Name: A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a manter tecido neuronal agudo viável por mais de 24 horas usando o sistema Braincubator para eletrofisiologia e imagem de cálcio. Este método reduz o número de animais necessários e maximiza a coleta de dados experimentais.

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Agradecemos a Colin Symons e James Wright pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de financiamento inicial (WSU) para Y.B. e o escritório de inovação da Western Sydney University. MC é apoiado pela bolsa ARC (DECRA).

O protocolo que se segue descreve a preparação de ratinhos C57BL / 6 e C3H / He (retinally degenerar) tecido neuronal de rato, mas técnicas semelhantes podem ser aplicados a outras espécies. Todos os animais eram saudáveis ​​e manipulados com as condições padrão de temperatura, humidade, 12 h ciclo claro / escuro, livre acesso a comida e água, e sem quaisquer estímulos de estresse pretendidos. Todos os experimentos foram aprovados e realizados de acordo com o comitê Animal Care Universidade Western Sydney e Ética e de acordo com o uso de animais e orientações de cuidados (Animal Research Autoridade # A9452, # A10396 e # A8967). 1. Cérebro Slice Preparação <ol><li> Anestesiar os animais por inalação de isoflurano (5%) e decapitar utilizando uma guilhotina roedor. Remover o cérebro rapidamente, tal como descrito anteriormente 9 e colocá-lo em solução fisiológica gelada (aCSF) contendo (em mM): NaCl 125, KCl 2,5, MgCl2 1, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25De NaHCO 3, 25 dextrose, e saturada com carbogéneo (95% O2 / 5% de mistura de CO 2; 310 mOsm; pH 7,4). </li><li> Corte fatias de cérebro, na região de interesse, 300 mm de espessura em micrótomo vibrando. </li><li> Transfira as fatias a um sistema de incubação personalizado construído que estreitamente monitora e controla os níveis de pH (pH 7,2-7,4), o fluxo de carbogênio e temperatura, como descrito anteriormente 10, 11. </li><li> Ajuste da temperatura inicial da câmara para 35 ° C durante 15 - 30 min, e em seguida reduzir-se lentamente a 15-16 ° C como mostrado na Figura 1C. Em seguida, incubar fatias no sistema de incubação até ser necessário, seja para eletrofisiologia ou imagem. NOTA: Se as fatias estão a ser utilizados para o cálcio-imagem, siga os passos abaixo antes de arrefecimento do tecido abaixo RT. </li></ol> 2. Preparação da retina Wholemount e Inner Limitando remoção da membrana <ol><li> Prepare wholemounts da retina quer em regime normal,condições de iluminação laboratoriais ou luz vermelha / infra-vermelho escuro. </li><li> Eutanásia de animais por deslocamento cervical e os olhos imediatamente enuclear. Fazer um pequeno corte ao longo da ora serrata e o lugar em ambos os meios de Ames, ou aCSF contendo (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 de KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 de glicose, 0,5 de L-glutamina, e saturar com carbogénio (95% O 2 mistura / 5% de CO 2; ~ 300 mOsm; pH 7,4), à TA. </li><li> Remover imediatamente a córnea, cristalino e vítreo cortando ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena e remover a lente e vítreo com uma pinça. Colocar o tecido no sistema de incubação à TA. NOTA: tecido retiniano pode ser mantida na de taça do olho, após a redução da temperatura lento a 15-16 ° C, durante&gt; 24 h no sistema de incubação até serem necessários. </li><li> Para remover o ILM, transferir a taça de olho contendo a retina para um pequeno frasco de vidro contendo 30 U / mL de papaína, 1 mM L-cistina, EDTA 0,5 mM e 0,005% de DNase em Earl&#39;s-Solução Salina Equilibrada (BSS) a 37 ° C durante 20 min. Aplicar 95% de O2 / 5% de CO 2 para a solução através da tampa, mas não fazer espuma. Se usando tecido de animais jovens (&lt;6 semanas), dilui-se a solução a meia-força. <ol><li> Parar a digestão enzimática, através da colocação do tecido numa solução de ovomucóide (10 mg / mL) e BSA (10 mg / mL) durante 10 min em BSS de Earl. tecido Lavar bem com aCSF antes da transferência para o sistema de incubação e reduzir a temperatura a 15-16 ° C. </li></ol></li><li> Manter o tecido da retina no olho de taça até ser necessário. Para transferência para o microscópio, isolar a retina do olho-cup e cortada em 4 pedaços com uma lâmina de barbear. Se a retina inteira é necessário, fazer quatro pequenos cortes na periferia da retina para lhe permitir ficar na posição horizontal. NOTA: Para experimentos com imagens, carga com cálcio-corantes antes da transferência para o sistema de incubação, veja abaixo. </li></ol> 3. Manter Tissue na Incubadora <ol><li&gt; Tecido Lugar na câmara principal contendo sondas para medições de pH e de temperatura (Figura 1A, B). </li><li> Circular aCSF através de uma segunda câmara (câmara UVC, construído como anteriormente descrito 12) isolado a partir da câmara principal e exposto a 1,1 W de luz UVC (254 nm, lâmpada UV 5W / 2P esterilizador), a fim de eradiate bactérias que flutuam na solução (Figura 1A). Controle UVC tempo de luz através de um timer programável usando um recurso aleatório que liga às vezes variando entre 15 e 26 min a cada 15-30 minutos para