Name: Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a produzir nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos para avaliar propriedades antibacterianas. Este método permite controlar tamanho e composição sem subprodutos químicos perigosos.

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Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (NSF premia CMMI-0922946 a DB, CMMI-1300920 a DB e S.O&#39;M., E CMMI-1531789 a S.O&#39;M., DB e EAK) e um Busch Biomedical Research Grant para EAK e S.O&#39;M.

1. Focando o laser de nanosegundo e fluência de medição <ol><li> Montar o aparelho de ablação colocando uma barra de agitação magnética e um estágio de ablação porosa dentro de um copo de vidro de 50 mL. NOTA: O estágio de ablação consiste em uma plataforma de aço inoxidável de 3,81 cm de diâmetro e 1,6 mm de espessura com dez orifícios de 0,65 cm de diâmetro e seis orifícios de 0,50 cm de diâmetro perfurados no padrão ilustrado na Figura 1 . O objetivo desses buracos é permitir que o líquido se mova através do alvo para que as partículas não se acumulem imediatamente acima do alvo. A mistura insuficiente leva a interações deletérias entre o laser e as partículas já formadas. Além disso, três furos roscados # 29 (8-32) estão localizados perto do perímetro da plataforma para aceitar os parafusos que servem como pernas para elevar a plataforma e fornecer espaço para uma barra de agitação magnética ( Figura 1A ). <ol><li> Coloque o copo em um magnéticoAgite a placa e coloque a placa de agitação sobre uma fase de conversão xy para permitir o movimento do alvo durante a ablação ( Figura 1A ). </li></ol></li><li> Defina o laser Nd: YAG para operar no comprimento de onda fundamental de 1.064 nm, com uma duração de impulso de 5 ns e uma taxa de repetição de pulso de 10 Hz. Meça a energia por pulso com um medidor de energia e energia de laser. A energia necessária é 240-250 mJ. </li><li> Focalize o feixe abaixo do alvo no estágio de ablação usando uma lente convergente de comprimento focal de 250 mm (NA = 0,05). NOTA: O feixe de entrada possui um raio de 4.025 mm e é necessária uma altura da lente de 161 mm para atingir o tamanho do ponto desejado. O tamanho ideal do ponto é determinado empiricamente. Um tamanho de ponto maior é utilizado para reduzir o efeito da proteção por NPs presentes na solução. Isso é equilibrado com o fato de que aumentar o tamanho do ponto requer maior energia para manter fluência adequada. </li><li> Determine o tamanho do ponto, colocando um alvo de metal (veja a seçãoN 2) no palco e ablação com vários pulsos de laser. Veja o alvo ablado juntamente com um slide micrométrico em um microscópio de luz equipado com câmera CCD (objetivo 4X) para medir o tamanho do ponto ( Figura 1A ). NOTA: Para o aparelho aqui, o sistema de ablação produz um tamanho de ponto com uma área média de 5,51 mm 2 . O tamanho do ponto permanece nesta faixa para cada ablação. </li><li> Calcule a fluência dividindo a energia do pulso pela área do ponto. Para o aparelho aqui, a fluência é de 4,80 J / cm 2 . </li></ol> 2. Síntese de Nanopartículas de Prata por Ablação com Laser Pulsado em Líquido <ol><li> Pesar um alvo de prata plano usando uma microbalança para obter a massa de pré-ablação. </li><li> Aderir ao alvo prateado para o estágio poroso usando fita adesiva de carbono de dupla face. Adicione 40 mL de líquido de ablação ao copo ( Figura 1A ). A altura do líquido acima do alvo é de 11 mm. NOTA: ablação típica liqUids são soluções aquosas contendo SDS 60 mM ou PVP 2 mM para aumentar a monodispersão. </li><li> Sob constante agitação, mova o estágio xy motorizado controlado por computador em um padrão elíptico (dimensões: eixo principal = 2,09 cm, eixo menor = 0,956 cm, área = 1,57 cm 2 ) a uma velocidade de 0,42 cm / s e ablate o alvo Por 20-40 min. NOTA: A concentração de NPs aumenta com tempos de ablação mais longos. Certifique-se de que a agitação seja suficientemente vigorosa para manter a concentração NP uniforme ao longo da solução para minimizar os efeitos de proteção 7 . </li></ol> 3. Caracterizando Nanopartículas de Metal <ol><li> Recolher a solução de nanopartículas do copo por decantação. Confirme a presença de nanopartículas medindo seus espectros de luz visíveis UV (200-1,100 nm). NOTA: Os NPs têm uma absorção de pico no comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície (SPR). Para prata, o SPR