Usando em Vitro viver-pilha de imagem para explorar Chemotherapeutics entregues por nanopartículas de lipídios-baseado
1 de novembro de 2017
Imagem latente da viver-pilha é uma poderosa ferramenta para visualizar processos dinâmicos. O exame das células fixos fornece apenas imagens estáticas, que podem levar a má interpretação e confusão sobre o processo. Este trabalho apresenta um método para estudar a absorção, liberação de drogas e localização intracelular de nanopartículas lipossomas em pilhas vivas.
O objetivo geral desta técnica de imagem em tempo real em células vivas é acompanhar processos celulares, como a captação e distribuição de Agentes Quimioterápicos, sem a necessidade de fixação. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área do câncer, tais como: como os Agentes Quimioterápicos, na forma livre ou encapsulados em nanopartículas, são internalizados pelas células tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que estamos realizando a imagem de células vivas, evitando assim artefatos de fixação e permitindo uma avaliação dinâmica em tempo real.
Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando observamos que as nanopartículas se degradavam durante a fixação, o que levava a uma interpretação equivocada da entrega do fármaco. Para montar a câmara de imagem, coloque um cubre-objeto de 25 milímetros na parte inferior da câmara e parafuse a parte superior na parte inferior. Não aperte demais, pois o vidro pode quebrar.
Autoclave toda a câmara. Para semear as células, remova a câmara de imagem da bolsa de esterilização em uma Cabine de Fluxo Laminar. Aperte cuidadosamente a câmara e coloque-a em uma Placa de Petri.
Revestir o vidro da câmara de imagem com um mililitro de gelatina estéril a 0,1 por cento durante 20 minutos a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Após remover o meio dos frascos de cultura celular, lavar as células uma vez com PBS 1x e destacar as células utilizando tripsina a 0,25 por cento. Inativar a tripsina adicionando o meio de cultura celular.
Em seguida, colete as células e centrifugue-as a 1.100 ×g durante cinco minutos. Re-suspenda o pellet em cinco mililitros de meio de cultura celular. Após a contagem das células conforme descrito no protocolo textual, aspire a gelatina e plaque as células em uma diluição que permita uma cobertura máxima de 70 por cento em 24 horas.
Deixe as células aderirem em 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas. Realize uma avaliação das células sob microscópio quanto à confluência, morfologia celular e contaminação. Em seguida, ligue o microscópio confocal, a luz fluorescente e o computador.
Conecte o aquecedor da lente ao objetivo e ajuste-o para 35 graus. Prepare a unidade de incubação conforme descrito no protocolo do texto. Coloque a unidade de incubação na platina do microscópio e conecte os tubos de entrada e saída de dióxido de carbono.
Abra a válvula principal de dióxido de carbono e ligue o controlador de dióxido de carbono. Verifique se o controlador está ajustado em cinco por cento de dióxido de carbono. Condições adequadas de cultivo celular, como temperatura, CO2, pH, umidade e esterilidade, são cruciais para a microscopia de células em longo prazo.
Portanto, cada incubadora precisa ser devidamente testada. Ajuste a temperatura do estágio para 37 graus Celsius. Aguarde a unidade de incubação atingir a temperatura selecionada e a porcentagem de Dióxido de Carbono.
Retire a câmara de imagemagem do incubador principal de Dióxido de Carbono e transporte a câmara em uma placa de Petri até a sala de microscopia. Coloque a câmara de imagemagem em um suporte de estágio personalizado com diâmetro de 35 milímetros e feche a câmara com uma tampa selante personalizada. Abra a unidade de incubação e, trabalhando o mais rápido possível para evitar o resfriamento das células, substitua o selo vermelho pela câmara de imagemagem e, em seguida, feche a unidade.
Certifique-se de que nenhum cabo esteja preso entre a platina e o microscópio. Deixe a unidade aclimatar por 30 minutos. Em seguida, abra o software e ligue o laser.
Crie um novo banco de dados clicando em Novo"abaixo da guia Arquivo. Nomeie e salve o banco de dados. Defina a configuração clicando em Config"abaixo da guia Adquirir.
Selecione o Modo Canal"e Rastreamento Único"para avaliar um único fluoróforo. Selecione Rastreamento Múltiplo"para vários fluoróforos. Em seguida, escolha os filtros de passagem de banda apropriados, compatíveis com o fluoróforo.
Selecione o canal de campo claro em uma das faixas. A varredura é comprometida entre o sinal fluorescente dos compostos e a qualidade da imagem. Sobreexposição, fotobranqueamento, relação sinal-ruído, qualidade das células e os compostos adicionados são todos fatores que podem influenciar os resultados e precisam ser adequadamente testados.
Defina o controle de varredura clicando em "Varredura" na guia "Adquirir". Em seguida, clique em "Modo" para definir o tamanho do quadro, a velocidade de varredura, a direção de varredura e a média de varredura. Clique em "Canais" para ajustar o Pinhole, o Ganho e o Offset, e a potência do laser.