evitar o aquecimento excessivo do aCSF. </li><li> Definir a taxa de fluxo na câmara UVC a 12 mL / min conforme relatado anteriormente 12. Cubra a câmara UVC com papel alumínio para evitar UVC iluminação no exterior da câmara, o que pode danificar o tecido neuronal. NOTA: Para o tecido da retina de adaptação ao escuro, aplique uma capa feita sob medida para a câmara principal para eliminar a luz. </li><li> Use uma bomba peristáltica para Circulate a solução (aCSF) através das duas câmaras e uma placa fria termoeléctrico refrigerador Peltier para refrigeração ou o aquecimento, quer a câmara principal para as temperaturas desejadas na gama de 0 - 50 ° C. Para a incubação de tecido óptima, usar 15-16 ° C durante a viabilidade a longo prazo. </li></ol> 4. O cálcio corante de carregamento <ol><li> Selecione corantes de cálcio com base na preferência do pesquisador individual. Aqui usamos Fura-02:00, Fluo-08:00 ou Fluo-04:00. No entanto, este método pode ser aplicado a outros corantes, bem como: dissolver corantes de cálcio em DMSO a uma solução de copolímeros de 1 mM e 1% de bloco (por exemplo, ácido-127 plurónico) para um volume final de 50 mL e sonicado durante 10 minutos. </li><li> Adicionar a solução de aCSF a uma concentração final de 10 uM, copolímeros em bloco 0,01% de fatias cerebrais, e 20 uM (retina), copolímeros em bloco 0,02% para a retina. Na retina (papaína tratados) e fatias de cérebro de animais jovens, de carga para o banho durante 45 minutos a 37 ° C (Fura-2 AM) ou à TA (Fluo-4 AM; FLuo-08:00). <ol><li> Para animais adultos, (&gt; 12 semanas), pipetar os corantes (50 ul) directamente sobre as fatias de cérebro, e manter por 75 min para permitir uma melhor penetração do corante nas camadas profundas. </li><li> Para garantir uma oxigenação adequada do fatia submersa durante a incubação corante, preparar uma câmara de carga de vidro com uma tampa fechada (frasco circular de 2,5 cm de diâmetro, 3,5 centímetros de altura) com corantes de cálcio diluída em 2,5 mL de aCSF. Oxigenar continuamente com 95% O2 / 5% de CO 2. não bolha. </li></ol></li><li> Após carga de corante, lavar o tecido com aCSF e transferência para o sistema de incubação, reduzir-se lentamente a temperatura a 15-16 ° C até à sua utilização experimental. </li></ol> 5. As gravações eletrofisiológicas e imagem <ol><li> Colocar o tecido numa câmara de registo submersa sob um microscópio, e perfundir com aCSF oxigenado a um caudal de 4-5 ml / min, quer à TA (~ 22 ° C) ou à temperatura fisiológica (~ 35 ° C). hold o tecido no seu lugar por um feito usando &#39;&#39; harpa &#39;&#39;, feito de fios de nylon ou de ouro esticada e colada através de uma peça em forma de U, de ouro ou de fio de platina. </li><li> Para eletrofisiologia: <ol><li> Prepare pipetas de gravação de 1,5 mm (1,19 milímetros ID) vidro de borosilicato usando um extrator micropipeta para conseguir uma resistência final dos 5-6 mohms. </li><li> Encha a pipeta com 3-4 mL de solução interna como descrito anteriormente 13 e visualizar células sob infravermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC) usando uma câmera CCD. A solução intracelular devem ser cuidadosamente adaptado para cada experimento para alcançar resultados experimentais. </li><li> Posição pipeta, enquanto se mantém a pressão positiva aplicada através de uma porta de sucção no suporte da pipeta, sobre a membrana de uma célula utilizando um micromanipulador. Uma vez que a ILM foi removido a partir da retina, sem raspagem membrana prévia é necessária. Uma vez que a pipeta está na célula, aplicar negativo suavepressão para a pipeta para obter uma vedação gigaohm. Em seguida, ruptura da membrana celular com uma breve quantidade de pressão negativa. </li><li> Fazer gravações de observação de correntes ou de tensão-clamp de células inteiras usando técnicas padrão, conforme apropriado. </li></ol></li><li> Cálcio-imaging: <ol><li> Para geração de imagens raciométrica de Fura-2, use um comutador de comprimento de onda ultra-alta velocidade para proporcionar a comprimentos de onda de excitação de 340 nm e 380 nm. Passar a luz emitida a partir de células individuais através de um filtro de emissão de 510 ± 20 nm, e capturar com uma sensibilidade elevada, a câmara digital de alta velocidade. </li><li> Para um único comprimento de onda de excitação de Fluo-4, luz de excitação do filtro através de um 460 - banda nm filtro passa-490 e luz emitida através de um 515 - filtro passa banda nm 550. Para a gravação mais rápida e mais sensível usar uma câmera digital de alta velocidade tal. Adquirir imagens conforme necessário. </li><li> Medir alterações na fluorescência como uma função do tempo, quer a um único comprimento de onda (Fluo-4) ou utilizando o rácio de comprimento de ondamétodo (Fura-2), tal como descrito anteriormente 8, 14. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Yossi Buskila e Paul Breen declaram que são co-proprietários da PAYO Scientific Pty Ltd, uma empresa especializada na construção de sistemas de incubação para tecido neural agudo. Todos os outros autores não relatam interesses financeiros ou potenciais conflitos de interesse relacionados ao presente estudo.

