Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida
24 de março de 2017
Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.
O objetivo geral deste protocolo é identificar um epítopo linear de células B reconhecido por anticorpos monoclonais utilizando proteínas recombinantes com truncamentos seriados e varredura por peptídeos mediante hibridização em dot blot. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a interação molecular entre o antígeno e o anticorpo. As principais vantagens desta técnica são sua simplicidade e eficiência.
O epítopo identificador pode então ser utilizado em investigações mais completas, como em aplicações terapêuticas e diagnósticas. O procedimento será demonstrado por Chien-Wen Chen, um pós-doutorando do meu laboratório. Para começar, cultive células híbridas monoclonais de camundongo RGM56 em um meio livre de soro híbrido.
Mantenha culturas celulares em frascos T175 a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após cinco dias de incubação, colete o meio de cultura quando este ficar amarelo e centrifugue o sobrenadante a 4.500 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o pellet de detritos celulares para obter o anticorpo em solução.
Em seguida, adicione dois mililitros de suspensão de agarose com proteína G a 50% a uma coluna de cinco mililitros e equilibre a resina com 10 mililitros de PBS gelado, correspondendo a 10 volumes da resina pré-carregada. Aplique 200 mililitros da solução de anticorpo previamente preparada na coluna equilibrada e descarte a fração que passa pela coluna. Lave a coluna duas vezes usando 10 mililitros de PBS gelado.
Por fim, para eluir o anticorpo da resina, adicione 10 mililitros de solução de glicerina milimolar com pH 2,7 à coluna. Colete frações de 900 microlitros em tubos de microcentrifugação previamente preenchidos com 100 microlitros de tampão de neutralização 10X. Armazene o anticorpo purificado em solução de glicerol 50% suplementada com azida de sódio a menos 20 graus Celsius.
Prepare os plasmídeos e transforme células de E. coli BL21 conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, transfira uma única colônia para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de caldo LB suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina e tampe o tubo parcialmente. Incube o cultivo a 37 graus Celsius com agitação de 150 RPM.
Monitore a densidade óptica do cultivo a 600 nanômetros. Quando atingir cerca de 0,6, resfrie o cultivo para 25 graus Celsius. Em seguida, adicione IPTG em uma concentração final de 0,4 milimolar para induzir a expressão da proteína recombinante.
Incube a cultura por mais quatro horas a 25 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Após a incubação, transfira um mililitro da cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue as células a 12.000 × g por um minuto e descarte o sobrenadante.
Pipetando para cima e para baixo com uma micropipeta, reconstitua o pellet celular em 100 microlitros de tampão de desnaturação. Em seguida, homogeneíze a suspensão resultante por vortexagem vigorosa para obter uma amostra pronta para uso de proteína recombinante. Para prosseguir com a hibridização em dot-blot, dissolva cada peptídeo sintético em DMSO para obter soluções de 10 miligramas por mililitro.
Em seguida, ative a membrana de PVDF em metanol por dois minutos e equilibre-a com o tampão de Towbin modificado por mais dois minutos. Enxágue um pedaço de papel de cromatografia com o tampão de Towbin modificado e coloque a membrana de PVDF equilibrada sobre ele. Deixe a membrana repousar até que o tampão desapareça de sua superfície.
Usando uma ponteira de 10 microlitros, adicione dois microlitros de cada amostra de peptídeo ou proteína recombinante sobre a membrana e deixe secar ao ar por 10 minutos. A aplicação de um símbolo na membrana é a etapa mais crítica deste protocolo. O carregamento de uma quantidade precisa de amostra em uma pequena área da membrana de PVDF exige atenção cuidadosa.
Em seguida, bloquee a membrana em tampão TBST suplementado com 5% de leite desnatado durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Dilua o anticorpo monoclonal RGM56 em tampão TBST suplementado com 5% de leite desnatado. E adicione a solução de anticorpo à membrana.
Incube a membrana a 37 graus Celsius por uma hora com agitação suave. Após a incubação, remova a solução de anticorpo e lave a membrana duas vezes em tampão TBST por cinco minutos com agitação suave.
Em seguida, adicione à membrana a solução do anticorpo secundário diluído em tampão TBST com 5% de leite desnatado. Incube a membrana por uma hora a 37 graus Celsius com agitação suave. Após a incubação, descarte a solução de anticorpo e lave a membrana duas vezes em tampão TBST por cinco minutos com agitação suave.
Em seguida, desenvolva a membrana com a solução de substrato por 15 minutos à temperatura ambiente e no escuro. Quando o sinal aparecer, interrompa a reação lavando a membrana com água bidestilada. Após secar a membrana ao ar, capture a imagem do dot blot utilizando um sistema de imagem.
Por fim, utilizando um software de análise de imagem, meça a intensidade de cada ponto do dot blot. Apresenta-se aqui a proteína codificadora completa do vírus da necrose nervosa, compreendendo os aminoácidos de um a 338, juntamente com suas variantes truncadas em série. Para confirmar a expressão das proteínas nas células bacterianas transformadas, foi realizada uma análise por dot blot com anticorpo anti-6XHis, demonstrando a presença de todas as proteínas em estudo.
Em seguida, as proteínas recombinantes foram analisadas por hibridização em dot blot, na qual foi utilizada a anticorpo monoclonal RG-M56. A análise revelou que o epítopo proteico reconhecido pelo anticorpo está presente no peptídeo de 195 a 338. Por fim, um epítopo constituído por 20 ou oito resíduos de aminoácidos foi identificado por meio de varredura com peptídeos.
