Name: Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a usar dispositivos microfluídicos para medir longevidade e fenótipos celulares em leveduras de brotamento individuais. Este método permite rastrear células-mãe e marcadores moleculares simultaneamente.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH Grant AG043080 e pela National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. Agradecemos a Lucas Waldburger pela revisão do manuscrito.

1. Silicon Wafer fabricação de moldes NOTA: O photomask é projetado com software AutoCAD e fabricado por uma empresa comercial. Este projeto contém três camadas de padrões diferentes ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Documento Suplementar 1</a> ). As alturas das primeira, segunda, e terceira camadas são cerca de 4 mm, 10? M e 50? M, respectivamente. O molde da bolacha de silício foi criado a partir da fotomáscara utilizando litografia macia 9, 10. <ol><li> Asse uma bolacha de silício a 200 ° C durante 10 minutos para evaporar o vapor de água. revestimento rotação fotorresistente negativo SU-8 sobre a bolacha de silício. NOTA: revestimento rotação SU-8 3005 a 5000 rpm durante 30 segundos para gerar a primeira camada, SU-8, 2010 a 3000 rpm durante 30 segundos para gerar a segunda camada, e SU-8 3025 a 2000 rpm durante 30 segundos para gerar o terceira camada. </li><li> Soft-cozer a bolacha revestido antes de tele transferência padrão. Alinhar e expor a hóstia no modo &quot;contato direto&quot; usando um alinhador de máscara. NOTA: Soft-coza a bolacha durante 2 min a 95 ° C para a primeira camada, 3 min a 95 ° C para a segunda camada, e 15 min a 95 ° C para a terceira camada. Utilizar a dose de exposição a 100 mJ / cm 2 para a primeira camada, de 130 mJ / cm 2 para a segunda camada, e de 200 mJ / cm 2 para a terceira camada. </li><li> Após a exposição, pós-assar o wafer e desenvolvê-lo usando SU-8 desenvolvedor. Seca-se a pastilha utilizando uma pistola de N 2 e difícil de cozedura da bolacha a 200 ° C durante 30 min. NOTA: O molde de bolacha de silício é fixo para cerca de 15 cm de diâmetro de plástico de Petri usando fita Scotch, com o lado do padrão virado para cima. Normalmente, colocamos várias estruturas de chips idênticos no mesmo molde, que permite que vários chips microfluídicos a ser fabricado, ao mesmo tempo. Cada molde pode ser reutilizado muitas vezes para fabricar chips de microfluidos. </li></ol> 2. Microfluidicfabricação de chips <ol><li> Coloque um barco com peso limpo em uma balança e tarar a balança. Pour 50 g de base de PDMS no barco pesar. </li><li> Adicionar 5 g de PDMS agente de cura para o barco de pesagem (w / w proporção de 1:10 para a base de PDMS). NOTA: Este volume é baseada em um diâmetro de 15 cm-placa de Petri com o molde. Ajustar a quantidade de reagente de se utilizar uma placa de Petri com um tamanho diferente. </li><li> Agita-se a base de PDMS e o agente de cura com uma pipeta descartável. Iniciar a partir da borda do barco de pesagem e mova lentamente para dentro. Agita-se vigorosamente durante vários minutos até formar pequenas bolhas por toda a mistura; mistura completa é essencial para PDMS polimerização. </li><li> Verter a mistura lentamente para a placa de Petri; a mistura deve cobrir completamente o molde de bolacha de silício. </li><li> Colocar a placa de Petri no vácuo durante 10 minutos para remover todas as bolhas de ar a partir da mistura de PDMS. Se as bolhas permanecem sobre a superfície da mistura, utilizar uma pipeta para fundi-los fora. </li><li> Incubar o silíciomolde bolacha com PDMS em uma estufa a 75 ° C durante cerca de 2 h. </li><li> Com cuidado, descascar a camada de PDMS polimerizados para fora do molde bolacha de silício, evitando qualquer dano para a construção do molde da bolacha. Alternativamente, cortar o PDMS directamente a partir do molde da bolacha de silício com uma margem mínima de 5 mm em torno do padrão utilizando uma lâmina de barbear industrial de ponta simples; suavemente descascar a camada de PDMS fora do molde bolacha. </li><li> Coloque a camada de PDMS no banco com o padrão lado virado para cima. Cuidadosamente cortar o chip indivíduo com uma lâmina de barbear industrial de ponta única, mantendo uma margem adequada a partir da borda de cada um único chip para evitar danos de construção. </li><li> Com o padrão lado virado para cima, utilizar uma caneta punção (ID de 0,75 mm) para fazer furos na vertical através das entrada e saída de círculos em cada lado dos canais. NOTA: Estes furos criar o caminho para o fluxo de meio. Portanto, é crucial para percorrer os círculos e socos todo o caminho através da camada de PDMS. Tenha certeza deremover as colunas de PDMS do furo. </li><li> Verificar todos os buracos perfurados através da inserção da agulha da caneta de novo perfurador para dentro do buraco. Certifique-se de que a agulha pode sair do outro lado, indicando que não há nenhum bloqueio. Aplique a fita para a superfície do padrão, em seguida, descasque delicadamente a fita para limpar as partículas de poeira. Repetir esta etapa, pelo menos, três vezes. Deixar um pedaço limpo de fita adesiva