Usando em Vitro viver-pilha de imagem para explorar Chemotherapeutics entregues por nanopartículas de lipídios-baseado
1 de novembro de 2017
Imagem latente da viver-pilha é uma poderosa ferramenta para visualizar processos dinâmicos. O exame das células fixos fornece apenas imagens estáticas, que podem levar a má interpretação e confusão sobre o processo. Este trabalho apresenta um método para estudar a absorção, liberação de drogas e localização intracelular de nanopartículas lipossomas em pilhas vivas.
O objetivo geral desta técnica de imagem de células vivas é acompanhar processos celulares como a captação e distribuição de agentes quimioterápicos sem a necessidade de fixação. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como: como os agentes quimioterápicos, na forma livre ou encapsulados em nanopartículas, são absorvidos pelas células tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que estamos fazendo imagens de células vivas, evitando artefatos de fixação e permitindo a avaliação dinâmica em tempo real.
Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando observamos que os nanoparciais quebravam durante a fixação, o que levava a uma interpretação errônea da entrega do medicamento. Para montar a câmara de imagem, coloque uma lamínula de 25 milímetros na parte inferior da câmara e aparafuse a parte superior na parte inferior. Não aperte com muita força, pois o vidro pode quebrar.
Autoclave toda a câmara. Para revestir as células, remova a câmara de imagem da bolsa de esterilização em um gabinete de fluxo laminar. Aperte cuidadosamente a câmara e coloque-a em uma placa de Petri.
Cubra o vidro da câmara de imagem com um mililitro de gelatina estéril a 0,1% por 20 minutos a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Depois de remover o meio dos frascos de cultura de células, lave as células uma vez com 1x PBS e separe as células usando 0,25% de tripsina. Inative a tripsina adicionando meio de cultura celular.
Em seguida, colete as células e gire-as a 1.100 Gs por cinco minutos. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de cultura celular. Depois de contar as células conforme descrito no protocolo de texto, aspire a gelatina e coloque as células em uma diluição que permita uma cobertura máxima de 70% em 24 horas.
Deixe as células aderirem a cinco por cento de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas. Realize uma avaliação das células ao microscópio quanto à confluência, morfologia celular e contaminação. Em seguida, ligue o microscópio confocal, a luz fluorescente e o computador.
Conecte o aquecedor da lente à objetiva e ajuste-o para 35 graus. Prepare a unidade de incubação conforme mostrado no protocolo de texto. Coloque a unidade de incubação no microscópio stage e conecte o tubo de dióxido de carbono de entrada e saída.
Abra a válvula principal de dióxido de carbono e ligue o controlador de dióxido de carbono. Verifique se o controlador está configurado para cinco por cento de dióxido de carbono. Condições adequadas de cultura celular, como temperatura, CO2, pH, umidade e esterilidade, são cruciais para imagens celulares de longo prazo.
Portanto, para cada incubadora, isso precisa ser testado adequadamente. Defina a temperatura do palco para 37 graus Celsius. Permita que a unidade de incubação atinja a temperatura selecionada e a porcentagem de dióxido de carbonotage.
Pegue a câmara de imagem da incubadora principal de dióxido de carbono e transporte a câmara em uma placa de Petri para a sala de microscopia. Coloque a câmara de imagem em um suporte de platina de 35 milímetros de diâmetro feito sob medida e feche a câmara com uma tampa de vedação feita sob medida. Abra a unidade de incubação e trabalhe o mais rápido possível para evitar o resfriamento das células; Substitua o adesivo vermelho pela câmara de imagem e feche a unidade.
Certifique-se de que nenhum cabo esteja preso entre a platina e o microscópio. Deixe a unidade se aclimatar por 30 minutos. Em seguida, abra o software e ligue o laser.
Crie um novo banco de dados clicando em Novo"na guia Arquivo. Nomeie e salve o banco de dados. Defina a configuração clicando em Config"na guia Adquirir.
Selecione Modo de canal "e Trilha única" para avaliar um único fluoróforo. Selecione Multi Track"para vários fluoróforos. Em seguida, escolha os filtros de banda passados apropriados, combinando com o fluoróforo.
Selecione o canal de campo claro em uma das trilhas. A varredura fica comprometida entre o sinal fluorescente dos compostos e a qualidade da imagem. A superexposição, o fotobranqueamento, a relação sinal-ruído, a qualidade das células, os compostos adicionados são fatores que podem influenciar os resultados e precisam ser devidamente testados.
Defina o controle de varredura clicando em Digitalizar"na guia Adquirir. Em seguida, clique em Modo"para definir o tamanho do quadro, a velocidade de digitalização, a direção da varredura e a média de varredura. Clique em Canais" para definir o orifício, o ganho e o deslocamento e a potência do laser.
