Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento
30 de março de 2017
Este artigo apresenta um protocolo optimizado para a produção de batatas fritas de microfluidos e a configuração de experiências de microfluidos para medir o tempo de vida e fenótipos celulares de células de levedura individuais.
O objetivo geral deste experimento é fabricar um dispositivo microfluídico especializado e utilizá-lo para medir a longevidade e os fenótipos celulares de uma única célula de levedura. Este método pode ajudar a responder algumas das principais questões no campo do envelhecimento de leveduras, como por que as células-mãe envelhecem e morrem e quais são os eventos moleculares iniciais que levam à perda da homeostase celular e, eventualmente, ao envelhecimento e morte celular? A principal vantagem desta técnica é que podemos acompanhar as células-mãe, monitorar sua longevidade e diversos marcadores moleculares ao mesmo tempo, permitindo-nos identificar eventos moleculares que se correlacionam com a longevidade.
Embora este método possa fornecer informações sobre o envelhecimento de leveduras, ele também pode ser aplicado a outras áreas, como o monitoramento de respostas secundárias à participação que exijam a verificação celular por muitas gerações. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois a fabricação de dispositivos microfluídicos, o carregamento celular e a configuração do microscópio exigem muita prática para serem realizados com sucesso. A demonstração prévia deste método é essencial, pois é difícil carregar adequadamente o dispositivo microfluídico com levedura.
Para começar, fabrique um molde de wafer de silício para o dispositivo utilizando técnicas padrão conforme descrito no protocolo de texto complementar. Coloque-o com o lado dos recursos voltado para cima em uma placa de Petri de 15 centímetros. Fixe o molde na placa de Petri com fitas.
Em seguida, coloque um barquinho de pesagem limpo sobre uma balança e tare a balança. Despeje 50 gramas da base de PDMS no barquinho de pesagem e então adicione cinco gramas do agente de cura de PDMS. Misture a base de PDMS e o agente de cura com uma pipeta descartável.
Comece pela borda do barquinho de pesagem e mova-se lentamente em direção ao centro. Misture bem a mistura por vários minutos até que pequenas bolhas se formem por toda a mistura. Despeje lentamente a mistura na placa de Petri, de modo que cubra completamente o molde de wafer de silício.
Em seguida, coloque a placa de Petri em vácuo por 10 minutos para remover todas as bolhas de ar da mistura de PDMS. Se bolhas permanecerem na superfície da mistura após a remoção do vácuo, utilize uma pipeta para eliminá-las. A seguir, aqueça o dispositivo a 75 graus Celsius por duas horas.
Após resfriar novamente à temperatura ambiente, corte cuidadosamente o PDMS ao redor do molde e, em seguida, desprenda suavemente a camada de PDMS polimerizado do molde de silício, evitando qualquer dano à estrutura do molde. Coloque a camada de PDMS sobre a bancada com o lado do padrão voltado para cima. Corte cuidadosamente cada chip individual com uma lâmina de barbear industrial de borda única, mantendo uma margem adequada em relação à borda de cada chip para evitar danos à estrutura.
Com o lado do padrão virado para cima, use uma furadeira para fazer furos diretamente para baixo através dos círculos de entrada e saída em cada lado dos canais. Verifique cada furo inserindo novamente a agulha da furadeira no furo. Certifique-se de que a agulha possa sair pelo outro lado, indicando que não há obstruções.
Em seguida, use a fita para remover partículas de poeira e detritos da superfície superior. Repita este passo pelo menos três vezes e deixe um pedaço limpo de fita adesiva Scotch sobre o PDMS para manter uma superfície livre de poeira. Em seguida, vire o dispositivo e repita este procedimento no lado oposto do PDMS.
Deixe o último pedaço de fita adesiva também neste lado. Agora, prepare uma superfície de vidro para a base do dispositivo. Selecione o pedaço de lamínula de 24 milímetros por 30 milímetros com uma espessura entre 13 e 17 milímetros.
Pulverize etanol 70% sobre o vidro e seque-o com removedor de poeira para esterilizar a superfície. Em seguida, transfira o lamínula e o PDMS para uma placa de plástico. Remova a fita adesiva do PDMS e posicione o lado com o padrão voltado para cima na placa, sem tocar a superfície superior.