sobre os PDMS para manter a esterilização. </li><li> Repita este procedimento no lado oposto do PDMS e deixar o último pedaço de fita no bem. </li><li> Preparar um x 30 mm de vidro de cobertura 24 mm com uma espessura de 0.13-0.17 mm. Spray de etanol a 70% sobre o vidro e seco com removedor de poeira para esterilizar a superfície; Além disso, o vidro pode ser lavada com água esterilizada e secou-se com removedor de poeira. </li><li> Transferir o vidro de cobertura e PDMS a uma placa de plástico. Retire a fita adesiva do PDMS e coloque lado o padrão voltado para cima. Evite qualquer contato com a superfície do padrão durante a transferência. </li><li&gt; Colocar a placa de plástico na máquina de plasma. Aplicar o tratamento com plasma de oxigio para o PDMS e a tampa de vidro para tornar as superfícies hidrofílicas com os seguintes parâmetros operacionais: a exposição, 75 s; estabilização do gás, 20 cc / min; pressão, 200; e poder, 100 W. </li><li> Cuidadosamente colocar o PDMS para o vidro de cobertura, que liga ambas as superfícies hidrofílicas (as superfícies que enfrentam-se durante o tratamento por plasma). Certifique-se de que não existem bolhas de ar entre o PDMS e a tampa de vidro. </li><li> Incubar o chip PDMS em uma estufa a 75 ° C durante pelo menos 2 h. NOTA: microfluidos deficiente pode provocar fugas de líquido sobre o microscópio durante a experiência. Portanto, é importante para verificar a ligação entre o PDMS e a tampa de vidro, levantando ligeiramente o PDMS a partir das bordas com uma pinça. Suavemente levantar o PDMS não devem separar-lo a partir da tampa de vidro, indicando uma ligação bem sucedida. </li></ol> 3. Preparação para o Experimento <ol><li&gt; preparação Tube. <ol><li> Submergir os tubos de entrada e de saída em solução de etanol a 70% separadamente um dia antes da preparação chip de PDMS. </li><li> Encher uma seringa de 5 ml com água esterilizada para lavar os tubos. Lava-se cada tubo através da ligação do tubo da seringa e a lavagem do tubo com água. </li><li> Repetir o passo de lavagem, pelo menos, 3 vezes para limpar resíduo etanol. </li></ol></li><li> Examine os canais PDMS sob um microscópio óptico com uma objetiva de 10X para garantir que a estrutura é consistente e intacta. Estabilizar o chip PDMS para a plataforma microscópio usando fita adesiva. NOTA: Faça múltiplos chips ao mesmo tempo no passo 2 para garantir que não são chips de backup, especialmente se tornando o dispositivo pela primeira vez. </li><li> Encher uma seringa de 5 mL com água autoclavada. Fixar a seringa para uma bomba de seringa e inserir os tubos de entrada e de saída correspondentes. Definir a velocidade de lavagem de 750 mL / h para enxaguar o chip durante cerca de 10 min. As bolhas de ar nos canais de filialdeve ser lavado durante este período; Se existem bolhas restantes, ajustar manualmente a velocidade para eliminar as bolhas. </li><li> preparação de amostras de levedura. <ol><li> Transferir 1 ml de amostra de levedura preparada (DO600 0,6-0,8) em dois tubos de microcentrifugação de 1,5 mL e centrifuga-se durante 5 min a 3000 x g. </li><li> Remover a maior parte do sobrenadante de cada tubo e combinar o restante para formar uma amostra de 0,5 ml. </li></ol></li><li> Pause a bomba de seringa e remover os tubos de entrada a partir do chip PDMS. </li><li> reverter manualmente a bomba de seringa para aspirar uma pequena bolha de ar (1 a 2 cm de comprimento) em cada tubo de entrada. Passar para sugar a amostra de levedura; a bolha de ar irá mostrar o limite de amostra e indicar a quantidade de amostra foi tirada. NOTA: Evite sugar a amostra para dentro da seringa. </li><li> Inserir o tubo de entrada de volta para o chip de PDMS e reiniciar a bomba para carregar as células a uma velocidade de 750 mL / h. </li><li> Deixar a bomba de seringa em 10 minutos para an e examinar a progressão de células de carga sob o microscópio; uma carga bem sucedida, as células armadilha sob mais do que 60% de suspender pilar. </li><li> Mudar para a solução de nutrição e ajustar a velocidade de 400 mL / h para o cultivo de culas. </li><li> posições de observação selecionar para o microscópio. NOTA: Para medições de tempo de vida, uma vez que as imagens foram tiradas a cada 15 minutos por um microscópio óptico com uma objectiva 40x. Para a análise repórter fluorescente, imagens foram tiradas a cada 15 min por um microscópio de fluorescência com um objetivo óleo de 60X. </li></ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
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<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O dispositivo PDMS precisa ser feitos na hora. De outro modo, as bolhas de ar causadas pela inserção de tubos para o dispositivo irá ser difícil de remover. Etapa 3.4 é importante para melhorar a eficiência de carregamento de células por concentração das células. Para aumentar o rendimento da experiência, de 4 a 6 módulos no mesmo chip PDMS ligado a bombas que operam independentemente são normalmente utilizados para efectuar 4 a 6 experiências diferentes (diferentes estirpes ou composições de meio) simultaneamente. ...

