Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas
23 de março de 2017
Aqui, mostramos como analisar roteamento dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas. O fluxo de trabalho inclui uma técnica de imagem dual-vista a melhorar a qualidade de imagem e ferramentas computacionais para a detecção, registrar mandris dendríticas para a matriz coluna de referência e para analisar as estruturas dendríticas no espaço 3D.
O objetivo geral deste protocolo é analisar o roteamento dendrico de neurônios adultos da medula de drosófila em colunas e camadas para caracterizar padrões dendricos, determinar tipos de células com base na morfologia e identificar mutantes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, incluindo o mapeamento dos circuitos cerebrais e a compreensão do mecanismo de fiação do dendrito. A principal vantagem dessa técnica é que ela transmite as propriedades dendríticas no espaço tridimensional, melhorando assim a compreensão da lógica e das funções da fiação dendrítica.
O objetivo deste procedimento é adquirir duas pilhas de imagens dos neurônios de interesse em duas orientações ortogonais, horizontais e frontais. Usando as técnicas padrão, core cérebros de moscas dissecados com anti-GFP de coelho e um anticorpo que rotula os anticorpos primários dos axônios fotorreceptores. Em seguida, rotule os anticorpos primários com anticorpos secundários fluorescentes e limpe o cérebro com glicerol a 70% e PBS 1X.
Para montar o cérebro na orientação horizontal, transfira um cérebro limpo com glicerol para uma gota de 20 microlitros de meio de montagem antidesbotamento depositado centralmente na lâmina do microscópio. Em seguida, em uma lamínula, prenda pequenos pedaços de argila nos quatro cantos para evitar que a lamínula esmague o cérebro. Agora, sob um microscópio de dissecação, posicione os cérebros na posição ventral para cima.
Use a superfície dorsal convexa do cérebro como um ponto de referência para identificar a orientação da amostra do cérebro. Isso fornecerá uma visão horizontal do neurônio. Em seguida, anexe a lamínula.
Usando um microscópio confocal, idealmente equipado com detectores GaAsP, obtenha a pilha de imagens de visão horizontal com uma objetiva de alta abertura numérica e zoom digital de 2,5. Adquira pelo menos 180 seções ópticas, tenha 512 pixels quadrados e um tamanho de passo de 2 mícrons. Depois de tirar a primeira pilha de imagens, remova a lamínula da lâmina e reposicione o cérebro na posição anterior para cima, o que fornece uma visão frontal.
Em seguida, usando a mesma técnica, faça uma nova pilha de imagens da visão frontal dos mesmos neurônios fotografados na visão horizontal. Certifique-se também de registrar a localização do neurônio de interesse em relação à medula neuropal. Identificar os mesmos neurônios é viável sob menor ampliação.
No entanto, se o sinal for perdido porque o tecido é profundo, basta visualizar a metade ventral do seu cérebro. Verifique também se a amostra se moveu durante a aquisição de imagens examinando as pilhas de imagens. A convolução da imagem e a combinação da imagem são detalhadas no protocolo de texto.
O objetivo deste procedimento é rastrear neurites e atribuir pontos de referência para registro. Primeiro, abra o arquivo de imagem recombinado. Em seguida, vá para editar.
Em seguida, mostre o ajuste da tela e desligue o canal fotorreceptor, que é vermelho. Em seguida, visualize a imagem no modo de superação. Se o computador estiver equipado com um sistema de estereografia, ligue o estéreo e use o modo de buffer quádruplo para visualizar imagens 3D.
Adicione novos filamentos, vá para superar, depois filamentos e clique na guia rotulada pular criação automática, editar manualmente. Em seguida, clique na guia de desenho e selecione AutoDepth. Em seguida, selecione as configurações.
Alterne a opção de linha e insira o número de pixel apropriado para melhor visualização. Em seguida, alterne mostrar dendritos, ponto inicial e ponto de ramificação e defina a qualidade de renderização para 100%Agora selecione a guia desenhar e comece a rastrear neurites. Comece com o axônio e depois passe para os dendritos.
O axônio e os dendritos dos neurônios transmedulares devem ser fáceis de diferenciar. Depois de rastrear os neurites, volte para as configurações e alterne o ponto inicial e o ponto de ramificação. Em seguida, vá para superar e exportar.
