Name: A quantificação absoluta de Ap 1-42 No CSF Usando um Procedimento Referência medição de massa espectrométrica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a quantificar Aβ1-42 em líquido cefalorraquidiano humano usando extração em fase sólida e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Este método validado padroniza ensaios para pesquisa da doença de Alzheimer.

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Este trabalho foi realizado em nome do Grupo de Trabalho da Federação Internacional de Química Clínica sobre Proteínas do LCR, que tem a seguinte composição: Kaj Blennow (Presidente) e Henrik Zetterberg, Universidade de Gotemburgo, Suécia; Les Shaw e Magdalena Korecka, Universidade da Filadélfia, PA, EUA; Ingrid Zegers, Instituto de Materiais e Medições de Referência, Geel, Bélgica; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Alemanha; e Rand Jenkins, Laboratório Bioanalítico PPD, Richmond, VA, EUA; Randall Bateman, Universidade de Washington, MO, EUA; e H Vanderstichele, Innogenetics NV, Ghent, Bélgica. Este trabalho também fez parte do Grupo de Trabalho de Métodos de Referência CSF do Consórcio Global para Padronização de Biomarcadores, liderado por Maria C. Carrillo, Ph.D., Diretora Sênior de Relações Médicas e Científicas da Alzheimer's Association. O estudo foi apoiado pelo Conselho Sueco de Pesquisa (concessões # 14002, # 521-2011-4709 e # 2013-2546); a Fundação Knut e Alice Wallenberg; Demensförbundet; e as Fundações de Emil e Wera Cornell, Aina Wallström e Mary-Ann Sjöblom, Gun e Bertil Stohne, Magnus Bergvall e Gamla Tjänarinnor.