Brotamento levedura é um poderoso organismo modelo na pesquisa de envelhecimento. No entanto, num ensaio de tempo de vida convencional em leveduras depende de microdissecação, que não só é de trabalho intensivo, mas também baixa taxa de transferência 1, 2. Além disso, a abordagem tradicional microdissecação não fornece uma vista detalhada de várias características celulares e moleculares nas células-mãe individuais à medida que envelhecem. O desenvolvimento de dispositivos de microfluidos tem possibilitado um procedimento automatizado para medir o tempo de vida de levedura, bem como para seguir marcadores moleculares e vários fenótipos celulares ao longo do tempo de vida das células-mãe de 3, 4, 5, 6, 7, 8. Após as células de levedura são carregados para um dispositivo de microfluidos, que pode ser rastreado sob um microscópio usando tempos voltas automáticase de imagem. Com a ajuda de ferramentas de processamento de imagem latente, vários fenótipos celulares e moleculares podem ser extraídos 3, 6, 8, incluindo o tempo de vida, tamanho, repórter fluorescente, a morfologia celular, a dinâmica do ciclo celular, etc, muitos dos quais são difíceis ou impossíveis de obter usando o método tradicional microdissecação. Dispositivos microfluídicos ganharam destaque na pesquisa do envelhecimento levedura desde o seu desenvolvimento bem sucedido de alguns anos atrás 3, 4, 6, 7. Vários grupos posteriormente publicado em variações dos projetos anteriores 5, e muitos laboratórios levedura empregaram dispositivos microfluídicos para o seu estudo. Em uma cultura de células em crescimento exponencial, o número de células mãe com idades que estão disponíveis para a observação é miniscule. Portanto, o princípio de design geral do dispositivo microfluídico para medições de tempo de vida é para reter células-mãe e remover células filhas. Um desses desenhos faz uso do fato de que o fermento sofre divisão celular assimétrica. As estruturas em células-mãe a armadilha dispositivo vontade maiores e permitem que as células filhas mais pequenas a serem lavados. O chip de microfluidos descrito neste artigo utiliza uma almofada macia polidimetilsiloxano (PDMS) (colunas verticais Pensile) para células-mãe armadilha (Figura 1). Dispositivos de desenho semelhante têm sido relatados anteriormente 3, 4, 6, 7. Este protocolo utiliza um processo mais simples para fabricar dispositivos microfluidicos e um método de célula de carga simples que é optimizado para as experiências de imagiologia de intervalo de tempo. Um dos parâmetros chave no dispositivo de microfluidos é a largura das pastilhas de PDMS usados ​​para células mãe armadilha. nossa dispositivo usa almofadas mais amplas que podem manter mais células-mãe em cada bloco, incluindo uma fração significativa de células-mãe frescas que podem ser rastreados ao longo da sua vida útil. Para além das medições vida útil, este protocolo é útil para experiências de imagiologia única célula de intervalo de tempo quando as células necessitam de ser rastreados por muitas gerações ou quando uma observação ao longo de todo o tempo de vida é necessário.

