Name: Expressão de citocina exógena em xenotransplantes derivados de pacientes via injeção com uma linha de células estromáticas transduzidas por citocinas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprenda a produzir citocinas humanas em xenotransplantes derivados de pacientes usando células estromáticas transduzidas. Este método elimina a necessidade de linhagens transgênicas caras e facilita estudos de hematopoiese e terapias anticâncer.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, Departamento de Patologia e Anatomia Humana, Departamento de Ciências Básicas e Centro de Disparidades de Saúde e Medicina Molecular da Escola de Medicina da Universidade de Loma Linda e por uma bolsa para promover a pesquisa colaborativa e translacional da Universidade de Loma Linda (KJP). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Este manuscrito descreve um método simples, rápido e relativamente rentável para a engenharia de PDX para expressar citoquina humana exógena. A estratégia descrita aqui é baseada em injecções intraperitoneais semanais de uma linha de células de estroma transduzidas para expressar a citoquina humana, TSLP. Antes da realização dos métodos aqui descritos, o estroma manipulado para expressar níveis elevados da citocina de interesse (TSLP) e o estroma de controlo manipulado de forma semelhante foram gerados. Nos protocolos a...

Os xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) são um poderoso modelo in vivo para estudar a produção de células hematopoiéticas normais e malignas num ambiente mamífero &quot;nativo&quot;. Na maioria das vezes, PDX são produzidos por injeção ou transplante de células humanas em ratinhos deficientes imunológicos. A produção de PDX utilizando células estaminais hematopoiéticas humanas normais permite estudos in vivo de sangue humano normal e desenvolvimento de células imunitárias. O PDX produzido a partir de leucemia ou outras células cancerosas torna possível o estudo de mecanismos oncogénicos e a identificação de terapias eficazes no contexto da gama de paisagens genéticas e mutações presentes na população humana. 1 Por conseguinte, PDX são o padrão ouro atual para a investigação biomédica translacional para identificar terapias eficazes e uma ferramenta importante para a compreensão dos mecanismos de progressão do câncer. Os modelos PDX são uma ferramenta essencial para auxiliar a pesquisa em doenças de disparidades de saúde<html> Lesões genéticas ou qualquer doença em que as variações da paisagem genética de um paciente possam contribuir substancialmente para a oncogénese e para o resultado do tratamento. Os modelos PDX de rato-humanos são possíveis porque muitas citoquinas de murganho imitam adequadamente os seus análogos humanos na activação dos receptores de citoquinas de células humanas enquanto estão dentro do rato. Por exemplo, a interleucina-7 (IL-7) proporciona um sinal crítico para o desenvolvimento de células B humanas. 2 Neste caso, IL-7 de ratinho tem homologia suficiente com IL-7 humana que a citoquina de ratinho estimula vias de sinalização em precursores de células B humanas. Entretanto, este não é o caso da linfopoietina do estroma tímico (TSLP) 5,6 , que entre outras citocinas (IL-3, fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator de células estaminais (SCF) ,7 é importante para a produção de células hematopoiéticas humanas normais e malignas Quando as citoquinas humanas e de ratinho apresentam baixa homologia, as citocinas de murganho não activam os seus respectivos receptores em células humanas Para superar este obstáculo foram utilizadas várias estratégias Para desenvolver a expressão de citoquinas humanas em ratinhos PDX, incluindo injecção de citocinas humanas recombinantes, injecção hidrodinâmica de ADN, expressão lentiviral, expressão transgénica e substituição de genes knockin.7 Este relatório descreve um método para a engenharia de PDX para produzir citoquinas humanas através de medicações mediadas por estroma Citoquina ( Figura 1 ). No mï¿½odo aqui demonstrado, os ratinhos PDX sï¿½ manipulados para expressar a citoquina humana, TSLP, ou para servir como controlos negativos para citoquinas. Os PDX que expressam TSLP são conseguidos por injecções intraperitoneais semanais de células estromais que foram transduzidas para expressar níveis elevados de TSLP humana.Os ratinhos PDX de &quot;controlo&quot; de citocinas negativas são igualmente manipulados; Embora o estroma de controlo seja transduzido com um vector de controlo. Este método atinge os níveis fisiológicos normais de TSLP humana em ratinhos PDX injectados com o estroma TSLP +. Nenhuma TSLP detectável é observada em ratinhos PDX que recebem o estroma negativo para citoquina. Nós selecionamos a linha de células de estroma humana HS-27A para nossos estudos porque cresce robustamente em cultura e mostra um nível muito baixo de produção de citocinas que não suporta a proliferação de células progenitoras isoladas em co-culturas. 