NOTA: Este protocolo requer alíquotas de, pelo menos, 50 ul, com uma concentração de 50 ug / mL para cada péptido Ap, como material de partida. Os peptídeos Ap deve ser dissolvido em 20% de acetonitrilo (ACN) e solução concentrada de amoníaco a 4% em água desionizada (v / v) e armazenadas a 80 ° C. Cuidado: Ver Tabela 1 para informações de segurança. 1. Preparação das soluções <ol><li> Preparação de 100 mL de 20% de ACN e 4% de solução concentrada de amoníaco em água desionizada (v / v) diluindo 20 mL de ACN e 4 mL de hidróxido de amónio concentrado (~ 25%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 100 mL com água desionizada. Faça diariamente. </li><li> Preparar 50 ml de 5 M de guanidina-hidrocloreto por dissolução de 26,08 g de cloridrato de guanidina-em água de s ionizada para um volume final de 50 mL. Loja a 20 ° C e fazer mensalmente fresco. </li><li> Preparar 200 ml de ácido fosfórico a 4% em água desionizada (v /v) por diluição de 9,4 ml de ácido fosfórico concentrado (~ 85%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 200 mL com água desionizada. Guarde na geladeira e fazer semanal fresco. </li><li> Preparar 50 ml de 75% de ACN e 10% de solução de amoníaco concentrada (v / v) em água desionizada por diluição de 37,5 mL de ACN e 5 mL de hidróxido de amónio concentrado (~ 25%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 50 mL com água desionizada. Faça diariamente. </li><li> Descongelar, pelo menos, 2,5 mL de CSF humano para os calibradores, obtidos a partir de amostras de sobras identificou-de de análises clínicas de rotina. </li><li> Prepare CSF artificial contendo Na 150 mM, 3,0 mM de K, Ca 1,4 mM, Mg 0,8 mM, 1,0 P, e Cl 155 mM em água desionizada e adicionar albumina de soro de bovino a uma concentração final de 4 mg / mL. Apenas 1 mL é necessária por análise, mas preparar um grande volume, alíquota e guarde para uso futuro. </li></ol> 2. Preparação dos calibradores <ol><li> Preparar 0,5 ml de 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 por adição de 40 uL de 50 ug / ml 15 NAβ 142-0,46 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min. </li><li> Preparar 2 mL de 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 por adição de 50 uL da 4 ug / ml 15 NAβ 142-1,95 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifugação de 2 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min. </li><li> Prepare seis soluções de calibrador (FA) por mistura dos volumes de cada solução indicada na Tabela 2. Utilizar 0,5, 1,5, e 2 mL tubos de microcentrífuga. Misturar num misturador vortex durante 1 min. </li><li> Prepare os calibradores finais (em duplicado) em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml por adição de soluções de calibração correspondentes e CSF humano de acordo com a Tabela 3. Misturar num misturador vortex durante 1 min. </li></ol> 3. Preparação do padrão interno <ol><li> Preparar 2 mL de 0,8 ug / ml 13 CAβ 1-42 através da adição de 32 uL de 50 ug / ml 13 CAβ 142-1,968 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifugação de 2 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min. </li><li> Prepare 5 mL de 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 por adição de 0,1 mL de 0,8 ug / mL a 4,9 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 5 mL. Misturar num misturador vortex durante 1 min. </li></ol> 4. Preparação da Amostra Factor de Resposta NOTA: O factor de resposta (RF) determinação é efectuada para determinar a concentração do péptido marcado utilizado para a calibração (15 NAβ 1-42). Isto requer que a concentração do péptido nativo Ap 1-42 foi determinado utilizando análise de aminoácidos (AAA). Assim, o volume e concentração de alíquotas de péptidos nativos Ap 1-42precisa para cumprir os requisitos da AAA. <ol><li> Prepare 0,5 mL de 4 ug / mL nativa (não marcado) Ap 1-42 por adição de 40 uL de 50 ug / mL de Ap