Em seguida, transfira a placa para uma câmara de plasma. Aplique um tratamento com plasma de oxigênio ao PDMS e ao lamínula para tornar as superfícies hidrofílicas. Em seguida, remova a placa da câmara de plasma e conecte cuidadosamente as superfícies tratadas com plasma do PDMS ao lamínula.
Certifique-se de que não haja bolhas de ar entre o PDMS e o vidro de cobertura. Por fim, transfira o dispositivo para um forno e aqueça a 75 graus Celsius por pelo menos duas horas. Mergulhe os tubos de entrada e saída em solução de etanol 70% um dia antes da preparação do chip de PDMS.
No dia seguinte, encha uma seringa de cinco mililitros com água autoclavada e lave cada tubo colocando o tubo sobre a seringa e passando água através do tubo. Repita a etapa de lavagem pelo menos três vezes para remover o etanol residual. Em seguida, examine os canais de PDMS em um microscópio óptico.
Utilizando uma objetiva de 10 X, certifique-se de que as estruturas estejam consistentes e intactas. Estabilize o chip de PDMS intacto na plataforma do microscópio usando fita adesiva Scotch. Prenda uma seringa de cinco mililitros carregada com água estéril a uma bomba de seringa e insira os tubos de entrada e saída correspondentes no dispositivo.
Defina a taxa de fluxo em 750 microlitros por hora e lave o chip por cerca de 10 minutos. Observe os canais para garantir que todas as bolhas de ar sejam removidas. Se alguma bolha permanecer após a lavagem de 10 minutos, ajuste manualmente a velocidade para eliminá-las.
Transfira um mililitro de uma amostra de levedura preparada para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue as amostras por cinco minutos a 3.000 × g. Remova a maior parte do sobrenadante de cada tubo e combine o restante para formar uma amostra de 5 mililitros. Com a amostra de levedura agora pronta, remova os tubos de entrada do chip de PDMS. Inverta manualmente a bomba de seringa para aspirar uma pequena bolha de ar de um a dois centímetros de comprimento em cada tubo de entrada e, em seguida, aspire os cultivos celulares.
Em seguida, reinsira o tubo de entrada no chip de PDMS e reinicie a bomba para carregar as células a uma velocidade de 750 microlitros por hora. Mantenha a bomba de seringa ligada por 10 minutos e, então, examine o progresso do carregamento celular ao microscópio. Um carregamento bem-sucedido aprisionará as células sob mais de 60% dos pilares suspensos.
Para manter as células de levedura, troque a solução na seringa por uma solução nutritiva e ajuste a velocidade para 400 microlitros por hora. O fenótipo de longevidade da levedura pode ser obtido contando o número de brotos produzidos por cada célula mãe aprisionada e estimando o estimador de Kaplan-Meier. Utilizando este protocolo, o dispositivo frequentemente aprisiona células filhas novas que brotaram das células já aprisionadas.
Essas células tornam-se então novas células mães, que podem ser identificadas utilizando um software de análise de imagens posterior. Essas novas células mães fornecem uma medição de longevidade mais precisa. Neste experimento, a longevidade média das novas células mães foi ligeiramente maior, em cerca de duas gerações.
Além do número de brotos, o intervalo de tempo entre dois eventos sucessivos de brotamento pode ser extraído dos dados de imagem. O brotamento desacelera drasticamente ao final do tempo de vida, indicando o estado não saudável dessas células envelhecidas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de usar um chip recém-preparado para ajudar a evitar bolhas e de aumentar a concentração celular, a fim de melhorar a eficiência de carregamento das células quando necessário.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área do envelhecimento em leveduras explorarem as alterações moleculares iniciais que são causais ao fenótipo de envelhecimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar este dispositivo microfluídico e como utilizá-lo para medir a longevidade e fenótipos celulares em células individuais.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a criação de dispositivos microfluídicos especializados destinados a medir a longevidade e os fenótipos celulares de células individuais de levedura. Este método tem como objetivo abordar questões fundamentais no campo do envelhecimento de leveduras, particularmente relacionadas aos processos de envelhecimento das células mães.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microfluídica
- Biologia celular
- Envelhecimento de leveduras
Antecedentes
- Dispositivos microfluídicos permitem o controle preciso do ambiente celular.
- O entendimento do envelhecimento em leveduras pode fornecer insights sobre processos mais amplos de envelhecimento biológico.
- O rastreamento de células mães e seus marcadores moleculares é crucial para esta pesquisa.