Salve essas configurações clicando em Config"na guia Configuração e salve-as no banco de dados de configuração. Defina o lapso de tempo clicando em Muti TimeX"na guia Macro. Clique em Local único.
Aplique a configuração salva clicando em Trilha única"e role até a configuração necessária no banco de dados de configuração. Defina o intervalo de tempo e o número de varreduras. Carregue a configuração clicando em Load Conf.
Nomeie o lapso de tempo no Nome do arquivo base e selecione o banco de dados clicando em Base de dados de imagem" para salvar o lapso de tempo. Defina uma pasta temporária clicando em Pasta de imagem temporária"Em seguida, abra a unidade de incubação, levante o anel de imagem, adicione uma gota de óleo de imersão à objetiva e feche a unidade o mais rápido possível. Foque e selecione uma posição na câmara de imagem.
No Gabinete de Fluxo Laminar, dilua o medicamento livre ou nanopartículas a uma concentração de cinco microgramas por mililitro de medicamento ou 0,05 micromoles de lipídios em meio de cultura celular. Filtre através de um filtro de seringa de 0,22 mícron se o medicamento ou as nanopartículas não forem estéreis. Abra a câmara de incubação e levante a tampa do teto.
Em seguida, remova o meio das células, adicione um mililitro de droga diluída ou nanopartículas e feche a unidade o mais rápido possível. Concentre-se nas células e faça uma varredura rápida clicando em Único"na guia Controle de varredura. Quando a imagem de campo claro mostrar células focadas, inicie o lapso de tempo clicando em Hora de início" na macro Multi TimeX.
O número de repetições e o tempo restante são mostrados na Macro e nas imagens. Verifique regularmente se as células ainda estão focadas ou use o foco automático. O programa salva automaticamente o lapso de tempo no banco de dados.
Não feche o banco de dados enquanto o programa estiver em execução. Este é um lapso de tempo de três horas de células expostas à doxorrubicina livre. Observe a captação e a translocação imediata da doxorrubicina fluorescente vermelha para o núcleo.
Aqui, as células são incubadas por três horas com doxorrubicina encapsulada. O sinal fluorescente é muito menor e está localizado no citoplasma. O sinal dificilmente é visível no núcleo.
Transportando estes filmes em time-lapse para a Imagem J, é possível desenhar uma região de interesse em torno do núcleo e medir a densidade de pixels. O gráfico aqui apresentado mostra a diferença na captação nuclear ao longo do tempo em células incubadas com doxorrubicina livre ou encapsulada. Aqui estão as células incubadas com doxorrubicina encapsulada, mostradas em vermelho.
O sinal roxo representa o portador e os lisossomos são corados com um marcador verde de células vivas. A comparação dos dois tipos de células mostra uma diferença na distribuição lisossômica. Os lisossomos nas células B16BL6 são distribuídos por todo o citoplasma.
Considerando que, os lisossomos nas células BLM estão localizados perto do núcleo. No entanto, ambas as linhagens celulares mostram uma alta colocalização do sinal vermelho e roxo nos lisossomos, indicando que a doxorrubicina e seu transportador estão presos nessas organelas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens da absorção de agentes quimioterápicos e outros marcadores fluorescentes em células vivas por várias horas ou até dias.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma técnica de microscopia em células vivas para visualizar a captação e distribuição de agentes quimioterápicos em tempo real. Ao evitar artefatos de fixação, o método permite a observação precisa dos processos de entrega de fármacos em células vivas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Pesquisa sobre Câncer
Contexto
- A microscopia em células vivas fornece insights dinâmicos sobre processos celulares.
- A microscopia em células fixadas pode levar à interpretação equivocada dos mecanismos de entrega de fármacos.
- As nanopartículas podem se degradar durante a fixação, complicando a análise.
- A microscopia em tempo real é essencial para compreender as interações de fármacos na terapia do câncer.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para acompanhar a captação de agentes quimioterápicos em células vivas.
- Avaliar a distribuição de nanopartículas sem artefatos de fixação.
- Ampliar a compreensão dos mecanismos de entrega de fármacos em células tumorais.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma câmara de imagem para observação de células vivas.
- Cultivo celular em condições controladas (temperatura, CO2, umidade).
- Uso de microscopia confocal para monitorar processos celulares.
- Imageamento com lapso de tempo para capturar mudanças dinâmicas ao longo do tempo.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da captação e distribuição de fármacos em tempo real.
- Demonstrou as vantagens da microscopia em células vivas em comparação com métodos em células fixadas.
- Forneceram informações sobre o comportamento de nanopartículas em células vivas.
- Permitiram a observação das respostas celulares à exposição ao fármaco.