8 Para a expressão de TSLP humano, o estroma foi transduzido com um vector lentiviral de auto-inactivação de geração avançada derivado de uma estrutura anterior descrita 9 , e inclui o elemento cPPT / cts e o elemento regulador pós-transcricional da hepatite de marmota (WPRE) para aumentar a expressão do transgene. O gene TSLP humano foi construído neste vector sob o controlo do factor de alongamento-1(EF-1) para conseguir uma expressão robusta, constitutiva e de longo prazo. A engenharia deste modelo de PDX realçado por citocina humana consiste em 4 etapas principais. Primeiro, o estroma transduzido é expandido in vitro e avaliado por ensaio imunoenzimático (ELISA) para produção de citocinas estáveis ​​e de alto nível. Em segundo lugar, verifica-se a actividade da citoquina humana produzida pelas células estromais transduzidas (e falta de actividade das citocinas a partir do estroma de controlo) utilizando citometria de fluxo fosfo. As linhas celulares conhecidas por serem sensíveis à citoquina de interesse (neste caso, TSLP) são incubadas com sobrenadante de células estromais e ensaiadas quanto à fosforilação induzida por citoquinas. Em terceiro lugar, os ratinhos são injectados com estroma humano transduzido e depois o plasma de rato é avaliado por ELISA para níveis de citoquina humana semanalmente. Em quarto lugar, as células hematopoiéticas humanas são transplantadas e os efeitos funcionais in vivo da citoquina humana são avaliados num alvo conhecido ( <em&gt; Eg. População de células). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Figura 1: Modelo PDX concebido para produzir citoquina humana exógena em ratinhos. ( 1A ) Experiência de projeto e obtenção de células de estroma humanas transduzidas ( 1B ) Obter células humanas (células-tronco hematopoiéticas, células de leucemia, etc. ) para gerar camundongos PDX (xenoenxertos derivados de pacientes). ( 2A ) Injectar estroma de engenharia e ( 2B ) células humanas de transplante em ratinhos deficientes em imunidade de acordo com o calendário experimental. ( 3A-B ) Monitorizar as concentrações de citoquinas no sobrenadante do estroma e no plasma do rato por ELISA. ( 4 ) Colher células humanas e avaliar os efeitos funcionais in vivo da citoquina humana presente no PDX. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui</a>Para ver uma versão maior desta figura. A entrega de citoquinas humanas através de células estromais oferece vantagens e desvantagens quando comparado com outros métodos de entrega / produção de citoquinas humanas em ratinhos PDX. Em comparação com a injecção de citoquina humana recombinante, a administração mediada por estroma é geralmente menos dispendiosa (o custo da cultura de células do estroma é inferior ao custo da citocina recombinante) e menos intensivo em trabalho (uma injecção por semana versus várias injecções por semana). A questão da meia-vida de citoquinas curtas também é atenuada uma vez que o estroma produz continuamente a citocina exógena. A administração de citoquina através de uma injecção hidrodinâmica de ADN pode ser menos dispendiosa do que a administração através de estroma. No entanto, é similarmente transitória e pode exigir mais habilidade técnica do que a simples injecção intraperitoneal semanal necessária para a entrega mediada por estroma. A expressï¿½ do gene lentiviral no ratinho pode proporcionarNsient método de entrega de citoquinas; Entretanto, em nossas mãos os níveis fisiológicos de TSLP não foram alcançados. Além disso, este método é intensivo em mão de obra, exigindo produção contínua de vetor lentiviral. Os murganhos transgénicos ou knock-in oferecem expressão a longo prazo estável de citoquina e podem ser manipulados para expressão específica de tecido, o que pode ser uma vantagem. Por outro lado, a expressão transgénica do gene da citoquina humana sobre o fundo de rato imuno deficiente requerido para ratinhos PDX, necessita de um imenso investimento de recursos antes de o valor do modelo ter sido estabelecido. Além disso, os modelos transgénicos não permitem geralmente a opção de variar o momento da iniciação de citoquinas ou o nível de produção de citoquinas in vivo . Estes podem ser conseguidos com a entrega mediada por estroma simplesmente mudando o ponto de tempo para o início da injeção de células estromais ou a dose de células estromais injetadas. O método de administração de citoquinas mediado por células estromaisOd detalhado aqui foi usado para desenvolver PDX para avaliar o papel da TSLP no desenvolvimento de células B humanas normais 4,6 e leucemia linfoblástica aguda de células B de alto risco. 6 Este método proporciona um método alternativo de administração de citoquinas para utilização na geração de modelos semelhantes com citocinas humanas diferentes da TSLP. Este modelo também pode ser útil para gerar dados preliminares que podem ajudar a determinar se o valor de uma citocina transgénica ou citoquina knock-in PDX modelo seria digno do investimento de tempo e dinheiro substancial.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes de laboratório úmido&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, capacidade de 7 mL,&nbsp; 25cm&sup2; área de cultura</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Frasco tratado com cultura de tecidos, capacidade de 250 mL, 75 cm&sup2; área de cultura e tampa ventilada</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon Frasco Tratado para Cultura de Tecidos, capacidade de 600 mL, 150 cm&sup2; área de cultura & tampa ventilada</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas de 10 mL Falcon</td><td></td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de polipropileno de 15 mL</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL Falcon</td><td></td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de polipropileno de 50 mL</td><td></td><td></td> Frascos