Salve essas configurações clicando em Config na guia Configuração e salve-as no banco de dados de Configuração. Defina o intervalo de tempo clicando em Muti TimeX na guia Macro. Clique em Localização Única.
Aplicar a configuração salva clicando em "Single Track" e rolar até a configuração necessária no banco de dados de Configurações. Definir o intervalo de tempo e o número de varreduras. Carregar a configuração clicando em Load Conf.
Dê um nome ao intervalo de tempo no Nome do Arquivo Base e selecione o banco de dados clicando em "Banco de Dados de Imagens" para salvar o intervalo de tempo. Defina uma pasta temporária clicando em "Pasta de Imagens Temporárias". Em seguida, abra a unidade de incubação, levante o anel de imagem, adicione uma gota de óleo de imersão à objetiva e feche a unidade o mais rápido possível. Foque e selecione uma posição na câmara de imagem.
No gabinete de fluxo laminar, dilua a droga livre ou nanopartículas a uma concentração de cinco microgramas por mililitro de droga ou 0,05 micromol de lipídios em meio de cultura celular. Filtre através de um filtro de seringa de 0,22 mícron se a droga ou as nanopartículas não forem estéreis. Abra a câmara de incubação e levante a tampa superior.
Em seguida, remova o meio das células, adicione um mililitro do fármaco diluído ou de nanopartículas e feche a unidade o mais rápido possível. Foque nas células e realize uma varredura rápida clicando em Único na guia Controle de Varredura. Quando a imagem em campo claro mostrar as células focadas, inicie o registro temporal clicando em Iniciar Tempo na Macro Multi TimeX.
O número de repetições e o tempo restante são exibidos no Macro e nas imagens. Verifique regularmente se as células ainda estão em foco ou utilize o Autofoco. O programa salva automaticamente o registro temporal no banco de dados.
Não feche o banco de dados enquanto o programa estiver em execução. Este é um lapso de tempo de três horas de células expostas à doxorrubicina livre. Observe a captação e a translocação imediata da doxorrubicina fluorescente vermelha para o núcleo.
Aqui, as células são incubadas por três horas com doxorrubicina encapsulada. O sinal fluorescente é muito mais fraco e está localizado no citoplasma. O sinal é dificilmente visível no núcleo.
Transportando esses filmes de lapso de tempo para o Image J, pode-se desenhar uma região de interesse ao redor do núcleo e medir a densidade de pixels. O gráfico apresentado aqui mostra a diferença na captação nuclear ao longo do tempo em células incubadas com Doxorubicina livre ou encapsulada. São mostradas aqui células incubadas com Doxorubicina encapsulada, indicadas em vermelho.
O sinal roxo representa o vetor, e os lisossomos são corados com um marcador verde para células vivas. A comparação entre ambos os tipos celulares mostra uma diferença na distribuição lisossomal. Os lisossomos em células B16BL6 estão distribuídos por todo o citoplasma.
Por outro lado, os lisossomos em células BLM estão localizados próximos ao núcleo. No entanto, ambas as linhagens celulares mostram uma alta colocalização dos sinais vermelho e roxo nos lisossomos, indicando que a doxorrubicina e seu transportador estão aprisionados nesses organoides. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imaginar a captação de agentes quimioterápicos e outras marcas fluorescentes em células vivas por várias horas ou mesmo dias.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma técnica de microscopia em células vivas para visualizar a captação e distribuição de agentes quimioterápicos em tempo real. Ao evitar artefatos de fixação, o método permite a observação precisa dos processos de entrega de fármacos em células vivas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Pesquisa sobre Câncer
Contexto
- A microscopia em células vivas fornece insights dinâmicos sobre processos celulares.
- A microscopia em células fixadas pode levar à interpretação equivocada dos mecanismos de entrega de fármacos.
- As nanopartículas podem se degradar durante a fixação, complicando a análise.
- A microscopia em tempo real é essencial para compreender as interações de fármacos na terapia do câncer.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para acompanhar a captação de agentes quimioterápicos em células vivas.
- Avaliar a distribuição de nanopartículas sem artefatos de fixação.
- Ampliar a compreensão dos mecanismos de entrega de fármacos em células tumorais.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma câmara de imagem para observação de células vivas.
- Cultivo celular em condições controladas (temperatura, CO2, umidade).
- Uso de microscopia confocal para monitorar processos celulares.
- Imageamento com lapso de tempo para capturar mudanças dinâmicas ao longo do tempo.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da captação e distribuição de fármacos em tempo real.
- Demonstrou as vantagens da microscopia em células vivas em comparação com métodos em células fixadas.
- Forneceram informações sobre o comportamento de nanopartículas em células vivas.