Selecione o objeto e salve o filamento como um arquivo do Inventor. O próximo passo é atribuir pontos de referência. Para começar, selecione mostrar ajuste de exibição e ative os dois canais de imagem.
Em seguida, vá para superar e, em seguida, para medir. E na guia de edição, alterne o canal específico e selecione o canal fotorreceptor neste caso. Agora atribua pontos de referência para a camada superior.
Selecione superar, depois pontos de medição e marque o início da camada m1 como uma camada superior. Use a função de plano de recorte para facilitar a atribuição de pontos. A ordem dos pontos é equatorial, equatorial anterior, anterior, ventral anterior, ventral, ventral posterior, posterior, equatorial posterior e centro.
Para encontrar o fotorreceptor central, é aquele associado à maioria dos processos dendríticos. Em seguida, atribua os pontos de referência para as camadas R8 e R7 usando a mesma técnica. Depois de definir cada conjunto de pontos de referência, exporte as coordenadas.
Selecione estatísticas, depois valores detalhados e específicos e posição. Em seguida, selecione exportar estatísticas na guia exibir para arquivo e salve as coordenadas como um arquivo CSV. Em seguida, abra os três arquivos CSV em um editor de planilhas.
Copie e cole as coordenadas dos 27 pontos de referência em um novo arquivo, seguindo a ordem de top, R8 e R7. Prossiga seguindo o protocolo de texto para corpo rígido e padronização de registro não linear TPS para a configuração ventral direita no cálculo das frequências dendríticas de ramificação e terminação. Em última análise, os dados são usados para fazer vários gráficos informativos. Usando o procedimento de imagem de visão dupla apresentado aqui, um cérebro de mosca contendo neurônios tm 20 esparsamente marcados foi fotografado em duas direções ortogonais.
A recombinação de imagem melhora a resolução axial. A imagem recombinada tem uma resolução melhor do que as imagens da vista horizontal e frontal. Após consulta a modelos 3D, traços dendríticos foram coletados de 15 tm 20 neurônios e comparados com traços dendríticos de 15 tm 2 neurônios.
As probabilidades de ramificação e terminação desses neurônios foram analisadas. Ambos os tipos foram semelhantes para segmentos de menos de 4 mícrons. A análise específica da camada de terminação dendrítica mostrou que os dois tipos de neurônios se distribuem de maneiras distintas específicas da camada.
Os dendritos Tm 2 recebem entradas em m2 e em m5. Enquanto tm 20 dendritos terminam na camada m1 a m3. A análise planar mostra que os dendritos tm 2 se projetam anteriormente, enquanto os dendritos tm 20 se projetam posteriormente.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como adquirir duas de suas imagens confocais. Leia suas marcas de estudo nos arquivos de imagem e extraia as propriedades dendríticas dessas imagens. Ao tentar este procedimento, é importante marcar a amostra corretamente antes da imagem confocal.
Como a combinação de imagens falhará se a amostra se mover durante a imagem.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para analisar o roteamento dendrítico de neurônios da medula de Drosophila adultos em colunas e camadas. Ele utiliza técnicas de imagem de dupla visão e ferramentas computacionais para melhorar a qualidade da imagem e analisar estruturas dendríticas no espaço tridimensional.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neuroanatomia
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- A rotação dendrítica é fundamental para compreender a circuitaria cerebral.
- A caracterização dos padrões dendríticos auxilia na determinação dos tipos celulares.
- A identificação de mutantes pode fornecer informações sobre a função neural.
- A análise tridimensional melhora a compreensão da lógica de conexão dendrítica.
Objetivo do Estudo
- Analisar o roteamento dendrítico em neurônios da medula de Drosophila.
- Caracterizar padrões dendríticos e determinar os tipos celulares.
- Identificar mutantes que afetam a morfologia dendrítica.
Métodos Utilizados
- Adquira duas pilhas de imagens de neurônios em orientações ortogonais.
- Marque cérebros de moscas dissecados com anticorpos específicos.
- Rotule anticorpos primários com anticorpos secundários fluorescentes.
- Limpe o cérebro usando glicerol e PBS para aquisição de imagens.
Resultados Principais
- Técnicas de imagem aprimoradas aumentam a análise da estrutura dendrítica.
