigénio. Por enriquecimento de populações de células em suspensão, o método elimina restrições que estão associadas com a geometria de placas ou colunas revestidas com antigénio, e o rendimento limite. Finalmente, uma vez que as células enriquecidas permanecem associadas com o antigénio e um repórter fluorescente, que pode ser adicionalmente purificado por separação por FACS. Tal como aqui descrito, temos usado esta abordagem para o estudo de células B de sangue tétano toxóide-reactivo periféricos antes e após a imunização de seres humanos, assim como células B auto-antigénio de reactivo de pacientes com diversas autoidistúrbios mmune, incluindo diabetes do tipo 1, doença de Graves e doença de Hashimoto 7. O método funciona igualmente bem no ratinho e humano, e é compatível com a análise de células de antigénio-reactivo B a partir de uma variedade de tecidos (manuscrito em preparação). No seu formato básico, células mononucleares de sangue periférico são primeiro incubadas com o antigénio biotinilado, juntamente com anticorpos para antigénios de superfície celular necessárias para a análise fenotípica. Esta etapa de rotulagem é seguida pela lavagem e fixação, e adição de estreptavidina acoplada a medida de corante-vermelho fluorescente para a detecção das células de ligação biotinilado-antigénio (Figura 1). Estudos anteriores identificaram as células B específicas do antigénio de um modo semelhante, mas utilizando antigénios directamente conjugado com um fluorocromo 8, 9, 10, 11. Embora esta seja uma dignaabordagem, a utilização de antigénios biotinilados em conjugação com estreptavidina permite uma maior amplificação de sinal (por conseguinte, uma melhor diferenciação de células não-ligação e de ligação), em particular quando os antigénios são pequenos 12, 13, 14. Uma consideração adicional é a utilização de estreptavidina em vez de avidina desglicosilada devido estreptavidina é, diminuir a ligação não específica. Além disso, usamos corante vermelho-distante-fluorescente como fluorocromo, devido à sua fotoestabilidade, rendimento quântico (brilho), e seu pequeno tamanho (~ 1,3 kDa). Fluorocromos proteínas, como ficoeritrina (~ 250 kDa) e aloficocianina (~ 105 kD) 15 não são ideais porque eles potencialmente conter muitos epítopos antigênicos. A utilização de um pequeno composto orgânico corante fluorescente de um único epítopo, tal como corante vermelho-distante-fluorescente, reduz a complexidade da população de células isoladas. Uma vez que as células são biotinilados-Antigen e adsorvido dye-estreptavidina far-vermelho-fluorescente, eles são enriquecidos usando nanopartículas magnéticas corante conjugado anti-far-vermelho-fluorescente. Nanopartículas individuais não são detectados pela maior parte dos citómetros de fluxo e, portanto, não necessitam de ser removidos antes da purificação por separação por FACS e ensaios a jusante 16. selecção magnética para células B específicas do antigénio enriquece a população de interesse, eliminando o tempo e custo da triagem eventos raros usando um citómetro de fluxo. Abaixo, mostramos resultados representativos de enriquecimento de células tétano-específicas do toxóide B de um assunto antes e sete dias após a imunização com toxóide tetânico reforço. Nós escolhemos esta aplicação particular como um exemplo para demonstrar a capacidade do presente método para o enriquecimento de células B específicas de antigénio seguintes aguda na estimulação in vivo. Quando acoplada com citometria de fluxo, este método é capaz de enriquecer e diferenciação específica de antigénio naïve, memória, ecélulas plasmablast B e permite ao pesquisador acompanhar as mudanças em sua freqüência ao longo do tempo. Além disso, incluir um outro ensaio a jusante possível, por exemplo, um ensaio ELISPOT, o que demonstra que as células conservam a capacidade de segregar anticorpos após o enriquecimento. Outra aplicação do presente método pode envolver a transferência adoptiva de células enriquecidas em um hospedeiro. Nós mostramos anteriormente células de manter a capacidade para actuar como antigénios das células para as células T específicas de antigénio seguintes isolamento e transferência apresentando (dados não mostrados). Assim, há uma série de ensaios a jusante possíveis que podem ser acopladas com o método, que em conjunto informa a compreensão da resposta imunitária específica do antigénio. Nós descrevemos o método abaixo, incluindo controles para determinar o rendimento global, pureza, especificidade celular, e dobre-enriquecimento.