- Permitiram a observação das respostas celulares à exposição ao fármaco.
Conclusões
- A microscopia de células vivas é uma ferramenta valiosa para o estudo dos mecanismos de entrega de fármacos.
- O método reduz o risco de interpretação equivocada associado à fixação.
- Aplicações futuras podem aprimorar as estratégias de tratamento do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem em células vivas permite o rastreamento em tempo real da captação de nanopartículas quimioterápicas e seu tráfego intracelular, abordando uma lacuna crítica no desenvolvimento de fármacos oncológicos onde artefatos de fixação obscurecem eventos dinâmicos de liberação do fármaco e translocação nuclear. Essa abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas ao fornecer dados quantitativos e resolvidos no tempo sobre a cinética de liberação do fármaco e sua localização subcelular, informando diretamente a otimização de compostos iniciais e a seleção de candidatos pré-clínicos. Ao visualizar o destino de nanocarreadores à base de lipídios em células tumorais vivas, o método aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, reduzindo a eliminação tardia devido a mecanismos de ação mal compreendidos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a observação direta da liberação de agentes quimioterápicos a partir de nanocarreadores e subsequente translocação nuclear, esclarecendo a ligação mecanicista entre entrega e atividade biológica.
- Valor Operacional: Elimina artefatos induzidos pela fixação que distorcem a integridade das nanopartículas e a distribuição do fármaco, garantindo a interpretação precisa dos perfis de captação e liberação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera medidas quantitativas de intensidade de fluorescência ao longo do tempo, permitindo a comparação da cinética de fármacos livres versus encapsulados em um contexto fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Estabelece uma plataforma padronizada e reprodutível para avaliar sistemas de liberação de fármacos baseados em nanopartículas em condições de células vivas, apoiando a escalabilidade do ensaio e o reuso entre projetos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a degradação do nanocarreador e a liberação do fármaco com a colocalização lisossomal e o acúmulo nuclear, fornecendo um biomarcador translacional para a disponibilidade intracelular do fármaco.
- Valor Operacional: Facilita decisões de continuidade ou interrupção ao visualizar se os fármacos encapsulados alcançam entrega nuclear suficiente para provocar os efeitos farmacológicos esperados, reduzindo a incerteza mecanicista em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes, onde a visualização em tempo real da liberação do fármaco e da distribuição subcelular orienta as relações estrutura-atividade e a otimização do design de nanocarreadores antes dos testes de eficácia pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses quanto à estabilidade de nanocarreadores, cinética de liberação de fármacos e vias de tráfego intracelular, permitindo a observação direta da translocação da doxorrubicina do citoplasma para o núcleo.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas prontas para ensaios da captação de fármacos e acumulação nuclear ao longo do tempo, permitindo comparação paralela de variáveis de formulação sob condições idênticas de células vivas.
- Análises: Fornece dados de intensidade de fluorescência em sequência temporal a partir de regiões definidas de interesse (por exemplo, núcleo, lisossomos), permitindo comparação estatística da eficiência de entrega de fármacos entre agentes livres e encapsulados em nanopartículas.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o comportamento de nanocarreadores em células vivas com resultados farmacológicos posteriores ao correlacionar padrões de tráfego lisossomal com a disponibilidade do fármaco no núcleo, apoiando decisões de avanço alinhadas a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade de imagem modular aplicável em diversas plataformas de nanopartículas e agentes quimioterápicos, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante e permitindo triagem mecanicista em toda a carteira.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no mecanismo da droga ao revelar a liberação em tempo real da droga e a translocação nuclear, reduzindo a ambiguidade no engajamento do alvo e na ativação da via.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da padronização da preparação da câmara, controles ambientais e parâmetros de imagem, minimizando a variabilidade em estudos longitudinais de células vivas.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao identificar precocemente nanocarreadores não funcionais, evitando investimentos em sistemas de entrega que não liberam a droga ativa no local de ação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a nanocarreadores com base na liberação intracelular comprovada da droga e entrega nuclear, alinhando o avanço com a validade mecanicista.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microscopia de imagem em células vivas, microscopia confocal e aquisição com lapso de tempo para manter a viabilidade celular e a integridade do sinal ao longo de períodos prolongados.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo unidades de incubação com controle de temperatura e CO2, lasers confocais e detectores sensíveis para rastreamento de nanopartículas com baixo sinal.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação celular, dosagem de fármacos e aquisição de imagens para garantir comparabilidade entre estudos e locais distintos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens celulares, tamanhos de nanopartículas e marcadores fluorescentes, já que as relações sinal-ruído e os limiares de fototoxicidade variam conforme as condições experimentais.
- As limitações práticas incluem os riscos de fotodesvanecimento durante imagens de longa duração e a necessidade de otimização cuidadosa da potência do laser e da velocidade de varredura para equilibrar qualidade do sinal e saúde celular.