<table><tbody><tr><td>3 '' < 111> wafer de silício</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 e 3000 Series</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&reg; 184 Kit de Elastômero de Silicone</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Inclui base de elastômero de silicone Sylgard&reg; e agente de cura</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&trade; punch (I.D. 0.75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&reg; vidro de cobertura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Fita Adesiva</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Lâminas de Barbear</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Puro, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>Seringa BD de 5 mL (Luer-Lock&trade; Dica)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de Parede Padrão PTFE (100 pés, Tamanho AWG: 22, ID Nominal: 0.028)</td><td>Variedade</td> de Agulhas <td>SWTT-22</td><td></td></tr> da <tr><td></td> Component Supply Company <td>Dessecador de Laboratório NEKIT-1</td><td></td>da <td>Component Supply Company</td></tr><tr><td></td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Nikon TE2000 com objetiva de 40X e 60X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 com objetiva de 40X e 60X</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

usando dispositivos microfluídicos medir longevidade e celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um importante organismo modelo na pesquisa do envelhecimento. Estudos genéticos revelaram muitos genes com efeitos conservados na expectativa de vida entre as espécies. No entanto, as causas moleculares do envelhecimento e da morte permanecem indefinidas. Para obter uma compreensão sistemática dos mecanismos moleculares subjacentes ao envelhecimento da levedura, precisamos de métodos de alto rendimento para medir a vida útil e quantificar vários fenótipos celulares e moleculares em células individuais. Anteriormente, desenvolvemos dispositivos microfluídicos para rastrear células-mãe de levedura em brotamento ao longo de sua vida útil, enquanto eliminamos as células-filhas recém-nascidas. Este artigo apresenta um método para preparar chips microfluídicos e para estabelecer experimentos microfluídicos. Vários canais podem ser usados para rastrear simultaneamente células sob diferentes condições ou de diferentes cepas de levedura. Uma configuração típica pode rastrear centenas de células por canal e permitir imagens microscópicas de alta resolução durante toda a vida útil das células. Nosso método também permite a caracterização detalhada da vida útil, marcadores moleculares, morfologia celular e dinâmica do ciclo celular de células individuais. Além disso, nosso dispositivo microfluídico é capaz de capturar uma quantidade significativa de células-mãe frescas que podem ser identificadas pela análise de imagem a jusante, tornando possível medir a vida útil com maior precisão.

Após as experiências, os tempos de vida das células e muitas fenótipos celulares e moleculares podem ser extraídos a partir das imagens de lapso de tempo gravado. Uma vez que há um certo número de características diferentes que podem ser extraídos a partir de cada uma das células, o primeiro passo da análise é de anotar as células e eventos, incluindo as posições e os limites das células e do calendário de vários acontecimentos que estão a ser rastreado, tal como os eventos de brotamento...

Este artigo apresenta um protocolo optimizado para a produção de batatas fritas de microfluidos e a configuração de experiências de microfluidos para medir o tempo de vida e fenótipos celulares de células de levedura individuais.