nativo 1-42 para 0,46 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min. </li><li> Prepara-se uma 2-ml 40 ng mistura / mL de nativo e 15 NAβ 1-42 por adição de 20 uL de 4 ug / mL de Ap nativo 1-42 e 20 uL de 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 a 1,96 mL de 20% ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifuga de 2 mL. Misturar num misturador vortex durante 1 min. </li><li> Adicionar 20 ul da mistura de 40 ng / mL a 0,38 mL de CSF artificial num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Prepare duplicados e misturar num misturador vortex durante 1 min. </li></ol> Preparação 5. Amostra NOTA: Descongelar as amostras a serem medidas à temperatura ambiente num rolo. <ol><li>Adicionar 0,18 ml de cada calibrador, factor de resposta, e amostra desconhecida (incluindo o controlo de qualidade [QC] amostras, se usado) para uma placa de 96 de poços profundos 1 mL de proteína, de acordo com a Figura 1 (assumindo que uma placa completa é utilizada). Certifique-se adicionar as amostras em, ou perto, o fundo dos poços. </li><li> Adicionar 20 ul de padrão interno a cada poço (ie, calibradores, factores de resposta, CQs, e desconhecidos); é crucial para libertar a gota no lado do poço perto da superfície da amostra, sem submergir a ponta da pipeta. </li><li> Adicionar 0,2 mL de 5 M de guanidina-hidrocloreto a cada poço. </li><li> Colocar a placa da amostra num agitador de microplacas e misturar as amostras durante 45 min a 1100 rpm. A frequência ideal pode variar de acordo com instrumentação. Definir a frequência e a amplitude do misturador de modo a que as soluções são misturadas cuidadosamente, e não há gotas de padrão interno ou CSF não misturados são deixados no lado dos poços. </li><li> Adicionar 0,2 ml de ácido fosfórico a 4%a cada poço. Vortex misture rapidamente. </li></ol> 6. Extracção em Fase Sólida NOTA: Em todos os de lavar, de carregamento, e passos de eluição, aplicar o mínimo possível de vácuo após a adição da solução e aumentar gradualmente conforme necessário para carregar ou eluir a solução. Desativar o vácuo entre cada carga e passo de eluição. <ol><li> Coloque uma bandeja reservatório de resíduos debaixo de um modo misto, de troca catiónica, 96 poços de extração em fase sólida (SPE) placa na câmara colector de placa de extracção. </li><li> Sujeitar o sorvente SPE por adição de 0,2 ml de metanol a cada cavidade. </li><li> Equilibrar a sorvente por adição de 0,2 ml de ácido fosfórico a 4% a cada poço. </li><li> Transferir todas as amostras (cerca de 0,62 ml) em cada poço da placa de poços profundos para a placa de SPE. Usar uma pipeta de oito canais ao transferir as amostras a partir da placa de poços profundos para a placa de SPE; Não é crucial para transferir os volumes inteiros ou iguais de todas as amostras, desde que as amostras contêm um internoal padrão que irá compensar as variações. </li><li> Lavar o sorvente depois de as amostras terem passado através através da adição de 0,2 ml de ácido fosfórico a 4% a cada poço. </li><li> Após o solvente de lavagem foi eluído a partir do sorvente, substituir o tabuleiro de reservatório com uma placa de recolha ou câmaras de ar. </li><li> Elui-se a amostra a partir do adsorvente por duas vezes a adição de 50 uL de 75% de ACN / 10% de amónia concentrada, e em atenção que esta solução exige um vácuo muito baixo ao passar através do sorvente. Lembre-se de desativar o vácuo entre cada adição. <ol><li> OPCIONAL: Selar a placa de coleção ou tubos e congelá-los a -80 ° C. Retire o selo da placa de recolha ou tubos antes de prosseguir para a etapa 6.8.2. </li><li> Secam-se os eluatos por centrifugação usando vácuo (sem aplicação de calor); esta pode levar de uma a várias horas, dependendo da centrífuga de vácuo. </li><li> Selar os recipientes e congelá-los a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 7. Líquido chromatography <ol><li> Preparar a fase móvel A (5% de ACN e 0,3% de amónia concentrada em água desionizada [v / v]), B (4% de água desionizada e 0,1% de amónia concentrada em ACN [v / v]), e lavagem da agulha (50% de ACN e 4% de amónia concentrada em água desionizada [v / v]). <ol><li> Para 500 ml de fase móvel A, adicionar 25 mL de ACN e 1,5 mL de amoníaco concentrado para água deionizada. Ajustar o volume final para 500 mL com água desionizada. </li><li> Para 500 ml de fase móvel B, adicionar 500 mL de amónia concentrada e 25 ml de água desionizada para ACN. Ajustar o volume final para 500 mL com ACN. </li><li> Preparar 250 mL de lavagem da agulha através da adição de 120 mL de ACN e 10 ml de amónia concentrada à água desionizada. Ajustar o volume final para 250 mL com água desionizada. </li><li> Coloque a fase móvel A e B e garrafas de lavagem da agulha aberta num banho de ultra-sons durante 20 min antes da utilização com o sistema de CL </li></ol></li><li> Dissolve-se cada amostra com 25 ul de 20% ACN, e 4% Concentrasolução de amoníaco ted e colocá-los num agitador durante 20 min. Centrifugar-se as amostras e colocá-los no amostrador automático (mantenha a 7 ° C). </li><li> Injecte 20 ul de amostra numa coluna monolítico 1 x 250 mm 2 de poliestireno-divinilbenzeno (de fase reversa) mantida a 50 ° C. <ol><li> Utilizar o gradiente LC mostrados na Tabela 4 com um caudal de 0,3 mL / min. Desviar os dois primeiros e os últimos cinco minutos para o lixo (pós-coluna), utilizando uma válvula de desvio para reduzir a contaminação do espectrômetro de massa. </li></ol></li></ol> Análise 8. Mass Espectrométrico NOTA: Estes parâmetros foram utilizados para um espectrómetro de massa de quadrupolo híbrido-Orbitrap equipado com fonte de ionização electrospray aheated. <ol><li> Definir os parâmetros para a fonte de iões de acordo com a Tabela 5. </li><li> Defina o instrumento MS para isolar os 4+ estados de carga de Ap nativo 1-42 (1,129.48 em massa-a carga rácio [m / z]), 15 1-42 NAβ (1,143.00 m / z), e 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) no analisador de massa de quadrupolo com uma largura de isolamento de 2,5 m / z. </li><li> Fragmentar os peptídeos isolados na célula de colisão com uma energia de colisão normalizada (NCE) de 17,0. Este pode ter de ser ajustado para cada instrumento, mesmo do mesmo tipo (e especialmente se estiver usando outros tipos de instrumentos, tais como um triplo quadrupolo MS). </li><li> Grave os espectros fragmento com uma resolução de 17.500, com uma meta de controle automático de ganho de 2 x 10 5 encargos e um tempo máximo de injecção de 250 ms. </li></ol> 9. Processamento de Dados <ol><li> Utilizar a soma dos iões dos produtos (com uma tolerância de ± massa de 250 unidades de massa mili [mmu)] na Tabela 6 para calcular as áreas de cromatografia para cada péptido. Note-se que os tipos de íons e números apenas são mostradas para Aâ nativa <sub&gt; íons 1-42 de produtos, uma vez que são os mesmos para ambos 15 NAβ 1-42 e 13 CAβ 1-42. </li><li> Determinar o factor de resposta média das duas amostras de factor de reacção dividindo a área sob a curva (pico cromatográfico) de 15 NAβ 1-42 com a área sob a curva de Ap nativo 1-42. </li><li> Ajustar a concentração do NAβ 15 1-42 utilizado para calibração, multiplicando-se com o factor de resposta calculado no passo 9.2. </li><li> Construir uma curva de calibração locando as razões das áreas de 15 NAβ 1-42 a 13 CAβ 1-42 dos dois conjuntos de calibradores contra a concentração. </li><li> Calcular a inclinação e intercepção da curva de calibração por meio de regressão linear. </li><li> Calcular a proporção de Ap nativo 1-42 área para o padrão interno (13 CAβ 1-42) para unamostras conhecidas. </li><li> Extrapolar a concentração de amostras desconhecidas a partir da curva de calibração usando a inclinação e intercepção obtida no passo 9.5. </li></ol>