criogênicos Falcon 352098 <td></td></tr><tr><td>de 2,0 mL, pontas de</td> pipeta de 1 mL de <td>4230659</td><td></td>com rosca externa <td>Corning Inc. / Fish</td></tr><tr><td></td><td>2707509</td><td></td><td>er</td></tr><tr><td>200 &mu; Ponteiras de pipeta L&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; Pontas de pipeta L</td><td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis com Membrana SFCA, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem calício e magnésio, 1&vezes;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% Ácido Acético com Azul de Metileno</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Tripano&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>"Tripsina" 1x 0,25% Tripsina 2,21 mM EDTA em HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td><forte>" R10" meio de cultura celular, % do volume total (faz 565 mL)</forte></td><td>-</td><td><forte>-</forte></td><td><forte>Receita de Laboratório</forte></td></tr><tr><td>RPMI, 88,5% (500 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9,9% (56 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 0,99% (5,6 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, 0,50% (2,8 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol, 0,10% (560 &micro; L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><forte>" R20" meio de cultura celular, % do volume total (faz 195 mL)</forte></td><td>-</td><td>-</td><td><forte>Receita de Laboratório</forte></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RPMI, 76,84% (150&nbsp; mL)</td><td>veja acima</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; FBS, 20,49% (40 mL)</td> <td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2mM L-glutamina, 1,02% (2 mL)</td> <td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM de piruvato de Na, 1,02% (2 mL)</td> <td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Penicilina-estreptomicina,&nbsp; 0,51% (1 mL)</td> <td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2-Mercaptoetanol, 0,10% (0,1 M),&nbsp; 0,10% (200 &micro; L)</td> <td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td></td></tr><tr><td><forte>" Meio de congelamento", % do volume total</forte></td><td>-</td><td><forte>-</forte></td><td><forte>Receita de laboratório</forte></td></tr><tr><td>" R10" médio, 45%</td><td>ver receita "R10"</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 20%</td><td>ver acima</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-Trealose di-hidratada, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número Catolog </td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>"HS-27" HS-27A linha de estroma humano</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr> <tr><td>"CALL-4" MHH-CALL-4 linha celular, leucemia precursora de células B humanas</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr> <tr><td>" Ratos NSG" ACENO. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, homem ou mulher, 6 anos &ndash; 8 semanas</td><td>de camundongos JAX&nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular MUTZ-5, leucemia precursora de células B humanas</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Proteína TSLP humana recombinante</td><td>R & D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número Catolog</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos de citomery de fluxo (clone)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (o nome alternativo é IL-7R&alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" Corante de viabilidade fixável&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &kappa; cadeia leve FITC&nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig &lambda; cadeia leve FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; camundongo anti-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Nome </td><td>Company</td><td>Número Catolog</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Outros materiais e equipamentos&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Implantável Nano Transponder com Cânula</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>EMLA creme anestésico lidocaína (obtido por prescrição através de instalações de cuidados com animais)</td><td>prescrição</td><td>prescrição</td><td></td></tr><tr><td>BD&frac12; cc Seringa de Insulina LO-DOSE U-100 28G&frac12; &nbsp;</td><td>BD</td><td>#329461</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer Tubes com K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Alegra X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Capilares FisherBrand (Heparinizados)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Gaiola de Torta de Rato</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>Limitador de Iluminador de Cauda de Mouse Braintree</td><td>Scientific, Inc.</td>Implantador de Empunhadura de Pistola <td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Trovan&nbsp;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Quant&nbsp;</td><td>Bio-Tek Instruments Inc.</td>Software de análise de citometria de fluxo <td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>Versão 10</td><td></td></tr><tr><td>*Todos os anticorpos são anti-humanos, salvo indicação em contrário.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expressão de citocina exógena em xenotransplantes derivados de pacientes via injeção com uma linha de células estromáticas transduzidas por citocinas