- O mapeamento 3D revela a fiação intricada dos dendritos.
- É realizada a caracterização de tipos celulares com base na morfologia.
- A identificação de mutantes fornece insights sobre o desenvolvimento neural.
Conclusões
- Este método avança significativamente a compreensão da roteirização dendrítica.
- Facilita o mapeamento da circuitaria cerebral em Drosophila.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para aplicações mais amplas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a análise tridimensional de alta resolução da arquitetura dendrítica em circuitos neurais definidos, apoiando a validação de alvos em neurofarmacologia por meio da associação de fenótipos estruturais a perturbações genéticas. Ao quantificar a terminação específica por camada e a projeção planar dos arbóritos dendríticos, fornece uma redução mecanicista de riscos para a descoberta de fármacos para o SNC, aumentando a confiança preditiva em modelos de circuitos neuronais. O fluxo de trabalho facilita a identificação de defeitos específicos ao tipo celular, auxiliando no alinhamento de biomarcadores translacionais e no refinamento de modelos pré-clínicos para indicações neuropsiquiátricas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da correlação entre a morfologia dendrítica e manipulações genéticas ou farmacológicas em subtipos neuronais definidos.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos mediante avaliação quantitativa das frequências de ramificação e terminação dendrítica como indicadores funcionais.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao estabelecer relações entre estrutura e função em circuitos de neurônios da medula relevantes para vias neurodesenvolvimentais conservadas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera traçados dendríticos tridimensionais padronizados e reprodutíveis, registrados em um quadro referencial columnar, para pontuação morfológica consistente.
- Saída Quantitativa: Fornece frequências de terminação específicas por camada e métricas de projeção planar, permitindo análise de alto conteúdo do padrão dendrítico.
- Utilidade da Plataforma: Utiliza as caixas de ferramentas de código aberto MIPAV e MATLAB, apoiando escalabilidade e reprodutibilidade entre laboratórios em campanhas de triagem voltadas para neuroanatomia.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para a Doença: Mapeia defeitos dendríticos em camadas específicas (por exemplo, m1–m3 para tm20 versus m2/m5 para tm2), permitindo o alinhamento com biomarcadores traducionais de disfunção de circuito.
- Continuidade Pré-clínica: Fornece um sistema relevante para a doença para avaliar mutantes genéticos que afetam a conexão neuronal, apoiando decisões de avanço com ajuste de risco.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece defeitos na lógica de conexão em modelos de neurodesenvolvimento, reduzindo ambiguidades em estudos de engajamento de alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao converter dados de imagem em características dendríticas quantificáveis que orientam as etapas de identificação de compostos promissores e validação pré-clínica.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses por meio do rastreamento dendrítico tridimensional e análise específica por camadas para esclarecer a identidade neuronal e a lógica dos circuitos.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio do registro baseado em referência e rastreamento automatizado de arborizações dendríticas em diferentes contextos genéticos.
- Análises: Obtém frequências de ramificação e terminação como parâmetros quantitativos para comparação de condições em análises de mutantes versus tipo selvagem.
- Pesquisa Translacional: Relaciona preferências por camadas dendríticas com possíveis homólogos na córtex de vertebrados, apoiando a continuidade translacional entre espécies.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho de imagem e análise reutilizável para fenotipagem sistemática de mutantes neuronais em programas de descobrimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na fenotipagem neuronal ao fornecer dados de arquitetura dendrítica com resolução espacial.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da recombinação de imagens com dupla visão e atribuição padronizada de pontos de referência ao longo das camadas.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguir/não prosseguir ao permitir a estratificação objetiva de subtipos neuronais com base na morfologia.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de alvos com base na fidelidade estrutural de modelos dendríticos em sistemas relevantes para doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal, registro de imagens 3D e análise de morfologia neuronal.
- Depende de objetivas de alta abertura numérica (NA), detectores GaAsP e plataformas computacionais compatíveis com rastreamento baseado em MIPAV e MATLAB.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos consistentes de coloração, clareamento e aquisição de imagens em diferentes laboratórios.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir modificações nas estruturas de referência e nas definições de camadas.
- As limitações práticas incluem perda de sinal em tecidos profundos e sensibilidade ao movimento da amostra durante a aquisição com dupla visão.