é centrado a 400 nm. NP altamente concentradoAs soluções requerem diluição antes da medição do espectro UV-VIS para garantir que as leituras de absorvância permaneçam dentro da faixa linear do espectrofotômetro. </li><li> Medir o diâmetro hidrodinâmico dos NP por dispersão de luz dinâmica (DLS) utilizando um método de análise de distribuição de números 29 . <ol><li> Diluir a solução NP 1:40 na solução de ablação e pipetar 1 mL em uma cubeta de plástico de 1 cm. Utilizando um ângulo de medição de 180 ° , mede a dispersão da luz a um comprimento de onda de 633 nm para determinar o diâmetro NP de acordo com a equação de Stokes-Einstein: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/55416/55416eq1.jpg" /> Onde d é o raio hidrodinâmico, k é constante de Boltzmann, T é temperatura absoluta, η é viscosidade e coeficiente de difusão D ou velocidade do movimento browniano. </li></ol></li><li> Confirmar o tamanho e a forma de NP usando o microfone eletrônico de transmissãoEscopy (TEM) 30 . NOTA: O diâmetro hidrodinâmico medido usando DLS é maior do que o tamanho medido usando TEM devido à camada de solvente que envolve os NPs. <ol><li> Diluir a solução NP 1:40 em água duplamente destilada para remover qualquer excesso de aditivos ( por exemplo, SDS ou PVP) que possam interferir com a imagem. Largue 2 μL da solução em uma grade TEM de cobre pré-revestida com película de carbono lacei / fina (comercialmente disponível, veja a Lista de materiais) e seca durante a noite à temperatura ambiente sob vácuo em um dessecador. </li><li> Imagem dos NP para avaliar o tamanho e a forma, conforme descrito na referência 30 . </li></ol></li><li> Para calcular a concentração de NP, desalojar quaisquer NPs ligeiramente ligados do alvo de metal ablado (etapa 2.3) colocando o alvo em um banho de água sonicante contendo água destilada durante 1 min. <ol><li> Secar o alvo sob uma corrente de ar comprimido durante 1 min. Meça a massa da taRget em uma microbalança. Quantifique a massa de NPs em solução como a diferença de peso antes e depois da ablação, o que é assumido como resultado da ejeção de nanopartículas metálicas na solução. </li></ol></li></ol> 4. Pós-irradiação <ol><li> Diluir os NPs para uma concentração máxima de 100 μg / mL na mesma solução de ablação usada em 2.2. Este limite de concentração é fundamental para garantir uma irradiação uniforme. </li><li> Transferir 15-17 mL das NP diluídas para uma cuvete de quartzo contendo uma barra de agitação ( Figura 1B ). Coloque a cuvete em uma placa de agitação magnética alinhada paralelamente com o laser de entrada. </li><li> Use um sistema laser Nd: YAG para produzir pulsos a laser de 25 ps 532 nm e uma lente de comprimento focal de 75 mm para focalizar o laser no centro da solução. Irradiate a solução por 30 minutos a várias horas, dependendo do tamanho desejado. NOTA: A energia total entregue depende da concentração da solução e tDe irradiação e pode variar de 0,5 mJ a 3,5 mJ. Para o aparelho aqui, 30 min de pós-irradiação de uma amostra transparente e de baixa concentração (&lt;50 μg / mL) produz NPs de prata com um diâmetro de 10 nm. </li></ol> 5. Medindo as Propriedades Antibacterianas das Nanopartículas NOTA: A toxicidade de NPs de prata contra ambos os Gram- positivos ( Bacillus subtilis ) e Gram- negativos ( Escherichia coli ) foi testada 31 . O método é facilmente adaptado a qualquer espécie; No entanto, a dose eficaz de nanopartículas pode variar consideravelmente e deve ser determinada empiricamente. Aqui, E. coli é usado como o sistema modelo para a descrição do método. <ol><li> Cultivar culturas de E. coli (estirpe MG1655) durante a noite a 37 ° C em Luria Broth (LB) contendo 10 g / L de triptona de Bacto, 5 g / L de extracto de levedura e 10 g / L de cloreto de sódio. Diluir as culturas durante a noite para uma densidade óptica (λ = 600Nm) de 0,01 em LB fresco. </li><li> Se os NPs foram sintetizados em meios de ablação contendo aditivos ( por exemplo, SDS ou PVP), adicione o respectivo produto químico ao LB de tal forma que a concentração permaneça constante ao adicionar os NPs. NOTA: Por exemplo, em uma experiência típica, um alvo de prata é ablado em uma solução de SDS 60 mM para produzir uma solução de NP de 100 ug / mL. Se a concentração final de NPs nos meios de cultura for de 10 μg / mL, prepare LB contendo SDS 6 mM ( ou seja, 1/10 da concentração de SDS no líquido de