Este artigo descreve um método de incubação para estender a viabilidade do tecido neuronal aguda para geração de imagens e eletrofisiológicos experimentos, reduzindo assim o número de animais necessários para completar objetivos experimentais. Dois processos principais governam a deterioração do tecido neuronal ao longo do tempo: i) aumento dos níveis de bactérias, eo aumento de acompanhamento endotoxina bacteriana lançado, e ii) excitotoxicidade que segue o procedimento de corte traumática 10. C...

Eletrofisiologia e imagens funcionais (cálcio, tensão corantes sensíveis) são duas das técnicas experimentais mais comumente usados ​​em neurociência. preparações fatia do cérebro e da retina wholemount, que será analisada aqui, fornecer um meio de examinar propriedades eletrofisiológicas e conectividade sináptica sem contaminação de anestésicos e relaxantes musculares. Fatias de cérebro e da retina Wholemount manter a sua integridade estrutural, ao contrário de culturas ou homogeneizados celulares, permitindo o estudo de circuitos específicos e redes cerebrais 1. Gravações de tecido isolado têm vantagens sobre em gravações vivo como os movimentos associados ao batimento cardíaco e respiração são eliminados. Além disso, a visualização direta permite que classes específicas de células a serem alvejados e aplicação local de ferramentas farmacológicas 2, 3. gravações de patch-clamp e calcio-corante de carga em wholemount retina é complicado devido à existência da membrana interna limitante (ILM), que cobre a camada de células ganglionares da retina (RGC) e impede o acesso directo às células. Tipicamente, esta membrana é raspada com uma pipeta de vidro para permitir a aplicação directa de uma pipeta de adesivo e a formação de uma vedação gigaohm numa única célula. Além disso, os corantes de cálcio aplicado-banho não atravessar a ILM e quer deve ser injetado sob essa membrana 4, transportado retrogradamente a seguir à injecção no nervo óptico 5 ou electroporadas através do tecido 6. Além disso, quando se utiliza um modelo de roedor de retinite pigmentosa, o rato rd / rd, a ILM é mais espessa e mais impenetrável. Aqui, usamos uma técnica para remover a ILM com a digestão enzimática 7, para permitir que tanto o cálcio onipresente corante de carregamento, e acesso directo à células ganglionares da retina para patch-clamp recordiNGS 8. gravações bem sucedidas a partir de qualquer fatias cerebrais ou da retina wholemount depender de dissecção e de incubação de tecido neuronal viável. Tipicamente, o tecido é extraído na manhã da experiência e incubada em fluido cerebrospinal artificial (aCSF) até que seja usada para gravações. Geralmente, o tecido permanece viável durante 6 - 8 h, com uma degradação significativa após esta janela de tempo. No entanto, ambas as fatias de cérebro e preparações retinae wholemount costumam produzir mais tecido do que pode ser gravado a partir de dentro deste período de tempo curto. Consequentemente, o tecido é muitas vezes descartados no final do dia e a dissecção é completada novamente nos dias subsequentes. Isso significa que um outro animal é utilizado e ~ 2 h de configuração e dissecção / coloração repetida. O protocolo seguinte descreve um método para aumentar a vida útil do tecido neuronal durante mais de 24 h, o que significa que menos animais são utilizados, e mais tempo experimental está disponível. Tissue viabilidade wcomo avaliado por meio de gravação propriedades eletrofisiológicas e dinâmica do cálcio, e essas propriedades eram indistinguíveis entre &lt;4 h e&gt; 24 h postdissection. Estes resultados indicam que não só são propriedades de uma única célula intacta e funcional após incubação prolongada, mas a atividade da rede, tal como avaliado por cálcio e de imagiologia e registos electrofisiolicos, mantém-se inalterado&gt; 24 h postdissection. Além disso, mostramos que os corantes de cálcio pode permanecer nas células durante períodos prolongados, sem causar quaisquer efeitos prejudiciais. A aplicação deste protocolo demonstra que a actividade funcional de neurónios no tecido neuronal aguda pode ser mantida por períodos longos, uma vez que o ambiente externo é altamente regulado. Além disso, como a viabilidade do tecido varia muito entre laboratórios devido a diferentes protocolos de incubação, este método estabelece um padrão de ouro para os parâmetros ideais que devem ser aplicadas para reduzir a variabilidade na saúde de neu agudatecido ronal.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Metil-D-glucamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio&nbsp;</td>Sistema de Dissociação <td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>Dimetilsulfóxido anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Baixa absorção de UV*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>Solução a 20% em DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo de lâmina vibratória&nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>equipado com Leica' s Vibrocheck&trade; dispositivo de medição&nbsp;</td></tr><tr><td>Mesa antivibração</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Vertical de Platina Fixa</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de Microscópio</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&nbsp;</td></tr><tr><td>Objetiva de Microscópio</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>Comutador de comprimento de onda de alta velocidade</td><td>Instrumento</td><td>Sutter Lambda DG-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de patch clamp</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aquisição de dados</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; Sistema</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de microeletrodos</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Extrator de micropipeta tipo flamejante/marrom</td></tr><tr><td>Câmara de gravação/perfusão</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Câmaras de banho abertas de baixo perfil</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem de células vivas Andor iQ</td><td>Andor Andor</td><td>iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Termoelétrico Resfriador de placa fria</td><td>Tecnologia TE Controlador</td><td>de temperatura CP-121</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecnologia TE</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

a incubação prolongada de aguda neuronal tissue de eletrofisiologia e cálcio-imaging