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JP e EP não relatam divulgações. HZ atuou nos conselhos consultivos da Roche Diagnostics, Eli Lilly e Pharmasum Therapeutics. KB atuou como consultor ou nos conselhos consultivos da Fujirebio Europe, IBL International e Roche Diagnostics. HZ e KB são cofundadores da Brain Biomarker Solutions em Gotemburgo AB, uma empresa de plataforma baseada na GU Venture na Universidade de Gotemburgo.

Para o método descrito, em vez de usar uma matriz substituta, foi utilizada a abordagem de substituição analito 13, 14, 15, 16, o que permite a calibração em CSF humano. A abordagem envolve duas analito substituto padrões marcados isotopicamente diferentes. Um (15 NAβ 142) é usado para gerar a curva de calibração em CSF humano, enquanto a outra (13 CAβ 142...

A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência e afeta cerca de 35 milhões de pessoas em todo o mundo 1. As características neuropatológicas da doença que se acredita estar no cerne da AD patogênese são emaranhados neurofibrilares intracelulares de proteína tau hiperfosforilada 2 e placas extracelulares que consiste em (Ap) peptídeos 3 agregada beta-amilóide. Em consonância com isso, a avaliação da patologia de placa in vivo por biomarcadores foi recentemente incluída nos critérios diagnósticos para pesquisa em 4 dC. Para medições de CSF de Ap 1-42, vários imunoensaios estão disponíveis e são utilizados em muitos laboratórios clínicos 5. A concentração de Ap em CSF 1-42 é, aproximadamente, 50% mais baixa em pacientes com AD do que em pessoas idosas cognitivamente normais, reflectindo a deposição do péptido em placas na BRain 6, 7. Esses biomarcadores são principalmente analisadas através de imunoensaios (isto é, técnicas à base de anticorpos), mas estes ensaios podem ser influenciadas por efeitos de matriz 8. O uso de imunoensaios em diferentes plataformas tecnológicas e a falta de ensaio padronização 9, 10 torna a introdução de concentrações de corte globais difíceis 11, 12. Um PGR analiticamente validado permitiria a calibração uniforme das diferentes plataformas de ensaio, de preferência, resultando em melhor comparabilidade entre plataformas analíticas e no melhor controle dos fatores que contribuem para a variabilidade global medição. A quantificação absoluta de Ap 1-42 utilizando o método de LC-MS / MS desenvolvido supera muitos dos problemas associados com Techn à base de anticorpoiques. O método, listado como um PGR pelo Comité Misto de Rastreabilidade na Medicina Laboratorial (JCTLM banco de dados identificação do número C11RMP9), será utilizado para determinar a concentração absoluta de Ap 1-42 em um material de referência certificado (CRM) para harmonizar CSF Ap 1 -42 medições através de técnicas analíticas e plataformas. O fluxo de trabalho descrito deverá ser de relevância para o desenvolvimento de métodos de referência candidato para peptídeos e proteínas dentro de outras áreas da medicina.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga Eppendorf Protein LoBind, tubos</td> de microcentrífuga <td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind de 0,5 mL, tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind de 1,5 mL, tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind de 2 mL, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0,75 mL tubos de polipropileno, tubos</td><td>de MPW32071BC3</td><td>micrônicos</td> de fundo em V <td>usados para coletar eluato de SPE, mas outros dispositivos de coleta podem ser usados, como placas de 96 poços.</td></tr><tr><td>Micronic Split TPE Capcluster para tubos de 96 ind. Tampas</td><td>Micronic</td><td>MP53026</td><td>para tubos Micronic.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 branco com barra de cobertura alta codificada</td><td>Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>Holder para tubos Micronic.</td></tr><tr><td>Pontas Biohit Optifit 1.2 mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>Usado para alcançar todo o caminho até o fundo das placas de poço profundo LoBind (96 poços). Outras pontas estreitas também podem funcionar.</td></tr><tr><td>Waters Oasis MCX 96-poço &micro; Placas de Eluição</td><td>de Águas</td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja do reservatório do coletor de placas</td> de águas <td>Coletor</td><td>de placas de extração de águas WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>águas para placas de 96 poços</td><td>Waters</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>solução de hidróxido de amônio, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~ 25% NH3 base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila, grau de gradiente de HPLC UV distante, 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A / 0627 / 17X</td><td></td></tr><tr><td>ácido orto-fosfórico 85%, ACS, ISO, Reag. Cloridrato</td><td>de guanidina 1005731000</td><td></td>Ph <td>Eur Merck</td></tr><tr><td>Millipore, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Com Dionex Ultimate 3000 LC incluído e amostrador automático.</td></tr><tr><td>Coluna de Monólito Dionex ProSwift RP-4H (1,0 x 250 mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, pó liofilizado, adequado para (para biologia molecular),</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Amilóide não acetilado (1-42), Ultra Puro, TFA</td><td>rPeptídeo</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N Beta-Amilóide (1-42), Uniformemente marcado</td><td>rPeptídeo</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C Beta-Amilóide (1-42), Uniformemente rotulado</td><td>rPeptídeo</td><td>A-1106-2</td><td></td></tr><tr><td>Microplate shakers, TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml; hler</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

a quantificação absoluta de ap<sub&gt; 1-42</sub&gt; no csf ​​usando um procedimento referência medição de massa espectrométrica