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

O objetivo geral deste experimento é fabricar um dispositivo microfluídico especializado e utilizá-lo para medir a longevidade e os fenótipos celulares de uma única célula de levedura. Este método pode ajudar a responder algumas das principais questões no campo do envelhecimento de leveduras, como por que as células-mãe envelhecem e morrem e quais são os eventos moleculares iniciais que levam à perda da homeostase celular e, eventualmente, ao envelhecimento e morte celular? A principal vantagem desta técnica é que podemos acompanhar as células-mãe, monitorar sua longevidade e diversos marcadores moleculares ao mesmo tempo, permitindo-nos identificar eventos moleculares que se correlacionam com a longevidade.Embora este método possa fornecer informações sobre o envelhecimento de leveduras, ele também pode ser aplicado a outras áreas, como o monitoramento de respostas secundárias à participação que exijam a verificação celular por muitas gerações. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois a fabricação de dispositivos microfluídicos, o carregamento celular e a configuração do microscópio exigem muita prática para serem realizados com sucesso. A demonstração prévia deste método é essencial, pois é difícil carregar adequadamente o dispositivo microfluídico com levedura.Para começar, fabrique um molde de wafer de silício para o dispositivo utilizando técnicas padrão conforme descrito no protocolo de texto complementar. Coloque-o com o lado dos recursos voltado para cima em uma placa de Petri de 15 centímetros. Fixe o molde na placa de Petri com fitas.Em seguida, coloque um barquinho de pesagem limpo sobre uma balança e tare a balança. Despeje 50 gramas da base de PDMS no barquinho de pesagem e então adicione cinco gramas do agente de cura de PDMS. Misture a base de PDMS e o agente de cura com uma pipeta descartável.Comece pela borda do barquinho de pesagem e mova-se lentamente em direção ao centro. Misture bem a mistura por vários minutos até que pequenas bolhas se formem por toda a mistura. Despeje lentamente a mistura na placa de Petri, de modo que cubra completamente o molde de wafer de silício.Em seguida, coloque a placa de Petri em vácuo por 10 minutos para remover todas as bolhas de ar da mistura de PDMS. Se bolhas permanecerem na superfície da mistura após a remoção do vácuo, utilize uma pipeta para eliminá-las. A seguir, aqueça o dispositivo a 75 graus Celsius por duas horas.Após resfriar novamente à temperatura ambiente, corte cuidadosamente o PDMS ao redor do molde e, em seguida, desprenda suavemente a camada de PDMS polimerizado do molde de silício, evitando qualquer dano à estrutura do molde. Coloque a camada de PDMS sobre a bancada com o lado do padrão voltado para cima. Corte cuidadosamente cada chip individual com uma lâmina de barbear industrial de borda única, mantendo uma margem adequada em relação à borda de cada chip para evitar danos à estrutura.Com o lado do padrão virado para cima, use uma furadeira para fazer furos diretamente para baixo através dos círculos de entrada e saída em cada lado dos canais. Verifique cada furo inserindo novamente a agulha da furadeira no furo. Certifique-se de que a agulha possa sair pelo outro lado, indicando que não há obstruções.Em seguida, use a fita para remover partículas de poeira e detritos da superfície superior. Repita este passo pelo menos três vezes e deixe um pedaço limpo de fita adesiva Scotch sobre o PDMS para manter uma superfície livre de poeira. Em seguida, vire o dispositivo e repita este procedimento no lado oposto do PDMS.Deixe o último pedaço de fita adesiva também neste lado. Agora, prepare uma superfície de vidro para a base do dispositivo. Selecione o pedaço de lamínula de 24 milímetros por 30 milímetros com uma espessura entre 13 e 17 milímetros.Pulverize etanol 70% sobre o vidro e seque-o com removedor de poeira para esterilizar a superfície. Em seguida, transfira o lamínula e o PDMS para uma placa de plástico. Remova a fita adesiva do PDMS e posicione o lado com o padrão voltado para cima na placa, sem tocar a superfície superior.Em seguida, transfira a placa para uma câmara de plasma. Aplique um tratamento com plasma de oxigênio ao PDMS e ao lamínula para tornar as superfícies hidrofílicas. Em seguida, remova a placa da câmara de plasma e conecte cuidadosamente as superfícies tratadas com plasma do PDMS ao lamínula.Certifique-se de que não haja bolhas de ar entre o PDMS e o vidro de cobertura. Por fim, transfira o dispositivo para um forno e aqueça a 75 graus Celsius por pelo menos duas horas. Mergulhe os tubos de entrada e saída em solução de etanol 70% um dia antes da preparação do chip de PDMS.No dia seguinte, encha uma seringa de cinco mililitros com água autoclavada e lave cada tubo colocando o tubo sobre a seringa e passando água através do tubo. Repita a etapa de lavagem pelo menos três vezes para remover o etanol residual. Em seguida, examine os canais de PDMS em um microscópio óptico.Utilizando uma objetiva de 10 X, certifique-se de que as estruturas estejam consistentes e intactas. Estabilize o chip de PDMS intacto na plataforma do microscópio usando fita adesiva Scotch. Prenda uma seringa de cinco mililitros carregada com água estéril a uma bomba de seringa e insira os tubos de entrada e saída correspondentes no dispositivo.Defina a taxa de fluxo em 750 microlitros por hora e lave o chip por cerca de 10 minutos. Observe os canais para garantir que todas as bolhas de ar sejam removidas. Se alguma bolha permanecer após a lavagem de 10 minutos, ajuste manualmente a velocidade para eliminá-las.Transfira um mililitro de uma amostra de levedura preparada para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue as amostras por cinco minutos a 3.000 × g. Remova a maior parte do sobrenadante de cada tubo e combine o restante para formar uma amostra de 5 mililitros. Com a amostra de levedura agora pronta, remova os tubos de entrada do chip de PDMS. Inverta manualmente a bomba de seringa para aspirar uma pequena bolha de ar de um a dois centímetros de comprimento em cada tubo de entrada e, em seguida, aspire os cultivos celulares.Em seguida, reinsira o tubo de entrada no chip de PDMS e reinicie a bomba para carregar as células a uma velocidade de 750 microlitros por hora. Mantenha a bomba de seringa ligada por 10 minutos e, então, examine o progresso do carregamento celular ao microscópio. Um carregamento bem-sucedido aprisionará as células sob mais de 60% dos pilares suspensos.Para manter as células de levedura, troque a solução na seringa por uma solução nutritiva e ajuste a velocidade para 400 microlitros por hora. O fenótipo de longevidade da levedura pode ser obtido contando o número de brotos produzidos por cada célula mãe aprisionada e estimando o estimador de Kaplan-Meier. Utilizando este protocolo, o dispositivo frequentemente aprisiona células filhas novas que brotaram das células já aprisionadas.Essas células tornam-se então novas células mães, que podem ser identificadas utilizando um software de análise de imagens posterior. Essas novas células mães fornecem uma medição de longevidade mais precisa. Neste experimento, a longevidade média das novas células mães foi ligeiramente maior, em cerca de duas gerações.Além do número de brotos, o intervalo de tempo entre dois eventos sucessivos de brotamento pode ser extraído dos dados de imagem. O brotamento desacelera drasticamente ao final do tempo de vida, indicando o estado não saudável dessas células envelhecidas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de usar um chip recém-preparado para ajudar a evitar bolhas e de aumentar a concentração celular, a fim de melhorar a eficiência de carregamento das células quando necessário.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área do envelhecimento em leveduras explorarem as alterações moleculares iniciais que são causais ao fenótipo de envelhecimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar este dispositivo microfluídico e como utilizá-lo para medir a longevidade e fenótipos celulares em células individuais.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Envelhecimento cronológico em levedura refere-se à perda de viabilidade celular associada ao tempo na fase estacionária. Aqui nós descrevemos um método de alto rendimento para determinar quantitativamente fermento esperança de vida cronológica.