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Aguda preparações de tecidos neuronais, fatias de cérebro e da retina wholemount, normalmente só pode ser mantida durante 6-8 h após a dissecação. Isto limita o tempo experimental, e aumenta o número de animais que são utilizados por cada estudo. Esta limitação especificamente impactos protocolos como imagem de cálcio que exigem prolongada pré-incubação com corantes aplicados-banho. exponencial do crescimento bacteriano dentro de 3 - 4 h após o corte é fortemente correlacionada com uma diminuição na saúde dos tecidos. Este estudo descreve um método para limitar a proliferação de bactérias em preparações agudas, para manter o tecido neuronal viável durante períodos de tempo prolongados (&gt; 24 h) sem a necessidade de antibióticos, procedimentos de esterilização, ou meios de cultura de tecidos contendo factores de crescimento. E ligando o fluido extracelular por meio de irradiação UV e manter o tecido numa câmara de retenção costume em 15-16 ° C, o tecido não mostra nenhuma diferença de propriedades electrofisiológicas, ou Si cálciognaling através corantes de cálcio intracelular em&gt; 24 h postdissection. Estes métodos não só irá aumentar o tempo experimental para aqueles que utilizam tecido neuronal aguda, mas irá reduzir o número de animais necessários para completar objectivos experimentais, e irá definir um padrão de ouro para a incubação do tecido neuronal aguda.

regulação apertada da carga bacteriana e a temperatura do aCSF durante a incubação é essencial para manter a viabilidade do tecido neuronal. Isto pode ser optimizado por meio de irradiação com luz UVC e mantendo a temperatura do aCSF a 15-16 ° C (Figura 1). Além disso, o aCSF os parâmetros de selo (APS; Figura 1C) fornece o experimentador com um registro das condições ambientais (pH e temperatura.), Oferecendo assim um padrão de ouro para os parâmetros q...

Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por&gt; 24 h.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