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

A doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum entre os idosos e é responsável por 60-80% de todos os casos de demência. Atualmente, o diagnóstico da DA é baseado em testes cognitivos e exames do estado mental, mas o peptídeo beta-amilóide (Aβ) no líquido cefalorraquidiano (LCR) é cada vez mais utilizado em ensaios clínicos e ambientes. Como para a maioria dos biomarcadores de proteínas e peptídeos, a quantificação é realizada usando técnicas baseadas em anticorpos, como ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). No entanto, a variabilidade intra e interlaboratorial nesses ensaios dificulta seu uso como marcador diagnóstico na rotina clínica.
Um Procedimento de Medição de Referência (RMP) independente de anticorpos foi desenvolvido com base na extração em fase sólida (SPE) e cromatografia líquida (LC)-espectrometria de massa em tandem (MS/MS), onde peptídeos Aβ estáveis marcados com isótopos foram usados como padrões internos, permitindo a quantificação absoluta. Um instrumento híbrido quadrupolo-orbitrap de alta resolução foi usado para as medições. O método permite a quantificação do LCR Aβ1-42 entre 150-4.000 pg/mL.

A configuração da placa da Figura 1 é utilizada para um prato de amostras. Se menos amostras desconhecidas estão a ser analisado, o segundo calibrador, conjuntos de RF, e QC deve ser colocado após a primeira metade das amostras desconhecidas. Como pode ser visto na Figura 2, os calibradores estão perto da linha de regressão, com baixo desvio padrão. Este método tem um nível mais baixo de quant...

Um procedimento de medição de referência para a quantificação absoluta de Aβ1-42 no LCR humano com base na extração em fase sólida e espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida é descrito.

A quantificação absoluta de Ap<sub&gt; 1-42</sub&gt; No CSF ​​Usando um Procedimento Referência medição de massa espectrométrica