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Os ratinhos de xenoenxerto derivados de pacientes (PDX) são produzidos por transplante de células humanas em ratinhos deficientes em imunidade. Estes modelos são uma ferramenta importante para o estudo dos mecanismos da hematopoiese normal e maligna e são o padrão-ouro para a identificação de quimioterápias eficazes para muitas malignidades. Os modelos PDX são possíveis porque muitas das citoquinas de rato também actuam em células humanas. No entanto, este não é o caso de todas as citocinas, incluindo muitas que são críticas para o estudo normal e hematopoiese maligna em células humanas. As técnicas que engendram camundongos para produzir citoquinas humanas (modelos transgênicos e knock-in) exigem uma despesa significativa antes que a utilidade do modelo tenha sido demonstrada. Outras técnicas são de trabalho intensivo (injeção de citocinas recombinantes ou lentivírus) e, em alguns casos, exigem altos níveis de especialização técnica (injeção hidrodinâmica de DNA). Este relatório descreve um método simples para a geração de camundongos PDX que possuem células humanas exógenasTokina (TSLP, linfopoietina do estroma tímico) via injecção intraperitoneal semanal de estroma que foram transduzidos para sobre-expressar esta citocina. A utilização deste método proporciona uma fonte in vivo de produção contínua de citoquinas que atinge os níveis fisiológicos de citoquina humana circulante no rato. Os níveis plasmáticos de citoquina humana podem ser variados com base no número de células estromais injectadas, e a produção de citoquinas pode ser iniciada em qualquer ponto da experiência. Este mï¿½odo tambï¿½ inclui ratinhos de controlo negativo de citoquina que sï¿½ produzidos de forma semelhante, mas atravï¿½ de injecï¿½o intraperitoneal de estroma transduzido com um vector de controlo. Demonstrou-se previamente que as células de leucemia colhidas a partir de PDX que expressa TSLP, em comparação com PDX de controlo, exibem um padrão de expressão de gene mais parecido com a amostra de paciente original. Juntos, os ratinhos PDX produtores de citoquinas e negativos a citoquinas produzidos por este método proporcionam um sistema modelo que usamos com sucesso para estudar aPapel da TSLP na hematopoiese normal e maligna.