<table><tbody><tr><td>Variável de antígeno de interesse</td><td></td><td>variável</td><td>Pelo menos 100 &mu; g para biotinilar facilmente; se estiver usando proteína, tente usar proteína que tenha sido validada por ELISA. Deve ser transportadora&nbsp; sem proteínas.</td></tr><tr><td>Biotina para rotulagem; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotina</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>A biotina está disponível em diferentes formulações, como as que contêm vários espaçadores de comprimento, portanto, o tipo usado deve ser determinado pelo pesquisador</td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S21374</td><td>Pode ser obtido de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microesferas</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-395</td><td></td></tr><tr><td>LS Colunas</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS separadores manuais</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>variável</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td></td><td></td><td>Diluir a 2% com PBS; opcional se o ensaio a jusante exigir células</td></tr><tr><td>vivas PBS sem cálcio e magnésio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Sangue total em tubos</td><td></td><td></td><td></td>de coleta heparinizados</tr><tr><td>Tampão FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% azida sódica)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de separação (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>cônicos de 15 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 ml Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reativos a marcadores de superfície, Fc Block, mancha discriminante viva/morta, se necessário</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suprimentos ELISPOT, se necessário</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecção e enriquecimento da rare células b antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

células B reativas com um antígeno específico geralmente ocorrem com uma frequência de <0,05% dos linfócitos. Durante décadas, os pesquisadores buscaram métodos para isolar e enriquecer essas células raras para estudos de seu fenótipo e biologia. As abordagens são inevitavelmente baseadas no princípio de que as células B reconhecem o antígeno nativo em virtude dos receptores de superfície celular que são representativos na especificidade dos anticorpos que eventualmente serão secretados por suas filhas diferenciadas. Talvez a abordagem mais óbvia para o problema envolva o uso de antígenos conjugados com fluorocromo em conjunto com a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). No entanto, a utilidade desses métodos é limitada pela frequência celular e pela taxa alcançável de análise e isolamento por classificação eletrônica. Um novo método para enriquecer células B raras específicas de antígenos usando nanopartículas magnéticas que resulta em enriquecimento de alto rendimento de células B reativas a antígenos de grandes populações de células iniciais é descrito. Este método permite um melhor monitoramento do fenótipo e da biologia das células reativas ao antígeno antes e após o encontro com o antígeno in vivo, como após a imunização ou durante o desenvolvimento da autoimunidade.

Análise de pureza, rendimento, e dobre-o enriquecimento usando citometria de fluxo Populações enriquecidas como descrito acima, inevitavelmente conter células contaminantes que não se ligaram corante estreptavidina far-vermelho-fluorescente, mas estão presos na matriz. Estas impurezas podem ser removidas a partir de populações enriquecidas por separação FACS. Para estimar a pureza das populações enriquecidas, portão em células vi...

