O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares

O objetivo geral deste ensaio de biossensor condutivo é detectar interações biomoleculares, usando a tecnologia híbrida beta-lactamase. Descrevemos um método para detectar interações antígeno de anticorpo, usando uma proteína beta-lactamase quimérica. O princípio deste método baseia-se na detecção de ligação medindo a liberação de prótons da atividade da beta-lactamase.

A principal vantagem desta técnica sobre um imunossensor convencional é o uso de uma beta-lactamase quimérica, faz ensaios sensoriais mais baratos e rápidos usando uma proteína híbrida para detectar os analitos Demonstrando o procedimento estará Mathieu Dondelinger, um pesquisador graduado. Comece este procedimento com a preparação da amostra e da solução de proteína, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare o eletrodo reutilizável mergulhando as pontas em poços de uma placa de 96 poços contendo 300 microlitros por poço de solução de preparação de eletrodo por dois minutos com mistura suave em temperatura ambiente.

Repita esta etapa três vezes. Em seguida, enxágue os eletrodos mergulhando as pontas em poços de uma placa de 96 poços contendo 300 microlitros por poço de água destilada por dois minutos com mistura suave em temperatura ambiente. Para regenerar os eletrodos, mergulhe as pontas em poços de uma placa de 96 poços contendo 300 microlitros por poço de solução de regeneração durante a noite a quatro graus Celsius ou uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, execute três lavagens dos eletrodos mergulhando as pontas em poços de placa de 96 poços contendo 300 microlitros por poço de solução salina tamponada com fosfato. Realize cada lavagem por dois minutos com mistura suave em temperatura ambiente. Cubra a lisozima de clara de ovo de galinha na superfície de polianilina do eletrodo, depositando uma gota de 15 microlitros de 40 microgramas por mililitro de HEWL preparado em tampão fosfato na superfície do eletrodo.

Incube o eletrodo por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, execute três lavagens dos eletrodos com tampão fosfato, mergulhando as partes dos eletrodos dos chips sensores em um poço de uma placa de 96 poços contendo 300 microlitros por poço de tampão fosfato. Realize cada lavagem por dois minutos com mistura suave em temperatura ambiente.

Sature os eletrodos adicionando uma gota de 30 microlitros da solução de bloqueio na superfície do eletrodo. Incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave três vezes como antes.

Diluir as soluções de BlaP-cAb-Lys3 ou BlaP a 20 microgramas por mililitro em tampão de ligação. Em seguida, aplique uma gota de 15 microlitros dessa solução diluída nos eletrodos. Incube os eletrodos por uma hora em temperatura ambiente.

Após a reação do nanocorpo do antígeno, lave os eletrodos três vezes com solução de lavagem. Em seguida, lave os eletrodos do sensor no tampão de detecção mergulhando os eletrodos em um poço de uma placa de 96 poços contendo 300 microlitros por poço de tampão de detecção. E incube brevemente por um minuto.

Para detecção, conecte o multímetro digital ao computador. Em seguida, conecte o chip do sensor ao multímetro digital por meio da parte do circuito de cobre. Inicie a resposta do sensor aplicando uma gota de 50 microlitros de solução de benzilpenicilina de quatro milimolares nos eletrodos marcados positivamente.

Aplique uma gota de 50 microlitros da solução de detecção nos eletrodos marcados com negativo para servir como controle negativo. Monitore os valores condutométricos com o multímetro digital conectado por 30 minutos. Visualize os dados em tempo real diretamente na tela ou exporte os dados digitais como um arquivo de texto.

Esses dados brutos podem ser plotados para criar uma saída gráfica que represente as medições das mudanças de condutividade entre os eletrodos de referência e de amostra em relação ao tempo. Para construir a proteína quimérica, a beta-lactamase classe A BlaP foi usada como proteína carreadora. Aqui, os resíduos catalíticos são apresentados em vermelho.

O local de inserção localizado em um loop exposto a solventes é indicado em amarelo. O fragmento de anticorpo camelídeo denominado cAb-Lys3 foi inserido em BlaP. A proteína quimérica resultante, BlaP-cAb-Lyse3, é capaz de se ligar ao HEWL enquanto a atividade da beta-lactamase é retida.

O HEWL foi imobilizado em um eletrodo codificado com polianilina antes de carregar o BlaP-cAb-Lys3. A liberação de prótons após a hidrólise da benzilpenicilina pela proteína quimérica imobilizada induz alterações de condutividade que podem ser interpretadas pelo usuário. Os sensores contêm oito chips organizados em quatro pares.

Cada chip inclui três eletrodos, um eletrodo de trabalho revestido de polianilina, um eletrodo de referência e um contra-eletrodo. Para cada par, o chip rotulado como negativo corresponde a um controle negativo, enquanto o chip rotulado como positivo corresponde à amostra testada. Aqui são mostradas as medições de condutância que mostram a interação específica de BlaP-cAb-Lys3 com HEWL.

As alterações de condutividade resultam da liberação de prótons induzida pela hidrólise de antibióticos pela beta-lactamase quimérica imobilizada. Nenhuma ligação pôde ser detectada para o controle negativo, beta-lactamase nativa BlaP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 1/2 dia se for executada corretamente e as condições experimentais forem otimizadas.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a inserção de um fragmento de anticorpo no BlaP é um desafio. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade dos dados gerados dependerá da funcionalidade da beta-lactamase quimérica. Seguindo esse procedimento, outros métodos que permitam a quantificação da interação detectada podem ser realizados para determinar a constante de associação de equilíbrio dessa interação.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biossensores imunológicos explorarem interações moleculares em várias amostras, desde organismos vivos até diferentes ambientes. As implicações desta técnica se estendem à detecção de inúmeras biomoléculas, uma vez que a tecnologia quimérica beta-lactamase é uma ferramenta versátil para funcionalizar qualquer anticorpo ou fragmento de proteína na rede elétrica. Portanto, pode ser usado para desenvolver ferramentas de diagnóstico baratas e rápidas em vários campos, como saúde humana e animal.