ablação). Não há efeito negativo sobre o crescimento da bactéria ao usar essas concentrações. Isso é mostrado no controle -AgNP na Figura 3 . </li><li> Adicione os NPs às culturas diluídas em concentrações variando entre 0-50 μg / mL e cultivar as culturas com agitação a 37 ° C durante 2 h adicionais. Como um controle positivo para a toxicidade, tratar E. coli com um antibiótico ( por exemplo, 30 μg / mL de kanamYcin). </li><li> Após as 2 h de incubação, diluir em série as amostras de cultura 1:10 em LB fresco e detectar 10 μL de gotas de cada diluição em placas de agar LB. Tipicamente, 10 4 -10 diluições de 8 vezes são suficientes para ver colônias individuais. </li><li> Uma vez que as gotículas foram absorvidas, incubar as placas durante a noite a 37 ° C e contar as unidades formadoras de colônias (cfu) na manhã seguinte. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os efeitos antimicrobianos reproduzíveis das NPs requerem produção consistente de NP com tamanhos e concentrações semelhantes. Portanto, é fundamental padronizar os parâmetros do laser, incluindo fluência, comprimento de onda e duração do pulso. Embora a dispersão de luz dinâmica seja um método fácil e rápido para estimar o tamanho de NP, a quantificação precisa da distribuição de tamanho requer medição direta por TEM. Como cada raio laser tem características distintas em termos de perfil de modo e divergência, é fundam...

As nanopartículas (NPs) são geralmente definidas como partículas que têm pelo menos uma dimensão com menos de 100 nm de comprimento. Os métodos tradicionais de síntese NP química geralmente requerem agentes redutores perigosos, como boroidridos e hidrazinas. Em contraste, a ablação a laser de alvos de metal sólido imersos em um meio líquido (ablação a laser pulsada em líquidos - PLAL) fornece uma rota ecológica para a síntese NP que satisfaz todos os 12 dos Princípios da Química Verde 1 , 2 . Em PLAL, um alvo de metal submerso é irradiado por pulsos de laser repetidos. À medida que o laser abla o alvo, uma pluma densa de aglomerados atômicos e vapor é liberada no meio líquido em que os NPs se juntam rapidamente. Os NP produzidos por PLAL são finamente dispersos em um meio aquoso e o tamanho, polidispersão e composição dos NPs podem ser facilmente controlados pela variação do líquido aquoso de ablação, bem como do laser parAmostras 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . As características das nanopartículas podem ser ajustadas ajustando uma série de parâmetros do laser, incluindo: fluência, comprimento de onda e duração do pulso (revisado na referência 7 ). A fluência do laser é calculada como a energia do pulso dividida pela área do ponto do laser na superfície do alvo. Os efeitos precisos da fluência sobre o tamanho e a polidispersão das NPs são algo controversos. Em geral, verificou-se que, para os sistemas de laser pulsado &quot;longos&quot; e &quot;ultra-curtos&quot;, existem regimes de fluência baixos e altos que produzem tendências negativas e positivas de tamanho, respectivamente 8 , 9 , 10 , 11 . NP tamanho distributivoOs ons podem ser medidos empiricamente usando técnicas como dispersão de luz dinâmica e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), conforme descrito abaixo. A escolha do comprimento de onda do laser pode afetar os mecanismos físicos pelos quais os NPs são formados. Em comprimentos de onda mais curtos (ultravioleta), os fótons de alta energia são capazes de quebrar as ligações interatômicas 12 . Este mecanismo de foto-ablação é um exemplo de uma síntese de NP de cima para baixo, porque resulta na liberação de fragmentos de material ultra-pequenos que tendem a produzir maiores amostras de polidispersão ao saciar no líquido de submersão 12 , 13 , 14 . Em contraste, a ablação do infravermelho próximo (λ = 1,064 nm) produz um mecanismo de síntese ascendente dominado pela ablação plasmática 12 . A absorção do laser pelo alvo libera elétrons que colidem com e, em seguida, livres, elétrons encadernados. Como cOllisions aumenta, o material é ionizado, inflamando assim um plasma. O líquido circundante limita o plasma, aumenta a sua estabilidade e aumenta ainda mais a absorção 12 . À medida que o plasma em expansão é extinto pelo líquido de confinamento, os NPs são condensados ​​com várias geometrias 4 , 12 , 15 . A escolha da duração do pulso do laser pode afetar ainda mais o processo de formação de