A quantificação absoluta de Ap _1-42 No CSF ​​Usando um Procedimento Referência medição de massa espectrométrica

O objetivo geral deste procedimento de medição de referência é harmonizar as medições de um beta no LCR humano. Este método pode ajudar a padronizar ensaios para a medição do LCR, um beta 42, que é um biomarcador para patologia amilóide central e característica neuropatológica da doença de Alzheimer. A principal vantagem dessa técnica é que ela é totalmente validada e não usa anticorpos para quantificação do AVR 142.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia da doença de Alzheimer porque seria usada para harmonizar ensaios e facilitar a introdução de níveis de corte gerais em ensaios clínicos. Embora esse método possa fornecer informações sobre a patologia amilóide em humanos, ele também pode ser aplicado a outros organismos mortais, como camundongos transgênicos e primatas não humanos, para invenerar novos medicamentos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o AVR 142 é muito hidrofóbico e pode facilmente aderir a superfícies como pontas de pipetas e tubos.

Primeiro, adicione 40 microlitros de N15 a peptídeo beta a 0,46 mililitros de acetonitrila a 20% e amônia concentrada a 4% em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Misture a solução peptídica em um misturador de vórtice por um minuto. Adicione 50 microlitros da solução peptídica a 1,95 mililitros de acetonitrila a 20% e amônia concentrada a 4% em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Misture a solução peptídica em um misturador de vórtice por um minuto. Em seguida, prepare seis soluções calibradoras misturando os volumes apropriados de cada solução em tubos de microcentrífuga. Depois de misturar as soluções de calibração, prepare os calibradores finais em duplicata, misturando os volumes apropriados das soluções de calibração correspondentes e do LCR humano em tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro.

Misture cada solução em um misturador de vórtice por um minuto. Para preparar o padrão interno, primeiro adicione 32 microlitros de 13C um peptídeo beta a 1.968 mililitros de acetonitrila a 20% e amônia concentrada a 4% em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Misture a solução peptídica em um misturador de vórtice por um minuto.

Em seguida, adicione 0,1 mililitros da solução peptídica a 4,9 mililitros de acetonitrila a 20% e amônia concentrada a 4% em um tubo de microcentrífuga de cinco mililitros. Misture a solução peptídica em um misturador de vórtice por um minuto. Para preparar a amostra do fator de resposta, adicione 40 microlitros de um peptídeo beta nativo a 0,46 mililitros de acetonitrila a 20% e amônia concentrada a 4% em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro.

Após a mistura, adicione 20 microlitros da solução peptídica e 20 microlitros de quatro microgramas por mililitro, 15N um peptídeo beta a 1,96 mililitros de 20% de acetonitrila e 4% de amônia concentrada em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Misture a solução peptídica em um misturador de vórtice por um minuto. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução peptídica a 0,38 mililitros de LCR artificial em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro.

Depois de preparar as duplicatas, misture cada solução em um misturador de vórtice por um minuto. Depois de descongelar as amostras em um rolo, adicione 0,18 mililitros de cada calibrador, fator de resposta e amostra desconhecida a uma placa de poço de proteína 96 de um mililitro de profundidade, certificando-se de adicionar as amostras dentro ou perto do fundo dos poços. Agora, adicione 20 microlitros de padrão interno a cada poço, liberando uma gota do padrão na lateral do poço próximo à superfície da amostra sem submergir a ponta da pipeta.

Em seguida, adicione 0,2 mililitros de cloridrato de guanadina de cinco molares a cada poço. Coloque a placa de amostra em um agitador de microplacas e misture as amostras por 45 minutos a 1100 rpm. Após a mistura, adicione 0,2 mililitros de ácido fosfórico a 4% em cada poço.

Em seguida, coloque a placa de amostra no agitador de microplacas e misture brevemente a 1000 rpm. Coloque uma bandeja de reservatório para resíduos sob uma extração em fase sólida de 96 poços de troca catiônica de modo misto ou placa SPE na câmara do coletor da placa de extração. Em seguida, condicione o adsorvente SPE adicionando 0,2 mililitros de metanol a cada poço.

Em seguida, equilibre o sorvente adicionando 0,2 mililitros de ácido fosfórico a 4% a cada poço. Usando uma pipeta de oito canais, transfira todas as amostras da placa de poço profundo para a placa SPE. Em seguida, lave o sorvente duas vezes após a passagem das amostras, adicionando 0,2 mililitros de ácido fosfórico a 4% em cada poço.

Depois que o solvente de lavagem eluído do sorvente, substitua a bandeja do reservatório por tubos. Agora, elui a amostra do sorvente adicionando dois aloquats de 50 microlitros de 75% de acetonitrila e 10% de amônia concentrada, observando que esta solução requer um vácuo muito baixo para passar pelo sorvente. Seque os eluatos usando centrifugação a vácuo sem aplicar calor.

Por fim, sele os tubos e congele-os a 80 graus Celsius até a análise. Os calibradores estão próximos da linha de regressão com desvios padrão baixos. Se a calibração não for linear, a sequência deve ser descartada e o desvio deve-se provavelmente a técnicas de pipetagem incorrectas e/ou a erros na diluição dos calibradores.

O coeficiente de variação das réplicas deve ser preferencialmente inferior a 10%O nativo 15N e o 13C a beta eluem da coluna LC simultaneamente com picos próximos a simétricos e sem rejeitos significativos. Devem ser realizadas pelo menos 10 medições para cada pico e podem ser ajustadas com um tempo máximo de injeção no método. Os peptídeos podem ser medidos simultaneamente durante a análise de MS, a menos que a sensibilidade do método seja abaixo do ideal, na qual apenas os peptídeos de interesse devem ser medidos para cada injeção.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre saturar as pontas da pipeta antes de transferir a solução peptídica. Também é importante usar tubos com o mínimo de volume de vazios possível.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da doença de Alzheimer explorarem a concordância com outros métodos, como a imagem PET amilóide. Também foi usado para atribuir concentrações beta 142 a materiais de referência baseados em LCR. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar calibradores no LCR humano e usar a extração em fase sólida antes da análise LCMS para medir a concentração absoluta de um beta 142 em amostras.

Não se esqueça de que trabalhar com LCR humano pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas, óculos de proteção e outras medidas de segurança devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.