O objetivo geral desta técnica é manter o tecido neuronal por períodos prolongados sem degradação tecidual significativa. Utilizando este método, gravações eletrofisiológicas e imageamento de cálcio podem ser realizados mais de 24 horas após a extração do tecido. Este método aumentará significativamente a viabilidade do tecido neuronal extraído de forma aguda e manterá sua viabilidade por mais de 24 horas, estabelecendo um novo padrão-ouro para incubação de tecido agudo.A principal vantagem desta técnica é que o tempo experimental em que o tecido pode ser utilizado é significativamente aumentado. Isso reduz o número de animais necessários e maximiza a quantidade de dados que podem ser obtidos a partir de cada experimento. O Braincubator é um sistema automatizado que mantém a temperatura do tecido e impede a proliferação bacteriana no fluido extracelular.Isso fornece um ambiente rigorosamente controlado para o tecido. Demonstrando este procedimento estarão Orsolya Kekesi e Alba Bellot-Saez, estudantes de doutorado do meu laboratório. Para a preparação de fatias cerebrais, prepare fatias cerebrais com espessura de 300 micrômetros que contenham a região de interesse utilizando um vibrátomo.Em seguida, transfira as fatias para um sistema de incubação personalizado com fluxo de carbogênio, níveis de pH e temperatura controlados. Ajuste a temperatura inicial da câmara para 35 graus Celsius por 15 a 30 minutos e, em seguida, reduza-a lentamente para 15 graus Celsius. Após isso, incube as fatias no sistema de incubação até a gravação de eletrofisiologia ou imageamento.Para o preparo de montagem total da retina, enucleie imediatamente os olhos de um animal eutanasiado. Faça um pequeno corte ao longo da ora serrata e coloque os olhos em meio de Ames ou aCSF com fornecimento de carbogênio à temperatura ambiente. Em seguida, remova imediatamente a córnea, o cristalino e o vítreo cortando ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena e retire-os com pinça.Coloque o tecido no sistema de incubação à temperatura ambiente. Para remover a membrana limitante interna, transfira a cúpula ocular contendo a retina para um pequeno frasco de vidro contendo papaína, L-cisteína, EDTA e DNase a 37 graus Celsius por 20 minutos. Aplique carbogênio à solução através da tampa, mas não borbulhe.Interrompa a digestão enzimática colocando o tecido em uma solução de ovomucóide e BSA por 10 minutos em Earle's BSS. Em seguida, lave bem o tecido com aCSF. Posteriormente, transfira o tecido para o sistema de incubação e reduza a temperatura para cerca de 15 a 16 graus Celsius.Em seguida, transfira o tecido retiniano para o microscópio. Isole a retina do fundo do olho e corte-a em quatro pedaços com uma lâmina de barbear. Se for necessário utilizar a retina inteira, faça quatro pequenos cortes na periferia da retina para permitir que ela fique plana.Este tecido pode agora ser transferido para o microscópio para eletrofisiologia ou mantido no Braincubator. O tecido é mantido na câmara principal, que contém as sondas para medições de pH e temperatura. Uma segunda câmara é isolada da câmara principal e exposta à luz UVC de 1,1 watt, a fim de irradiar bactérias flutuando na solução.Use uma bomba peristáltica para circular aCSF através das duas câmaras e uma placa fria termoelétrica de Peltier para resfriar ou aquecer a câmara principal. Neste procedimento, dissolva o corante de cálcio em DMSO para obter uma solução de um milimolar. Adicione 1% de ácido plurônico F-127 à mistura para atingir um volume final de 50 microlitros.Em seguida, sonique por 10 minutos. Prepare uma câmara de carregamento de vidro com corante de cálcio diluído em 2,5 mililitros de aCSF para obter uma concentração final de 10 micromolar para fatias cerebrais e 20 micromolar para retina. Para retina e fatias cerebrais de animais jovens, incube a amostra no banho por 45 minutos.Para animais adultos, pipete 25 microlitros de corante diretamente sobre o corte cerebral e mantenha por 75 minutos para permitir uma melhor penetração do corante nas camadas mais profundas. Para garantir uma oxigenação adequada do tecido submerso durante a incubação com o corante, oxigene-o continuamente com carbogênio através da tampa, mas sem borbulhar. Após a carga com o corante, lave o tecido com aCSF e transfira-o para o sistema de