Quantificar Yeast Life Span cronológica por conseqüência de células envelhecidas

Neste artigo apresentamos um protocolo geral para medir o tempo de vida replicativa das células-mãe do fermento.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Aqui nós descrevemos um conjunto de ensaios de mutação de DNA que podem ser combinados com o fermento modelo de extensão cronológica vida ao estudo dos genes / vias que regulam ou contribuir para a instabilidade do DNA genômico durante o envelhecimento.

Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica

Apresenta-se um método simples para a produção de dispositivos microfluídicos capazes de aplicar semelhantes condições dinâmicas de múltiplas linhagens distintas, sem a necessidade de uma sala de limpeza ou de litografia suave.

Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

Nós descrevemos aqui a operação de um dispositivo de microfluidos, que permite contínua e de elevada resolução de imagem microscópica de células de levedura de brotamento individuais durante a sua replicativo completo e / ou o tempo de vida cronológica.

Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Neste protocolo, é introduzida a fabricação, configuração e operação básica de um biorreator picoliter microfluídico (PLBR) para análise de célula única de microrganismos procarióticos. Microrganismos industrialmente relevantes foram analisados como prova de princípio, permitindo insights sobre taxa de crescimento, morfologia e heterogeneidade fenotípica ao longo de certos períodos de tempo, dificilmente possíveis com métodos convencionais.

Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

Apresentamos um método para quantificar fenótipos de crescimento de células de levedura individuais à medida que crescem em colônias em meios sólidos usando microscopia de lapso de tempo denominada, avaliação de dobramento de uma célula de Living Arrays of Yeast (ODELAY). A heterogeneidade da população de células geneticamente idênticas que crescem em colônias pode ser observada e quantificada diretamente.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.

Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

Aqui está um protocolo para identificar interações genéticas através de uma tela supressora de número de cópia aumentada em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite que os pesquisadores identifiquem, clonem e testem supressores em mutantes de levedura de curta duração. Testamos o efeito do aumento do número de cópias de SIR2 na vida útil em um mutante nulo autofagia.

Uma tela supressora para a caracterização de links genéticos regulando a vida cronológica em Saccharomyces cerevisiae

Aprenda a usar dispositivos microfluídicos para medir longevidade e fenótipos celulares em leveduras de brotamento individuais. Este método permite rastrear células-mãe e marcadores moleculares simultaneamente.

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

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