Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

O objetivo geral deste procedimento simples, mas eficaz, é isolar e enriquecer células B raras de ligação a antígenos do sangue periférico humano usando nanopartículas magnéticas para sua análise fenotípica e funcional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre o fenótipo e a biologia de células B raras de ligação a antígenos antes e depois do encontro de antígenos in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que ela evita problemas associados à geometria, principalmente quando se usa uma placa de estireno ou um cordão grande.

E evita problemas associados à taxa de fluxo quando se está isolando células por citometria de fluxo para isolar células raras em populações de células iniciais bastante grandes. Imediatamente após a coleta de 30 a 50 mililitros de sangue total em tubos de coleta de sangue heparinizado, misture o sangue na proporção de 1:1 com magnésio estéril em temperatura ambiente e PBS sem cálcio. Em seguida, coloque a mistura de sangue em 10 mililitros de solução de gradiente de densidade de temperatura ambiente em um tubo cônico estéril de 50 mililitros usando pressão de gatilho de pipeta lenta e consistente.

Separe as células por centrifugação. Descarte a camada superior contendo plasma e plaquetas e use uma pipeta estéril para transferir o revestimento buffy do recipiente de células mononucleares para um novo tubo estéril de 50 mililitros. Encha o tubo com até 50 mililitros de PBS para lavagem das células mononucleares por centrifugação.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de PBS fresco para contagem e ressuspenda as células a uma concentração de 1x10 ^ 7 células por mililitro em PBS fresco no gelo. Para corar as células para ligação magnética de contas, primeiro transfira alíquotas de células 1-2x10 ^ 6 em tubos de poliestireno de cinco mililitros para cada compensação de fluorescência e controle de fluorescência menos um, conforme apropriado. Em seguida, colete o restante da amostra de célula por centrifugação e ressuspenda o pellet para uma concentração de 3-6x10 ^ 7 células por mililitro em tampão FACS frio filtrado estéril.

Divida a solução celular igualmente em quatro tubos FACS no gelo e adicione o reagente bloqueador do receptor Fcgamma humano a essas quatro frações de amostra experimentais. No final da incubação de bloqueio de ligação inespecífica, adicione os anticorpos de coloração de superfície celular conjugados com fluorescência apropriados às células em todas as quatro frações de amostra. Em seguida, adicione o antígeno biotinilado apropriado às frações A e D, seguido pela adição de um volume suficiente de antígeno não marcado à fração B, de modo que a maioria dos receptores com uma afinidade de pelo menos 1x10 ^ 6 molares sejam bloqueados.

Incubar todas as amostras durante 30 minutos em gelo, seguido de uma incubação de 30 minutos da fracção B com o antigénio biotinilado adequado. No final das incubações, lave as células duas vezes em um mililitro de tampão FACS gelado por 5x10^7 células. E ressuspenda os pellets em um mililitro de 2% de formaldeído por 5x10 ^ 7 células por cinco minutos no escuro no gelo.

Após a fixação, lave as células mais duas vezes, conforme demonstrado. E ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão FACS fresco e gelado por 5x10 ^ 7 células. Em seguida, rotule as células com um a dois microgramas do anticorpo conjugado com estreptavidina secundário apropriado por 20 minutos no escuro com gelo e lave as células mais duas vezes.

Para enriquecimento à base de nanopartículas magnéticas, ressuspenda as frações das células A, B e C em um mililitro de tampão de separação a frio por 5x10 ^ 7 células e filtre as células através de filtros individuais de 40 microlitros para eliminar quaisquer aglomerados. Em seguida, adicione as nanopartículas de corante fluorescente na concentração apropriada por 10 minutos no escuro a quatro graus Celsius com rotação e lave as amostras duas vezes em um mililitro de tampão de separação frio. Ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão de separação frio por 5x10 ^ 7 células.

Em seguida, equilibre três colunas magnéticas em seus ímãs de tamanho apropriado com três mililitros de Buffer de Separação cada, permitindo que todo o volume do Buffer de Separação passe por cada coluna em um recipiente de resíduos. Agora coloque um tubo cônico de 15 mililitros rotulado sob cada coluna e adicione as células rotuladas de partículas magnéticas às suas respectivas colunas. Quando todo o volume de cada fração celular tiver passado por cada coluna, adicione três mililitros de tampão de separação fresco e gelado no topo de cada coluna, coletando os efluentes nos tubos rotulados.

Depois de a segunda lavagem ter sido completamente drenada através das colunas, colocar os tubos de células seleccionadas negativamente de cada fracção no gelo e transferir as colunas para novos tubos de 15 mililitros para cada fração. Encha cada coluna com aproximadamente seis mililitros de tampão de separação novo e mergulhe imediatamente o tampão nas colunas para coletar as células ligadas magneticamente. Em seguida, recolher as fracções celulares positivas e negativas por centrifugação e ressuspender os pellets na solução adequada para a análise planeada a jusante.

Nesses gráficos, a frequência de células B reativas ao toxóide do tétano de um indivíduo que foi vacinado pela última vez contra o tétano há mais de uma década demonstra a capacidade desse método de ser usado para enriquecer as células de ligação ao toxóide do tétano aproximadamente sete vezes com a pureza de cerca de 4% A adição de um excesso de 50 vezes de toxóide tetânico não marcado às células de um indivíduo que foi vacinado cerca de três anos antes da coleta de sangue. Antes da adição do antígeno biotinilado, a ligação tétano-toxóide é diminuída em 83%, demonstrando a especificidade da ligação ao antígeno. Quando o antígeno biotinilado é omitido do procedimento, apenas 0,2% das células B ainda se ligam, presumivelmente, refletindo a ligação de algum antígeno não tetânico no absorvente.

Esses gráficos demonstram como a frequência de células B virgens específicas do toxóide do tétano de uma amostra de sangue coletada sete dias após a vacinação de reforço de um indivíduo saudável diminui de 84% para 64% após o reforço. Enquanto a porcentagem de populações de memória e plasmablastos aumenta de 16% para 36% e zero para 40%, respectivamente. Além disso, dados representativos do ELISPOT de uma amostra de sangue periférico obtida sete dias após o reforço de um indivíduo saudável ilustram o enriquecimento de quatro vezes na frequência celular secretora de anticorpos toxóides tetânicos observada nas células B isoladas de ligação ao toxóide tetano.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de três a quatro horas com todos os controles adequados. O método pode ser combinado com ensaios secundários, por exemplo, transferência de células para receptores adotados para estudos subsequentes de destino e função celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e enriquecer células B raras de ligação a antígenos do sangue periférico humano usando os controles adequados.