- A carga adequada de leveduras em dispositivos microfluídicos é desafiadora e requer prática.
Objetivo do Estudo
- Medir a longevidade de células individuais de levedura.
- Investigar os eventos moleculares que levam ao envelhecimento celular.
- Correlacionar a longevidade com diversos marcadores moleculares.
Métodos Utilizados
- Fabricação de dispositivos microfluídicos.
- Carregamento de células de levedura nos dispositivos.
- Configuração do microscópio para observação.
- Rastreamento de fenótipos celulares e longevidade.
Resultados Principais
- Acompanhamento bem-sucedido de células-mãe e seus tempos de vida.
- Identificação de marcadores moleculares associados ao envelhecimento.
- Conhecimentos sobre o processo de envelhecimento de células de levedura.
- Aplicações potenciais em outras áreas da pesquisa celular.
Conclusões
- O método microfluídico fornece informações valiosas sobre o envelhecimento de leveduras.
- Os desafios na fabricação do dispositivo e no carregamento celular podem ser superados com prática.
- Essa técnica pode ser aplicável a outras áreas de pesquisa que exigem observação celular de longo prazo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa abordagem microfluídica permite o rastreamento longitudinal com alta resolução das dinâmicas de envelhecimento em nível de célula única, fornecendo insights mecanicistas sobre a perda de homeostase celular que podem orientar a validação de alvos em vias relacionadas ao envelhecimento. Ao correlacionar marcadores moleculares com resultados de longevidade em um microambiente controlado, o método oferece confiança preditiva em testes de hipóteses em estágios iniciais para mecanismos de longevidade conservados. Sua escalabilidade entre cepas e condições o posiciona como uma plataforma de descoberta reutilizável para reduzir riscos em alvos terapêuticos de doenças associadas à idade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao vincular eventos moleculares a fenótipos funcionais de envelhecimento em células individuais.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da correlação em tempo real de biomarcadores com trajetórias de longevidade.
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao identificar fatores moleculares conservados que impulsionam o envelhecimento em diferentes origens genéticas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos padronizados e reprodutíveis para triagem fenotípica quantitativa em múltiplos canais.
- Valor Operacional: Fornece imagens de alta resolução e leituras de frequência de brotamento que permitem avaliação confiável dos efeitos de compostos.
- Valor Científico: Facilita a escalabilidade do ensaio ao aprisionar centenas de células por canal para análise longitudinal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece insights relevantes sobre o sistema da doença ao caracterizar a dinâmica do envelhecimento celular com resolução em nível de única célula.
- Valor Operacional: Garante continuidade translacional desde a descoberta até a medição padronizada da longevidade e do fenótipo.
- Valor Científico: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao distinguir eventos moleculares causais de alterações correlacionadas no envelhecimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho iniciais de descoberta ao permitir pesquisas sobre envelhecimento orientadas por hipóteses, que orientam a identificação de compostos promissores por meio do ancoramento fenotípico de alvos moleculares.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias ao acompanhar marcadores moleculares em tempo real juntamente com a longevidade replicativa em células mães.
- Triagem: Fornece saídas fenotípicas quantitativas e resolvidas no tempo, como intervalos de brotamento e alterações na morfologia, para triagem de compostos.
- Análises: Gera estimativas de sobrevida tipo Kaplan-Meier e dados de linhagem em nível de célula única para permitir análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer fenótipos conservados de envelhecimento que podem ser transladados para modelos de eucariotos superiores.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma modular adaptável a múltiplas linhagens de levedura e condições ambientais para uso repetido.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir ambiguidades na associação de marcadores moleculares aos resultados do envelhecimento.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de fabricação de dispositivos e carregamento celular.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper ao permitir a detecção precoce de intervenções ineficazes nas vias de envelhecimento.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar alvos com forte validação fenotípica em modelos de envelhecimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na fabricação de dispositivos microfluídicos e no manuseio estéril de biomoléculas.
- Depende do acesso a sistemas de tratamento de plasma, bombas de seringa e configurações de microscopia de fluorescência.
- Necessita padronização entre equipes para preparo consistente dos chips e manuseio de cepas de levedura.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a sistemas modelo não baseados em levedura, devido às diferenças no tamanho celular e adesão.
- Limitado pela necessidade de remoção cuidadosa de bolhas e limpeza de superfícies para garantir aprisionamento confiável de células e imagens adequadas.