Uma visão geral do modelo é mostrada na Figura 1 . Uma vez que a produção de citocinas (TSLP + estroma) e o estroma de controlo foram obtidos são expandidos em cultura. Antes da injeção de estroma em camundongos, o sobrenadante de células estromais é avaliado por ELISA para verificar a produção de citocinas ( Figura 2 ) e a citometria de fluxo fosfo (Protocolo # 3) é usada para verificar a atividade da citocina produzida pelo estroma. O sobrenadante é re...

Descreve-se aqui um método para produzir citoquina exógena em ratinhos de xenoenxerto derivados de doentes (PDX) por meio de injecção intraperitoneal semanal de uma linha de células de estroma transduzidas por citoquinas. Este método alarga a utilidade de PDX e proporciona a opção para a libertação transitória ou prolongada de citoquinas exógenas numa multiplicidade de modelos PDX.

Expressão de citocina exógena em xenotransplantes derivados de pacientes via injeção com uma linha de células estromáticas transduzidas por citocinas

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir camundongos com xenotransplantes que apresentem citocinas humanas em circulação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de câncer e hematopoese, como, por exemplo: Qual é o papel de uma citocina específica no desenvolvimento de linfócitos normais e malignos? A principal vantagem desta técnica é que os pesquisadores podem ajustar as concentrações circulantes de citocina exógena em seus animais com xenotransplante de acordo com as necessidades do experimento.Isso elimina a necessidade de produzir novas linhagens de camundongos transgênicos caras. Esta técnica será útil para pesquisar novas terapias contra o câncer, porque este modelo pré-clínico pode ser usado para testar medicamentos anticâncer, de forma semelhante ao que é utilizado na clínica. Embora este método possa fornecer informações sobre a hematopoiese normal, ele também pode ser usado para estudar doenças específicas, como a leucemia.Desenvolvi esta ideia pela primeira vez quando precisávamos de um modelo in vivo para avaliar o papel da citocina TSLP na produção de células B humanas normais e malignas. Comece por semear estroma controle recém-descongelado, transduzido com vetor vazio, em células produtoras de citocinas em cinco mililitros de meio R-10 em frascos T25 individuais. Para o cultivo, mantenha a 37 graus Celsius em 5 por cento de CO2 por 24 a 48 horas.Quando os estromas estiverem confluentes, desprenda as células com tripsina em EDTA para replantio em frascos de cultura T150 por três a quatro dias. Quando os estromas atingirem confluência nos frascos T150, colete os sobrenadantes e congele-os a 80 graus Celsius para avaliação posterior da produção de citocinas por ELISA. Em seguida, passe cada cultura de frasco T150 para três novos frascos T150 para cultivo até a confluência.Para armazenar as células após o número apropriado de passagens, transfira as suspensões celulares colhidas para um tubo cônico para centrifugação e ressuspenda os pellets em um meio de congelamento. Em seguida, transfira alíquotas de 1,5E6 células para tubos de armazenamento de longo prazo, para seu armazenamento em nitrogênio líquido. Para validar o sobrenadante produzido a partir do estroma modificado, descongele as amostras de sobrenadante colhidas do controle em estroma que expressa citocinas e plaque três poços de linhagens celulares de leucemia por condição em meio Au-20, na concentração de 2E5 células por poço, em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.Incube as células por duas horas a 37 graus Celsius para permitir a perda da fosforilação proveniente do cultivo anterior. Em seguida, transfira as células de cada poço para tubos individuais de quatro mililitros e recolha as células por centrifugação. Re-suspenda os pellets em 600 microlitros por condição experimental.Plaque 200 microlitros de células por poço para cada condição em triplicata. Incube as células pelo período apropriado de acordo com o fosfoensaio comercial específico. Ao final da incubação, pelote as células por centrifugação.Rotule as células por meio da coloração de citometria de fluxo com fosfoespecífico de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, analise as células por citometria de fluxo utilizando protocolos-padrão de análise por citometria de fluxo para verificar se a citocina no sobrenadante do estroma fosforila as células leucêmicas. Após um mínimo de três passagens pós-descongelamento, transfira as suspensões de células estromais colhidas para tubos cônicos individuais para contagem.Centrifugue as células para formar um pellet e ressuspenda-as suavemente em volumes apropriados de PBS estéril para injeção. Mantenha as células a quatro graus Celsius até imediatamente antes da injeção, momento em que a suspensão deve ser aquecida a, pelo menos, temperatura ambiente. Quando as células estiverem prontas, misture suavemente a primeira amostra