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

O objetivo geral deste procedimento simples, porém eficaz, é isolar e enriquecer células B raras com ligação a antígenos a partir do sangue periférico humano utilizando nanopartículas magnéticas para sua análise fenotípica e funcional. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia sobre o fenótipo e a biologia de células B raras com ligação a antígenos, tanto antes quanto após o encontro com antígeno in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela elimina problemas associados à geometria, particularmente quando se utiliza uma placa de estireno ou uma esfera grande.E elimina os problemas associados à taxa de fluxo ao isolar células por citometria de fluxo para obter células raras em populações celulares iniciais bastante grandes. Imediatamente após coletar de 30 a 50 mililitros de sangue total em tubos de coleta de sangue heparinizados, misture o sangue em uma proporção de 1:1 com PBS sem magnésio e sem cálcio, estéril e à temperatura ambiente. Em seguida, sobreponha a mistura de sangue sobre 10 mililitros de solução de gradiente de densidade à temperatura ambiente em um tubo cônico estéril de 50 mililitros, utilizando pressão lenta e constante no gatilho da pipeta.Sequencie as células por centrifugação. Descarte a camada superior contendo plasma e plaquetas e use uma pipeta estéril para transferir o coágulo de células mononucleares, chamado de buffy coat, para um novo tubo estéril de 50 mililitros. Complete o tubo com até 50 mililitros de PBS para a lavagem das células mononucleares por centrifugação.Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de PBS fresco para contagem e ressuspenda as células em uma concentração de 1x10^7 células por mililitro em PBS fresco sobre gelo. Para corar as células para ligação de microesferas magnéticas, transfira primeiramente alíquotas de 1-2x10^6 células para tubos de poliestireno de cinco mililitros para cada compensação de fluorescência e controle de Fluorescência Menos Um, conforme apropriado. Em seguida, colete o restante da amostra celular por centrifugação e ressuspenda o pellet em uma concentração de 3-6x10^7 células por mililitro em tampão FACS estéril filtrado e frio.Divida igualmente a solução celular em quatro tubos FACS sobre gelo e adicione o reagente bloqueador de receptor Fcgama humano a essas quatro frações de amostra experimentais. Ao final da incubação de bloqueio da ligação inespecífica, adicione os anticorpos conjugados com fluorescência apropriados para marcação da superfície celular às células nas quatro frações de amostra. Em seguida, adicione o antígeno biotinilado apropriado às frações A e D, seguido pela adição de um volume suficiente de antígeno não marcado à fração B, de modo que a maioria dos receptores com afinidade de pelo menos 1x10^6 molar seja bloqueada.Incube todas as amostras por 30 minutos no gelo, seguido por uma incubação de 30 minutos da fração B com o antígeno biotinilado apropriado. Ao final das incubações, lave as células duas vezes em um mililitro de tampão FACS frio por 5x10^7 células. E ressuspenda os pellets em um mililitro de formaldeído 2% por 5x10^7 células durante cinco minutos no escuro, no gelo.Após a fixação, lave as células mais duas vezes conforme acabou de ser demonstrado. E ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão FACS fresco e gelado por 5x10^7 células. Em seguida, marque as células com um a dois microgramas do anticorpo secundário conjugado com estreptavidina apropriado por 20 minutos no escuro e sob gelo, e lave as células mais duas vezes.Para o enriquecimento baseado em nanopartículas magnéticas, re-suspenda as frações celulares A, B e C em um mililitro de Tampão de Separação frio por 5x10^7 células e filtre as células através de filtros individuais de 40 microlitros para eliminar quaisquer agregados. Em seguida, adicione as nanopartículas marcadas com corante fluorescente na concentração apropriada por 10 minutos no escuro a quatro graus Celsius com rotação e lave as amostras duas vezes em um mililitro de Tampão de Separação frio. Re-suspenda os pellets em um mililitro de Tampão de Separação frio por 5x10^7 células.Em seguida, equilibre três colunas magnéticas em seus ímãs de tamanho apropriado com três mililitros de Tampão de Separação cada, permitindo que todo o volume do Tampão de Separação atravesse cada coluna e vá para um recipiente de resíduo. Agora, posicione um tubo cônico de 15 mililitros rotulado sob cada coluna e adicione as células marcadas com partículas magnéticas às suas respectivas colunas. Quando todo o volume de cada fração celular tiver passado por cada coluna, adicione três mililitros de Tampão de Separação fresco e gelado ao topo de cada coluna, coletando os efluentes nos tubos rotulados.Após a segunda lavagem ter drenado completamente pelas colunas, coloque os tubos com as células negativamente selecionadas de cada fração no gelo e transfira as colunas para novos tubos de 15 mililitros para cada fração. Encha cada coluna com aproximadamente seis mililitros de Tampão de Separação fresco e, imediatamente, empurre o tampão pelas colunas para coletar as células ligadas magneticamente. Em seguida, colete tanto as frações positiva quanto negativa de células por centrifugação e ressuspenda os pellets na solução apropriada para a análise subsequente planejada.Nestes gráficos, a frequência de células B reativas ao toxoide do tétano de um indivíduo que foi vacinado contra o tétano pela última vez há mais de uma década demonstra a capacidade deste método de enriquecer as células que se ligam ao toxoide do tétano aproximadamente sete vezes, com uma pureza de cerca de 4%. A adição de um excesso de 50 vezes de toxoide do tétano não marcado às células de um indivíduo vacinado cerca de três anos antes da coleta de sangue, antes da adição do antígeno biotinilado, reduz a ligação ao toxoide do tétano em 83%, demonstrando a especificidade da ligação ao antígeno. Quando o antígeno biotinilado é omitido do procedimento, apenas 0,2% das células B ainda se ligam, o que presumivelmente reflete a ligação de algum antígeno não relacionado ao tétano no agente absorvente.Esses gráficos demonstram como a frequência de células B naïve específicas para toxoide tetânico, provenientes de uma amostra de sangue coletada sete dias após a vacinação de reforço de um indivíduo saudável, diminui de 84% para 64% após o reforço. Enquanto isso, a porcentagem das populações de memória e plasmablastos aumenta de 16% para 36% e de zero para 40%, respectivamente. Além disso, dados representativos de ELISPOT obtidos de uma amostra de sangue periférico coletada sete dias após o reforço em um indivíduo saudável ilustram o enriquecimento em quatro vezes na frequência de células secretoras de anticorpos contra toxoide tetânico observado nas células B isoladas que se ligam ao toxoide tetânico.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de três a quatro horas com todos os controles adequados. O método pode ser combinado com ensaios secundários, por exemplo, transferência de células para receptores adotivos para estudos subsequentes do destino e da função celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e enriquecer células B raras que se ligam a antígenos a partir do sangue periférico humano utilizando os controles adequados.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este procedimento descreve a detecção e isolamento de leucócitos do mouse TH17 que ativamente secretam IL-17 com a estimulação.