NP. Os lasers de pulsação longa comumente usados, com durações de pulso superiores a alguns picosegundos, incluem todos os milímetros, micro, nano e alguns aeroses pulsados ​​com picosegundo. Neste regime de largura do pulso, a duração do pulso do laser é maior do que o tempo de equilíbrio elétron-fonão, que é normalmente na ordem de alguns picosegundos 4 , 16 , 17 , 18 , 19. Isso resulta em vazamento de energia no meio de ablação circundante e na formação de NPs por mecanismos térmicos, como emissão termiônica, vaporização, ferver e derreter 1 , 20 . A atividade antibacteriana dos NPs é fortemente influenciada pelo tamanho de partícula 21 , 22 , 23 , 24 . A fim de aumentar a redução de tamanho e a monodispersão, os NPs podem ser irradiados uma segunda vez usando um laser de um comprimento de onda perto da ressonância plasmática de superfície (SPR) do NP. A radiação laser incidente é absorvida pelo NP através da excitação do SPR. A fragmentação do NP pode ocorrer através da evaporação térmica 25 , 26 ou da explosão de Coulomb 27 , 28 . A fotoexcitação aumenta tA temperatura do NP acima do ponto de fusão, resultando no derramamento da camada externa da partícula. Verificou-se que a adição de agentes tais como polivinilpirrolidona (PVP) ou dodecilsulfato de sódio (SDS) à solução pode melhorar grandemente os efeitos pós-irradiação 5 . O impacto da adição de vários solutos foi descrito em vários relatórios 1 , 4 , 6 . A facilidade de manipulação de características de NP por PLAL oferece um novo método para desenvolver novos antimicrobianos baseados em NP.

<table><tbody>Nd do nanossegundo: Espectrofotômetro <tr><td>motorizado da transmissão de</td><td>Standa</td><td>8MTF</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS da</td><td></td> fase da exploração de Ekspla NL303 <td></td> do laser de YAG Agilent Cary 60 <td></td></tr> Microscópio<tr><td></td><td></td><td></td> eletrônico dinâmico da transmissão de Malvern Zetasizer ZS 90 Microbalance Maktek TM 400 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>EM 902</td><td></td></tr><tr><td>Alvo de folha de prata</td><td>Alfa Aesar</td><td>12127</td><td></td></tr><tr><td>Lente de distância focal de 250 mm</td><td>Edmund Optics</td><td>69-624</td><td></td></tr><tr><td>Grades TEM de cobre</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>-400LD</td><td>Grade revestida de filme fino/lacey</td></tr><tr><td>E. coli MG1655</td><td>ATCC</td><td>47076</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptona</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>Ágar bacto</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>Disco de aço inoxidável (para estágio de ablação)</td><td>Metal Remnants, Inc.</td><td>N / A</td><td>1,5 polegadas de diâmetro, calibre 16</td></tr><tr><td>Copo</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540G</td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitação magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57</td><td></td></tr><tr><td>Placa de agitação magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49SH</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de energia e potência do laser</td><td>Coerente</td><td>1098579</td><td></td></tr><tr><td>Fita de carbono</td><td>Shinto Chemitron Co. Ltd.</td><td>Fita STR Sonicating</td><td></td></tr><tr><td>banho-maria</td><td>Branson</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Compressor de ar</td><td>GMC</td><td>Syclone 3010</td><td>Para alvo de ablação de secagem</td></tr><tr><td>Lente de distância focal de 75 mm</td><td>Edmund Optics</td><td>34-096</td><td>Lente de foco para pós-irradiação</td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo</td><td>Precision Cells Inc</td><td>21UV40</td><td>Caminho de luz de 50 mm (para pós-irradiação)</td></tr> <tr><td>Canamicina</td>Microscópio de luz <td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>50i</td><td>Este microscópio é usado para focar o laser no estágio de ablação. Este modelo específico não está mais disponível, mas qualquer microscópio de luz com uma objetiva 4X funcionará.</td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>AmScope</td><td>MT5000-CCD</td><td></td></tr><tr><td>Micrômetro slide</td><td>Ted Pella</td><td>2280-70</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