incubação.Reduza lentamente a temperatura para cerca de 15 a 16 graus Celsius até o uso. Para a gravação, coloque o tecido em uma câmara de gravação submersa sob um microscópio e perfunda-o com aCSF oxigenado a uma taxa de fluxo de quatro a cinco mililitros por minuto. Segure o tecido utilizando uma harpa personalizada.Em seguida, prepare alguns eletrodos de gravação utilizando um puxador de micropipetas para obter uma resistência final de cinco a seis megaohms. Encha uma pipeta com três a quatro microlitros da solução interna e, então, coloque a solução em gelo. Em seguida, visualize as células usando uma câmera CCD em DIC-IR.Posicione a pipeta na membrana celular usando um micromanipulador. Mantenha pressão positiva através de uma porta de sucção no suporte da pipeta. Uma vez que a pipeta esteja sobre a célula, aplique pressão negativa suave à pipeta para obter um selo de gigaohm.Em seguida, rompa a membrana celular com pressão negativa breve. Posteriormente, inicie a gravação de corrente ou potencial em modo de célula inteira. Para a imagem ratiométrica de Fura-2, utilize um comutador de comprimento de onda de ultra-alta velocidade para fornecer comprimentos de onda de excitação de 340 nanômetros e 380 nanômetros.Em seguida, capture a luz emitida por meio de um filtro de emissão com uma câmera digital de alta sensibilidade e alta velocidade. Para um único comprimento de onda de excitação do Fluo-4, filtre a luz de excitação por meio de um filtro de passagem de banda de 460 a 490 nanômetros e a luz emitida por meio de um filtro de passagem de banda de 515 a 550 nanômetros. Após a digestão, as células ganglionares da retina e as células amácrinas deslocadas podem ser claramente visualizadas sob iluminação DIC e podem ser alvejadas para gravações de patch clamp sem qualquer raspagem prévia da membrana limitante interna.Registros representativos em clamp de corrente de uma célula ganglionar da retina são mostrados aqui. A despolarização da célula por meio da pipeta de patch provocou a geração de potenciais de ação dependentes da dose, indicando a viabilidade das células após o tratamento com papaína. A remoção da membrana limitante interna também permitiu a coloração ubíqua da camada de células ganglionares com Fura-2 AM. Além disso, as células responderam à aplicação de cloreto de potássio a 30 milimolares com um grande aumento na concentração de cálcio intracelular, evidenciado pelo aumento na razão entre 342 e 380 nanômetros em relação a F0. Após a aplicação de cloreto de potássio, os níveis de cálcio retornaram ao valor basal após a estimulação.E as células puderam ser subsequentemente estimuladas para produzir uma resposta de amplitude semelhante. Além disso, essas respostas foram indistinguíveis entre retinas registradas em menos de quatro horas e em mais de 24 horas após a dissecação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tecido neuronal agudo é ambientalmente vulnerável.Portanto, a regulação rigorosa do aCSF mediante monitoramento contínuo de pH, temperatura e níveis bacterianos é essencial para manter a atividade celular e a integridade da rede. Este procedimento pode ser utilizado para manter o tecido neuronal por mais de 24 horas sem a necessidade de técnicas assépticas ou do uso de meios de cultura contendo fatores de crescimento ou antibióticos que possam afetar a fisiologia. Esperamos que este método estabeleça o padrão ouro para os parâmetros ideais que maximizem a viabilidade do tecido.Isso reduz a variabilidade na saúde do próprio tecido e, consequentemente, diminui a variabilidade experimental. O uso do protocolo com papaína para digerir a membrana limitante interna da retina torna possível obter uma marcação ubíqua com corantes de cálcio. Este protocolo também pode ser utilizado para obter gravações intracelulares multissítio de neurônios da camada de células ganglionares.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manter tecidos viáveis por mais de 24 horas para experimentos de imagem e eletrofisiológicos. Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser perigoso. Precauções, como o uso de proteção ocular, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Demonstramos como alterações na concentração do cálcio intracelular livre e eficácia sináptica podem ser monitorizados simultaneamente num gânglio de...

Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco<em&gt; Aplysia</em

Este vídeo demonstra um método para incubação prolongada do tecido neuronal da retina. As oculares contendo retina são obtidas de um olho de camundongo; a membrana limitante interna (ILM) é digerida enzimaticamente para expor as células neuronais da retina, e a ocular tratada ou a retina isolada é transferida para uma incubadora especializada para incubação prolongada a baixa temperatura.

Uma técnica para a incubação prolongada do tecido neuronal da retina

Este vídeo demonstra um protocolo para registro de patch-clamp de células inteiras e imagens de cálcio de dois fótons em fatias do hipocampo cerebral. Este método permite estudar a dinâmica de transientes locais de Ca2+ (CaTs) em dendritos de diferentes tipos neuronais em fatias cerebrais agudas.

Estabelecendo uma configuração de célula inteira para imagens de cálcio de dois fótons de fatias cerebrais

Este vídeo demonstra uma técnica para medir a atividade neuronal em fatias de cérebro de camundongos usando imagens de cálcio e registros eletrofisiológicos. Ao perfundir o tecido com íons de potássio e registrar as alterações de cálcio intracelular por meio de imagens digitais de alta velocidade, esse método revela respostas neuronais em tempo real.

Medindo a atividade neural em uma fatia de cérebro de camundongo após incubação prolongada

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede de neurônios e glia localizada na parede intestinal que controla os reflexos intestinais. Este protocolo descreve métodos para registrar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações vivas de ENS usando imagens de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Apresentamos um protocolo para preparar fatias agudas do hipocampo dorsal-intermediário de camundongos. Comparamos esta preparação transversal com o corte coronal em termos de qualidade de gravações e preservação de características morfológicas de neurônios registrados.

Preparação de fatias agudas do hipocampo dorsal para gravação de células inteiras e reconstrução neuronal no giro dentado de camundongos adultos

Aprenda a manter tecido neuronal agudo viável por mais de 24 horas usando o sistema Braincubator para eletrofisiologia e imagem de cálcio. Este método reduz o número de animais necessários e maximiza a coleta de dados experimentais.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

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