por inversão e aspire 200 microlitros das células em uma seringa tuberculínica.Em seguida, imobilize o primeiro animal e injete as células na cavidade peritoneal utilizando técnicas padrão de injeção intraperitoneal. Para coletar uma amostra de sangue periférico, posicione suavemente o camundongo em um dispositivo de contenção para pequenos animais desinfetado e fixe o tubo para minimizar os movimentos do animal. Em seguida, limpe a cauda com álcool isopropílico fresco, seguido pela aplicação de creme anestésico tópico.Usando tesouras cirúrgicas muito afiadas, corte cerca de 5 a um milímetro a partir da ponta da cauda e colete aproximadamente 80 microlitros de sangue periférico em tubos capilares heparinizados. Use uma pipeta com pera para transferir as amostras de sangue para tubos microtainer de EDTA de potássio identificados e inverta o tubo 20 vezes para evitar coagulação. Após centrifugar os tubos de coleta de sangue conforme as instruções do fabricante, colete cuidadosamente a camada de plasma e armazene as alíquotas a 20 graus Celsius, fracionando o plasma para armazenamento a 20 graus Celsius.No dia da ELISA, descongele as amostras de plasma de camundongo congeladas e dilua em série o padrão da ELISA em volumes de 120 microlitros. Em seguida, plaque 40 microlitros de cada padrão em triplicata nas cavidades apropriadas da placa de ELISA, seguido pela adição de 40 microlitros de cada amostra de plasma de camundongo nas cavidades apropriadas. Em seguida, finalize a análise de ELISA de acordo com as instruções do fabricante.24 horas após a irradiação dos camundongos, prepare as células hematopoiéticas humanas para o transplante xenogênico. Quando você suspender as células hematopoiéticas em PBS estéril, é recomendável preparar cerca de 15 a 20 por cento a mais, caso ocorra derramamento durante o transplante. Mantenha as células a quatro graus Celsius até o transplante e transfira o primeiro animal receptor para uma gaiola aquecida por pelo menos cinco minutos para facilitar a dilatação da veia caudal.Agora aqueça as células até a temperatura ambiente. Misture suavemente a suspensão celular e aspire 200 microlitros para dentro de uma seringa tuberculínica. Coloque o camundongo no dispositivo de contenção e desinfete a cauda com álcool isopropílico.Injete as células em uma veia lateral da cauda. Em seguida, monitore o camundongo por pelo menos cinco minutos para confirmar a ausência de efeitos adversos relacionados ao transplante. Animais xenotransplantados derivados de pacientes, ou animais PDX, injetados com estroma controle demonstram consistentemente níveis de timocito linfopoietina estromal humana, ou TSLP, no plasma de camundongo abaixo do limite de detecção do ELISA.Os níveis plasmáticos de TSLP humano em camundongos PDX injetados com estroma transduzido por TSLP são proporcionais à quantidade de células estromais TSLP injetadas durante as uma a duas semanas anteriores. Apesar de ser realizado em simplicata, esta avaliação semanal dos níveis plasmáticos de TSLP utilizando o ELISA modificado fornece resultados que, em geral, são consistentes ao longo do tempo. Demonstrou-se que TSLP aumenta a produção de precursores normais de células B humanas.De fato, as células da linhagem B estão significativamente aumentadas em camundongos TSLP-plus em comparação com os animais PDX controle já no estágio de precursor das células B, sugerindo que a TSLP humana produzida em animais PDX TSLP-plus exerce os efeitos funcionais esperados in vivo sobre populações celulares-alvo. Uma vez otimizados, esses procedimentos podem gerar camundongos com xenotransplantes com níveis detectáveis de citocinas humanas em três a quatro semanas. É importante monitorar a concentração de citocinas no sobrenadante das células estromais ao longo do tempo.Isso garante que a produção de citocinas seja mantida no estroma produtor de citocinas e ausente no estroma controle. Camundongos PDX podem ser utilizados em estudos pré-clínicos para responder perguntas adicionais, como: Como a eficácia de uma droga específica de interesse é alterada pela variação dos níveis fisiológicos de uma citocina experimental de interesse in vivo? Esse modelo inovador oferece uma nova maneira para pesquisadores nas áreas de hematologia e oncologia estudarem o papel da TSLP no desenvolvimento e na progressão da leucemia, bem como seu papel na hematopoese normal.Desde que você tenha acesso a linhagens celulares transduzidas com citocinas, é possível utilizar as técnicas demonstradas neste vídeo para fornecer qualquer citocina exógena a modelos de doenças de enxerto heterólogo derivados de pacientes, usando uma ampla variedade de linhagens de camundongos imunodeficientes. Não se esqueça de que trabalhar com células hematopoiéticas humanas pode ser perigoso. Você sempre deve adotar precauções para evitar a transmissão de patógenos veiculados pelo sangue ao manipular esses fluidos e células.

