Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

O objetivo geral deste experimento é fazer um dispositivo microfluídico especializado e usá-lo para medir a vida útil e os fenótipos celulares de uma única célula de levedura. Este método pode ajudar a responder a algumas das principais questões no campo do envelhecimento por leveduras, como por que as células-mãe envelhecem e morrem e quais são os eventos moleculares anteriores que impulsionam a perda da homeostase celular e, eventualmente, o envelhecimento e a morte celular? A principal vantagem dessa técnica é que podemos rastrear células-mãe, rastrear sua vida útil e os vários marcadores moleculares ao mesmo tempo, para que possamos procurar eventos moleculares que se correlacionem com a vida útil.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o envelhecimento da levedura, ele também pode ser aplicado a outras áreas, como o monitoramento de respostas secundárias à participação que requer verificação celular por muitas gerações. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a fabricação de dispositivos microfluídicos, o carregamento de células e a configuração do microscópio exigem muita prática para serem executados com sucesso. A demonstração prévia deste método é crítica, pois é difícil carregar adequadamente o dispositivo microfluídico com levedura.

Para começar, fabrique um molde de wafer de silício para o dispositivo usando técnicas padrão, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Coloque-o com o lado voltado para cima em uma placa de Petri de 15 centímetros. Prenda o molde na placa de Petri com fitas adesivas.

Em seguida, coloque um barco de pesagem limpo em uma balança e rasgue a balança. Despeje 50 gramas de base PDMS no barco de pesagem e, em seguida, adicione cinco gramas de agente de cura PDMS. Agite a base PDMS e o agente de cura com uma pipeta descartável.

Comece pela borda do barco de pesagem e mova-se lentamente para dentro. Mexa bem a mistura por alguns minutos até que pequenas bolhas se formem em toda a mistura. Despeje a mistura lentamente na placa de Petri, para cobrir completamente o molde de wafer de silício.

Em seguida, coloque a placa de Petri no vácuo por 10 minutos para remover todas as bolhas de ar da mistura PDMS. Se as bolhas permanecerem na superfície da mistura depois de removidas do vácuo, use uma pipeta para sopre-las. Em seguida, asse o dispositivo a 75 graus Celsius por duas horas.

Quando resfriado de volta à temperatura ambiente, corte cuidadosamente o PDMS ao redor do molde e, em seguida, descasque suavemente a camada de PDMS polimerizado do molde de wafer de silício, evitando qualquer dano à construção do molde de wafer. Coloque a camada PDMS na bancada com o lado do padrão voltado para cima. Corte cuidadosamente o cavaco individual com uma lâmina de barbear industrial de borda única, mantendo uma margem adequada da borda de cada cavaco para evitar danos à construção.

Com o lado do padrão voltado para cima, use uma caneta perfurada para fazer furos diretamente nos círculos de entrada e saída em cada lado dos canais. Verifique cada orifício inserindo a agulha da caneta perfurada novamente no orifício. Certifique-se de que a agulha possa sair do outro lado, indicando que não há bloqueios.

Em seguida, use a fita para limpar partículas de poeira e detritos da superfície superior. Repita esta etapa pelo menos três vezes e deixe um pedaço limpo de fita adesiva no PDMS para manter uma superfície livre de poeira. Em seguida, vire o dispositivo e repita este procedimento no local oposto do PDMS.

Deixe o último pedaço de fita deste lado também. Agora prepare uma superfície de vidro para a base do dispositivo. Selecione o pedaço de vidro de cobertura de 24 milímetros por 30 milímetros com uma espessura entre 13 e 17 milímetros.

Pulverize 70% de etanol no vidro e seque-o com removedor de poeira para esterilizar a superfície. Em seguida, transfira a lamínula e o PDMS para uma placa de plástico. Remova a fita adesiva do PDMS e coloque o lado do padrão voltado para cima na placa, sem entrar em contato com a superfície superior.

Em seguida, transfira a placa para uma câmara de plasma. Aplique um tratamento de plasma de oxigênio no PDMS e na lamínula para tornar as superfícies hidrofílicas. Em seguida, remova a placa da câmara de plasma e conecte cuidadosamente as superfícies tratadas com plasma do PDMS na lamínula.

Certifique-se de que não haja bolhas de ar entre o PDMS e a lamínula. Por fim, transfira o dispositivo para um forno e leve ao forno a 75 graus Celsius por pelo menos duas horas. Mergulhe os tubos de entrada e saída em solução de etanol a 70% um dia antes da preparação do chip PDMS.

No dia seguinte, encha uma seringa de cinco mililitros com água autoclavada e lave cada tubo colocando o tubo na seringa e lavando o tubo com água. Repita a etapa de lavagem pelo menos três vezes para remover o etanol residual. Em seguida, examine os canais PDMS sob um microscópio óptico.

Usando uma objetiva de 10 X, certifique-se de que as estruturas estejam consistentes e intactas. Estabilize o chip PDMS intacto na plataforma do microscópio usando fita adesiva. Prenda uma seringa de cinco mililitros carregada com água estéril a uma bomba de seringa e insira os tubos de entrada e saída correspondentes no dispositivo.

Defina a vazão para 750 microlitros por hora e enxágue o chip por cerca de 10 minutos. Observe os canais para garantir que todas as bolhas de ar sejam lavadas. Se alguma bolha permanecer após o enxágue de 10 minutos, ajuste manualmente a velocidade para eliminá-las.

Transfira um mililitro de uma amostra de levedura preparada para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue as amostras por cinco minutos a 3.000 vezes G.Remova a maior parte do sobrenadante de cada tubo e combine o restante para formar uma amostra de 5 mililitros. Com a amostra de levedura agora pronta, remova os tubos de entrada do chip PDMS. Inverta manualmente a bomba de seringa para sugar uma pequena bolha de ar com um a dois centímetros de comprimento, cada tubo de entrada e, em seguida, aspire as culturas de células.

Em seguida, insira o tubo de entrada de volta no chip PDMS e reinicie a bomba para carregar as células a uma velocidade de 750 microlitros por hora. Deixe a bomba da seringa ligada por 10 minutos e, em seguida, examine a progressão da carga celular ao microscópio. Um carregamento bem-sucedido prenderá as células sob mais de 60% do pilar de suspensão.

Para manter as células de levedura, troque a solução da seringa por uma solução nutricional e ajuste a velocidade para 400 microlitros por hora. O fenótipo de vida útil da levedura pode ser obtido contando o número de gemas produzidas por cada célula-mãe presa e estimando o estimador de Kaplan-Meier. Usando esse protocolo, o dispositivo freqüentemente captura células-filhas frescas que brotaram das células já presas.

Essas células então se transformam em células-mãe frescas que podem ser identificadas usando software de análise de imagem downstream. Essas células-mãe frescas fornecem uma medição de vida útil mais precisa. Neste experimento, a vida útil média das células-mãe frescas foi ligeiramente maior em cerca de duas gerações.

Além do número de brotos, o intervalo de tempo entre dois eventos sucessivos de brotamento pode ser extraído dos dados de imagem. A brotação diminui drasticamente no final de sua vida útil, indicando o estado insalubre dessas células envelhecidas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar um chip recém-feito para ajudar a evitar bolhas e aumentar a concentração celular para melhorar a eficiência do carregamento celular quando necessário.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do envelhecimento de leveduras explorarem as primeiras mudanças moleculares que são causais ao fenótipo do envelhecimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer este dispositivo microfluídico e como usá-lo para medir a vida útil e os fenótipos celulares em células individuais.