Conclusões
- A microscopia de células vivas é uma ferramenta valiosa para o estudo dos mecanismos de entrega de fármacos.
- O método reduz o risco de interpretação equivocada associado à fixação.
- Aplicações futuras podem aprimorar as estratégias de tratamento do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem em células vivas permite o rastreamento em tempo real da captação de nanopartículas quimioterápicas e seu tráfego intracelular, abordando uma lacuna crítica no desenvolvimento de fármacos oncológicos onde artefatos de fixação obscurecem eventos dinâmicos de liberação do fármaco e translocação nuclear. Essa abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas ao fornecer dados quantitativos e resolvidos no tempo sobre a cinética de liberação do fármaco e sua localização subcelular, informando diretamente a otimização de compostos iniciais e a seleção de candidatos pré-clínicos. Ao visualizar o destino de nanocarreadores à base de lipídios em células tumorais vivas, o método aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, reduzindo a eliminação tardia devido a mecanismos de ação mal compreendidos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a observação direta da liberação de agentes quimioterápicos a partir de nanocarreadores e subsequente translocação nuclear, esclarecendo a ligação mecanicista entre entrega e atividade biológica.
- Valor Operacional: Elimina artefatos induzidos pela fixação que distorcem a integridade das nanopartículas e a distribuição do fármaco, garantindo a interpretação precisa dos perfis de captação e liberação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera medidas quantitativas de intensidade de fluorescência ao longo do tempo, permitindo a comparação da cinética de fármacos livres versus encapsulados em um contexto fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Estabelece uma plataforma padronizada e reprodutível para avaliar sistemas de liberação de fármacos baseados em nanopartículas em condições de células vivas, apoiando a escalabilidade do ensaio e o reuso entre projetos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a degradação do nanocarreador e a liberação do fármaco com a colocalização lisossomal e o acúmulo nuclear, fornecendo um biomarcador translacional para a disponibilidade intracelular do fármaco.
- Valor Operacional: Facilita decisões de continuidade ou interrupção ao visualizar se os fármacos encapsulados alcançam entrega nuclear suficiente para provocar os efeitos farmacológicos esperados, reduzindo a incerteza mecanicista em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes, onde a visualização em tempo real da liberação do fármaco e da distribuição subcelular orienta as relações estrutura-atividade e a otimização do design de nanocarreadores antes dos testes de eficácia pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses quanto à estabilidade de nanocarreadores, cinética de liberação de fármacos e vias de tráfego intracelular, permitindo a observação direta da translocação da doxorrubicina do citoplasma para o núcleo.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas prontas para ensaios da captação de fármacos e acumulação nuclear ao longo do tempo, permitindo comparação paralela de variáveis de formulação sob condições idênticas de células vivas.
- Análises: Fornece dados de intensidade de fluorescência em sequência temporal a partir de regiões definidas de interesse (por exemplo, núcleo, lisossomos), permitindo comparação estatística da eficiência de entrega de fármacos entre agentes livres e encapsulados em nanopartículas.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o comportamento de nanocarreadores em células vivas com resultados farmacológicos posteriores ao correlacionar padrões de tráfego lisossomal com a disponibilidade do fármaco no núcleo, apoiando decisões de avanço alinhadas a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade de imagem modular aplicável em diversas plataformas de nanopartículas e agentes quimioterápicos, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante e permitindo triagem mecanicista em toda a carteira.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no mecanismo da droga ao revelar a liberação em tempo real da droga e a translocação nuclear, reduzindo a ambiguidade no engajamento do alvo e na ativação da via.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da padronização da preparação da câmara, controles ambientais e parâmetros de imagem, minimizando a variabilidade em estudos longitudinais de células vivas.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao identificar precocemente nanocarreadores não funcionais, evitando investimentos em sistemas de entrega que não liberam a droga ativa no local de ação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a nanocarreadores com base na liberação intracelular comprovada da droga e entrega nuclear, alinhando o avanço com a validade mecanicista.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microscopia de imagem em células vivas, microscopia confocal e aquisição com lapso de tempo para manter a viabilidade celular e a integridade do sinal ao longo de períodos prolongados.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo unidades de incubação com controle de temperatura e CO2, lasers confocais e detectores sensíveis para rastreamento de nanopartículas com baixo sinal.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação celular, dosagem de fármacos e aquisição de imagens para garantir comparabilidade entre estudos e locais distintos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens celulares, tamanhos de nanopartículas e marcadores fluorescentes, já que as relações sinal-ruído e os limiares de fototoxicidade variam conforme as condições experimentais.
- As limitações práticas incluem os riscos de fotodesvanecimento durante imagens de longa duração e a necessidade de otimização cuidadosa da potência do laser e da velocidade de varredura para equilibrar qualidade do sinal e saúde celular.