A varredura com alanina mostrou que substituições dos resíduos de valina nas posições 197 e 199, bem como de uma cistina na posição 201, aboliram a capacidade de ligação do epítopo e a hibridização em dot-blot. Da mesma forma, a afinidade reduzida de ligação foi observada na análise da intensidade de ligação, confirmando que os resíduos identificados são essenciais para a ligação do epítopo ao anticorpo monoclonal RGM56. Essa técnica de identificação de peptídeos pode ser utilizada para desenvolver medicamentos peptídicos terapêuticos ou drogas peptídicas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para identificar um epítopo linear de células B reconhecido por um anticorpo monoclonal por meio de varredura com peptídeos e hibridização em dot blot. O método destaca-se pela sua simplicidade e eficiência, tornando-o adequado para aplicações terapêuticas e diagnósticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Bioquímica
- Técnicas Diagnósticas
Contexto
- Compreender as interações antígeno-anticorpo é fundamental na imunologia.
- Epítopos lineares desempenham um papel significativo no desenvolvimento de vacinas e em diagnósticos.
- Anticorpos monoclonais são amplamente utilizados em pesquisas e ambientes clínicos.
- A hibridização por dot-blot é um método confiável para mapeamento de epítopos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simples para a identificação de epítopos.
- Aprimorar a compreensão do reconhecimento de antígenos por anticorpos.
- Facilitar o uso de epítopos identificados em pesquisas futuras.
Métodos Utilizados
- Uso de proteínas recombinantes truncadas em série.
- Varredura com peptídeos por hibridização em dot blot.
- Cultivo de células híbridas monoclonis RGM56 de camundongo em meio livre de soro.
- Análise da ligação de anticorpos aos epítopos identificados.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de um epítopo linear de células B.
- Demonstração da eficiência e simplicidade do método.
- Aplicações potenciais nos campos terapêutico e diagnóstico.
- Contribuição para a compreensão das interações antígeno-anticorpo.
Conclusões
- O protocolo oferece uma abordagem confiável para o mapeamento de epítopos.
- Os epítopos identificados podem ser utilizados em diversas aplicações.
- Este método pode avançar a pesquisa em imunologia e áreas relacionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação de epítopos lineares de células B é essencial para reduzir riscos no desenvolvimento de anticorpos terapêuticos e orientar o design de vacinas. Essa abordagem de varredura com peptídeos permite o mapeamento rápido de epítopos com investimento mínimo de recursos, apoiando a validação precoce de alvos e a otimização de compostos líderes. O método aumenta a confiança preditiva nas interações antígeno-anticorpo, facilitando decisões de avanço ou interrupção em pipelines de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao definir a região antigênica precisa reconhecida por um anticorpo monoclonal.
- Valor Operacional: Utiliza proteínas recombinantes com truncamentos seriados e peptídeos sintéticos para delimitar rapidamente os limites do epítopo a um núcleo de 6 aminoácidos.
- Valor Preditivo: A mutagênese por varredura com alanina identifica resíduos críticos para a ligação, reduzindo a ambiguidade mecanicista em candidatos líderes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: A hibridização em dot blot em membranas de PVDF fornece uma leitura padronizada e quantitativa da ligação entre epítopo e anticorpo.
- Reprodutibilidade: O depósito controlado de amostras de 2 µL e etapas padronizadas de lavagem garantem detecção de sinal consistente entre réplicas.
- Escalabilidade: O método permite o triagem de peptídeos em alto rendimento para mapeamento fino de epítopos e estudos de mutagênese.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Os epítopos identificados podem ser utilizados para gerar complexos peptídeo-anticorpo para estudos estruturais, orientando o desenho racional de vacinas e terapias.
- Redução de Riscos Pré-clínicos: A caracterização de epítopos auxilia na avaliação da relevância funcional e do potencial de escape imunológico em alvos virais.
- Relevância Terapêutica: Os epítopos lineares mapeados permitem o desenvolvimento de terapêuticos ou diagnósticos baseados em peptídeos com mecanismos de ação definidos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial, conectando a validação do alvo à identificação de compostos ativos ao fornecer resolução em nível de epítopo para as interações anticorpo-antígeno.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio do mapeamento preciso de epítopos lineares, permitindo a clarificação de vias e a redução de riscos do alvo.
- Triagem: Fornece matrizes de peptídeos prontas para ensaio com saídas quantitativas de ligação para avaliação confiável de compostos ou variantes.
- Análises: Gera dados de intensidade de ligação a partir de imagens de dot-blot, permitindo comparação estatística de variantes e mutantes de epítopos.
- Pesquisa Translacional: Conecta o mapeamento de epítopos a estudos estruturais e funcionais por meio de complexos peptídeo-anticorpo cristalizáveis.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de mapeamento de epítopos reutilizável, aplicável a alvos virais, bacterianos ou de câncer em campanhas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao definir resíduos de aminoácidos essenciais para a ligação do anticorpo.
- Valor Operacional: Oferece um fluxo de trabalho simples e eficiente, exigindo apenas equipamentos padrão de biologia molecular e transferência em membrana.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios avançados ao permitir decisões precoces de prosseguimento ou interrupção com base na conservação e funcionalidade do epítopo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de anticorpos candidatos por meio de avaliações definidas de risco epítópico e capacidade de desenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em expressão de proteínas recombinantes, síntese de peptídeos e técnicas de imunoblotagem.
- Depende do acesso a membranas de PVDF, aparelho para dot-blot e sistemas de imagem para detecção de sinal.
- Necessita padronização dos volumes de carregamento das amostras e das condições de bloqueio entre equipes para resultados reprodutíveis.
- A adaptação a epítopos conformacionais pode exigir métodos complementares, já que a técnica mapeia principalmente regiões antigênicas lineares.
- As limitações práticas incluem possíveis falsos negativos se a conformação do epítopo depender de modificações pós-traducionais ausentes em sistemas de expressão bacteriana.