O surgimento de bactérias resistentes a múltiplos fármacos é uma preocupação clínica global levando alguns a especular sobre o nosso retorno a uma era de medicamentos &quot;pré-antibióticos&quot;. Além dos esforços para identificar novos fármacos antimicrobianos de pequena molécula, tem havido grande interesse no uso de nanopartículas metálicas como revestimentos para dispositivos médicos, curativos para feridas e embalagens de consumo, devido às suas propriedades antimicrobianas. A grande variedade de métodos disponíveis para a síntese de nanopartículas resulta em um amplo espectro de propriedades químicas e físicas que podem afetar a eficácia antibacteriana. Este manuscrito descreve o método de ablação a laser pulsada em líquidos (PLAL) para criar nanopartículas. Esta abordagem permite o ajuste fino do tamanho, composição e estabilidade das nanopartículas usando métodos de pós-irradiação, bem como a adição de surfactantes ou exclusores de volume. Ao controlar o tamanho e a composição das partículas, uma grande variedade de propriedades físicas e químicas da nanopa de metalPodem ser exploradas as partículas que podem contribuir para a sua eficácia antimicrobiana, abrindo assim novas vias para o desenvolvimento antibacteriano.

Usando alvos de prata, os parâmetros de laser descritos acima e SDS de 60 mM no líquido de ablação, NPs de prata são gerados com a absorvância UV-VIS característica no SPR ( Figura 2A ). As medições de TEM e DLS revelam um diâmetro NP médio de aproximadamente 25 nm antes da pós-irradiação ( Figura 2B ). Ablação do alvo de prata por 30 min geralmente produz uma concentração de NP de 200 μg / mL. Ao avaliar a toxicidade antimicrob...

As propriedades antimicrobianas de metais como cobre e prata foram reconhecidas há séculos. Este protocolo descreve a ablação por laser pulsada em líquidos, um método de síntese de nanopartículas metálicas que proporciona a capacidade de afinar as propriedades dessas nanopartículas para otimizar seus efeitos antimicrobianos.

Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir coloides de nanopartículas com controle sobre seu tamanho e composição, com a finalidade de avaliar suas propriedades antibacterianas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no desenvolvimento de nanopartículas antimicrobianas, incluindo o impacto de características específicas das nanopartículas, como tamanho, forma e composição, sobre a toxicidade. A principal vantagem desta técnica é a produção simples de nanopartículas a partir de diversos sistemas de materiais, realizada na ausência de subprodutos químicos potencialmente perigosos.Demonstrando este experimento estar&aacute; Matthew Ratti, um aluno de gradua&ccedil;&atilde;o, e Julianne Griepenburg, um membro do corpo docente da Rutgers Camden. Monte o aparelho de ablata&ccedil;&atilde;o colocando uma barra de agita&ccedil;&atilde;o magn&eacute;tica e uma plataforma de ablata&ccedil;&atilde;o porosa dentro de um b&eacute;quer de vidro de 50 mililitros. Coloque o b&eacute;quer sobre uma placa de agita&ccedil;&atilde;o magn&eacute;tica e posicione a placa sobre uma plataforma de transla&ccedil;&atilde;o XY para permitir o movimento do alvo durante a ablata&ccedil;&atilde;o.Configure o laser Nd:YAG para operar no comprimento de onda fundamental de 1.064 nanômetros, com duração de pulso de cinco nanosegundos e taxa de repetição de pulso de 10 hertz. Meça a energia por pulso com um medidor de potência e energia a laser. Foque o feixe abaixo do alvo na plataforma de ablação utilizando uma lente convergente com distância focal de 250 milímetros.Para a síntese de nanopartículas de prata, primeiro pese um alvo plano de prata utilizando uma microbalança para obter a massa pré-ablação. Em seguida, fixe o alvo de prata na platina porosa utilizando fita adesiva de carbono dupla face. Adicione 40 mililitros de líquido de ablação ao béquer.A altura do líquido acima do alvo é de 11 milímetros. Determine o tamanho do ponto ablatando o alvo de prata com vários pulsos a laser. Para medir o tamanho do ponto, visualize o alvo ablatado juntamente com uma lâmina micrométrica em um microscópio óptico equipado com uma câmera CCD.Para sintetizar as nanopartículas de prata, mova o estágio motorizado controlado por computador em um padrão elíptico a uma velocidade de 0,42 centímetros por segundo sob agitação constante e ablate o alvo por 20 a 40 minutos. Colete a solução de nanopartículas do béquer por decantação. Confirme a presença das nanopartículas medindo seus