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

O objetivo geral deste procedimento de medição de referência é harmonizar as medições de a beta no LCR humano. Este método pode ajudar a padronizar ensaios para a medição de a beta 42 no LCR, que é um biomarcador da patologia amiloide central e um sinal neuropatológico característico da doença de Alzheimer. A principal vantagem desta técnica é que ela é rigorosamente validada e não utiliza anticorpos para a quantificação de AVR 142.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia da doença de Alzheimer, pois poderiam ser usadas para harmonizar ensaios e facilitar a introdução de níveis gerais de corte em ensaios clínicos. Embora este método possa fornecer informações sobre a patologia amiloide em humanos, ele também pode ser aplicado a outros organismos mortais, como camundongos transgênicos e primatas não humanos, para acelerar o desenvolvimento de novas drogas. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades porque o AVR 142 é altamente hidrofóbico e pode aderir facilmente a superfícies como ponteiras de pipeta e tubos.Primeiro, adicione 40 microlitros do peptídeo beta N15 a 0,46 mililitros de acetonitrila 20% e amônia concentrada 4% em um tubo microcentrífugo de 0,5 mililitro. Misture a solução peptídica em um vórtex por um minuto. Adicione 50 microlitros da solução peptídica a 1,95 mililitros de acetonitrila 20% e amônia concentrada 4% em um tubo microcentrífugo de dois mililitros.Agite a solução de peptídeo em um misturador vortex por um minuto. Em seguida, prepare seis soluções calibradoras misturando os volumes apropriados de cada solução em tubos de microcentrífuga. Após a mistura das soluções calibradoras, prepare os calibradores finais em duplicata misturando os volumes apropriados das soluções calibradoras correspondentes e LCR humano em tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro.Misture cada solução em um vórtex por um minuto. Para preparar o padrão interno, adicione primeiro 32 microlitros do peptídeo 13C a beta a 1,968 mililitros de acetonitrila 20% e amônia concentrada 4% em um tubo microcentrífugo de dois mililitros. Misture a solução peptídica em um vórtex por um minuto.Em seguida, adicione 0,1 mililitros da solução de peptídeo a 4,9 mililitros de acetonitrila 20% e amônia concentrada 4% em um tubo microcentrífugo de cinco mililitros. Misture a solução de peptídeo em um agitador de vórtex por um minuto. Para preparar a amostra do fator de resposta, adicione 40 microlitros de peptídeo beta amiloide nativo a 0,46 mililitros de acetonitrila 20% e amônia concentrada 4% em um tubo microcentrífugo de 0,5 mililitro.Após a mistura, adicione 20 microlitros da solução de peptídeo e 20 microlitros de quatro microgramas por mililitro de peptídeo 15N a beta a 1,96 mililitros de acetonitrila 20% e amônia concentrada 4% em um tubo microcentrífugo de dois mililitros. Misture a solução de peptídeo em um agitador de vórtice por um minuto. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução de peptídeo a 0,38 mililitros de LCR artificial em um tubo microcentrífugo de 0,5 mililitro.Após preparar as duplicatas, misture cada solução em um agitador de vórtice por um minuto. Após descongelar as amostras em um rolo, adicione 0,18 mililitros de cada calibrador, fator de resposta e amostra desconhecida a uma placa de proteína de 96 poços profundos de um mililitro, certificando-se de adicionar as amostras no fundo ou próximo ao fundo dos poços. Agora, adicione 20 microlitros do padrão interno a cada poço liberando uma gota do padrão na lateral do poço próxima à superfície da amostra, sem submergir a ponta da pipeta.Em seguida, adicione 0,2 mililitros de guanidina hidroclorida cinco molar a cada poço. Coloque a placa de amostras em um agitador para microplacas e misture as amostras por 45 minutos a 1100 rpm. Após a mistura, adicione 0,2 mililitros de ácido fosfórico 4% a cada poço.Em seguida, coloque a placa de amostras no agitador de microplacas e misture brevemente a 1000 rpm. Coloque uma bandeja de resíduos sob uma placa de extração em fase sólida (SPE) de 96 poços com modo misto de troca catiônica no compartimento do manifold da placa de extração. A seguir, condicione o sorvente SPE adicionando 0,2 mililitros de metanol a cada poço.Em seguida, equilibre o sorvente adicionando 0,2 mililitros de ácido fosfórico 4% a cada poço. Usando uma pipeta de oito canais, transfira todas as amostras da placa de poços profundos para a placa de extração em fase sólida (SPE). Após isso, lave o sorvente duas vezes após as amostras terem passado, adicionando 0,2 mililitros de ácido fosfórico 4% a cada poço.Após o solvente de lavagem ter eluído do sorvente, substitua a bandeja de reservatório por tubos. Agora, elua a amostra do sorvente adicionando duas alíquotas de 50 microlitros de acetonitrila 75% e amônia concentrada 10%, observando que esta solução requer um vácuo muito baixo para passar pelo sorvente. Seque os eluatos utilizando centrifugação a vácuo sem aplicação de calor.Por fim, feche os tubos e congele-os a 80 graus Celsius até a análise. Os calibradores estão próximos à linha de regressão, com baixos desvios padrão. Se a calibração for não linear, a análise deve ser descartada, e o desvio é mais provavelmente devido a técnicas incorretas de pipetagem e/ou erros na diluição dos calibradores.O coeficiente de variação das réplicas deve preferencialmente ser inferior a 10%. Os isótopos nativos 15N e 13C de beta eluem da coluna de CL simultaneamente, com picos quase simétricos e sem alargamento significativo da cauda. Pelo menos 10 medições devem ser realizadas para cada pico e podem ser ajustadas com um tempo máximo de injeção no método. Os peptídeos podem ser medidos simultaneamente durante a análise por EM, a menos que a sensibilidade do método seja subótima, caso em que apenas os peptídeos de interesse devem ser medidos em cada injeção.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de sempre saturar as ponteiras da pipeta antes de transferir a solução de peptídeo. Também é importante usar tubos com o menor volume morto possível.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da doença de Alzheimer explorarem a concordância com outros métodos, como a imagem por PET com amilóide. Também tem sido utilizada para atribuir concentrações de beta 142 a materiais de referência baseados em LCR. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar calibradores em LCR humano e utilizar extração em fase sólida antes da análise por LCMS para medir a concentração absoluta de beta 142 em amostras.Não se esqueça de que trabalhar com LCR humano pode ser extremamente perigoso, e precauções como luvas, óculos de proteção e outras medidas de segurança devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

absolute-quantification-a1-42-csf-using-mass-spectrometric-reference

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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