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Este artigo descreve a técnica de estimulação ex vivo de células T para aumentar a concentração intracelular de citocinas como interferon-gama ou IFN-gama e fator de necrose tumoral-alfa ou TNF-alfa na célula T. Essas citocinas medeiam uma resposta antitumoral eficaz e podem ter um papel terapêutico no tumor.

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Este vídeo demonstra a avaliação da fosforilação intracelular de proteínas induzida por citocinas estromais em células leucêmicas. Essas proteínas fosforiladas intracelulares são quantificadas usando a técnica de citometria de fosfofluxo.

Avaliação da fosforilação de proteínas intracelulares induzida por citocinas estromais usando citometria de fluxo fosfométrica

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a isolação de pilhas tumor-iniciando dos xenoenxertos paciente-derivados do sarcoma humano pela seleção fluorescência-ativada da pilha, usando o antígeno-1 humano da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo, e para a validação mais adicional e caracterização destas pilhas tumor-iniciando HLA-1-Negative.

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Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

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Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir e marcar a doença em um modelo xenogénica da doença do transplantar-contra-anfitrião (xenogvhd). o xenoGVHD fornece um modelo in vivo para estudar a imunossupressão de células T humanas. Adicionalmente, nós descrevemos como detectar pilhas de T humanas nos tecidos com PCR digital como uma ferramenta para quantificar o immunosuppression.

Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Este estudo descreve um método para isolar vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fatores estimulantes da colônia de granulocitos imunes de células-tronco embrionárias.

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Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o isolamento e expansão de células mononucleares derivadas de citocinas derivadas de citocinas derivadas de citocinas induzidas por citocinas por cdinénsiainduzidas porcitocinas + CD56+ células assassinas e ilustrar seu efeito de citotoxicidade contra células cancerígenas hematológicas e sólidas usando um sistema de citometria de fluxo de diagnóstico in vitro.

Isolamento e Expansão de células T assassinas induzidas por citocina para tratamento de câncer

Este protocolo descreve a geração cirúrgica de tumores pancreatic ortotópicos e a digestão rápida de tumores pancreatic recentemente isolados do murine. Após a digestão, populações de células imunes viáveis podem ser usadas para análise a jusante, incluindo a estimulação ex vivo das células T para detecção intracelular de citocina por citometria de fluxo.

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Modelo de pele de xenoenxerto para manipular respostas imunes humanas in vivo

Aprenda a produzir citocinas humanas em xenotransplantes derivados de pacientes usando células estromáticas transduzidas. Este método elimina a necessidade de linhagens transgênicas caras e facilita estudos de hematopoiese e terapias anticâncer.

Expressão de citocina exógena em xenotransplantes derivados de pacientes via injeção com uma linha de células estromáticas transduzidas por citocinas (Vídeo) | JoVE Journal

Expressão de citocina exógena em xenotransplantes derivados de pacientes via injeção com uma linha de células estromáticas transduzidas por citocinas

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