espectros de luz visível e UV.Meça o diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas utilizando espalhamento dinâmico de luz, diluindo a solução de nanopartículas de 1 para 40 na solução de ablatação. Um volume total de um mililitro da solução diluída é necessário ao utilizar uma cubeta plástica de um centímetro. Utilizando um ângulo de medição de 180 graus, meça o espalhamento da luz em um comprimento de onda de 633 nanômetros para determinar o diâmetro das nanopartículas de acordo com a equação de Stokes-Einstein.Confirme o tamanho e a forma das nanopartículas utilizando microscopia eletrônica de transmissão, diluindo primeiro a solução de nanopartículas na proporção de 1 para 40 em água bidestilada, para remover quaisquer aditivos em excesso que possam interferir na obtenção de imagens. Em seguida, coloque duas microlitros da solução em uma grade de cobre para MET previamente revestida com filme fino de carbono Lacey. Seque a grade durante a noite à temperatura ambiente sob vácuo em um dessecador antes de obter imagens das nanopartículas conforme referenciado no protocolo do texto.Para calcular a concentração de nanopartículas, remova quaisquer nanopartículas fracamente aderidas ao alvo metálico ablacionado colocando o alvo em um banho de água ultrassônica contendo água destilada por um minuto. Seque o alvo sob um fluxo de ar comprimido por um minuto. Em seguida, meça a massa do alvo em uma microbalança.Dilua as nanopartículas até uma concentração máxima de 100 microgramas por mililitro na mesma solução de ablatação. Transfira de 15 a 17 mililitros das nanopartículas diluídas para uma cubeta de quartzo contendo um bastão de agitação. Utilize um sistema a laser Nd-YAG para gerar pulsos de laser de 25 picosegundos e 532 nanômetros.Além disso, utilize uma lente com distância focal de 75 milímetros para focalizar o laser no centro da solução. Irradie a solução por 30 minutos a várias horas, dependendo do tamanho desejado. Para medir as propriedades antibacterianas das nanopartículas, primeiro cultive culturas de E.coli durante a noite e, em seguida, dilua-as até uma densidade óptica de 0,01 em LB fresco. Se as nanopartículas foram sintetizadas em meio de ablação contendo aditivos, adicione o produto químico respectivo ao LB, de modo que a concentração permaneça constante ao adicionar as nanopartículas.Em seguida, adicione as nanopartículas às culturas diluídas em concentrações variando de zero a 50 microgramas por mililitro. Incube as culturas sob agitação a 37 graus Celsius por mais duas horas. Após a incubação de duas horas, dilua seriamente as amostras de cultura de um para dez em LB fresco e aplique gotas de 10 microlitros de cada diluição em placas de ágar LB.Uma vez que as gotículas tenham sido absorvidas, incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, contar as unidades formadoras de colônias. Aqui, nanopartículas produzidas por ablação a laser pulsado em líquidos são caracterizadas por seus espectros de absorção.O espectro da luz visível e ultravioleta de nanopartículas de prata mostra um pico característico no comprimento de onda da ressonância do plasmon de superfície de 400 nanômetros. Para caracterizar ainda mais as nanopartículas, sua distribuição de tamanho é medida por microscopia eletrônica de transmissão. O tratamento de bactérias, como E.coli, com nanopartículas reduz a viabilidade, conforme determinado pela contagem de unidades formadoras de colônia.As células foram tratadas com canamicina como controle positivo. Observe que as células que não receberam nanopartículas de prata foram cultivadas na presença de SDS seis milimolar para garantir que os surfactantes não causassem toxicidade independentemente. Uma vez dominado, os nanopartículas podem ser produzidos e caracterizados em quatro a cinco horas.Testar a toxicidade antibacteriana das nanopartículas exige mais 24 horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a consistência entre os lotes exige atenção cuidadosa aos detalhes, como a energia do pulso e o posicionamento da lente. Não se esqueça de que este trabalho pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso adequado de proteção ocular, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Bioengenharia

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Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

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