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse...

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

Este vídeo demonstra o uso do ensaio ELISpot para avaliar a função das células B secretoras de anticorpos, ASCs. Os anticorpos secretados pelas ASCs interagem com os fragmentos de anticorpos policlonais ligados à membrana, que são detectados pelos anticorpos IgG ou IgM conjugados com enzimas. A mancha colorida produzida em cada poço indica a presença do isotipo do anticorpo específico, que se correlaciona com a atividade secretora das células B.

Avaliação funcional de células B secretoras de anticorpos usando o ensaio ELISpot

A imunofenotipagem de sangue total é indispensável para monitorar o sistema imunológico humano. No entanto, o número de reagentes necessários e a instabilidade de fluorocromos específicos em coquetéis pré-misturados exigem a preparação diária do reagente. Aqui mostramos que a preparação semiautomatizada do coquetel de anticorpos de coloração ajuda a estabelecer uma imunofenotipagem confiável, minimizando a variabilidade na distribuição de reagentes.

Uma abordagem automatizada-Semi Preparando Antibody Cocktails para Análise imunofenotípica de Sangue Periférico Humano

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.

Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.

Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Aprenda a isolar e enriquecer células B antígeno-específicas raras do sangue periférico humano usando nanopartículas magnéticas para análise fenotípica e funcional. Esta técnica avançada supera problemas geométricos e de fluxo.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

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