Name: Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a identificar epítopos lineares de células B reconhecidos por anticorpos monoclonais usando varredura de peptídeos e hibridização dot-blot. Este método simples e eficiente auxilia aplicações terapêuticas e diagnósticas.

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Os autores agradecem à Srta. Ching-Chun Lin e à Srta. Diana Lin do Core Facility do Instituto de Biologia Celular e Organísmica (ICOB) da Academia Sinica por oferecerem sua experiência em síntese de peptídeos e sequenciamento de DNA, respectivamente. Este estudo foi apoiado pela Academia Sinica.

1. Preparação de Anticorpos Monoclonais <ol><li> Cultura dos monoclonais de rato células de hibridoma RG-M56 2 em meio livre de soro em frascos de 175T a 37 ºC com 5% de suplemento de CO 2. Recolhe-se o sobrenadante quando a cor do meio torna-se amarelo após cinco dias de incubação. NOTA: As células de hibridoma foram cultivadas em meio isento de soro a fim de evitar a contaminação de anticorpos a partir de soro fetal de bovino. </li><li> Centrifuga-se o sobrenadante a 4500 xg durante 30 min a 4 ºC e descartar o sedimento de restos de células. </li><li> Adicionar 2 ml de agarose a proteína G (fornecido como uma pasta a 50%) a uma coluna de 5 mL e equilibrar-se com 10 volumes de resina (10 ml) de PBS gelado. </li><li> Carga de 200 ml de sobrenadante de anticorpo (passo 1.2) para a coluna e descartar o repasse. </li><li> Adicionam-se 10 mL de PBS arrefecido em gelo para a coluna de lavá-lo. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar 10 ml de glicina 50 mM, pH 2,7 à coluna para eluir o anticorpo da proteína G-associado. Colcionar 900 fracções ul num tubo de microcentrífuga contendo 100 pL de 10x tampão de neutralização (Tris 1 M, NaCl 1,5 M, e EDTA 1 mM, pH 8,0). </li><li> Armazenar o anticorpo purificado em glicerol a 50% com 0,03% de NaN3 a -20 ºC. </li></ol> 2. Construção e Expressão da série truncadas Proteínas Recombinantes <ol><li> Prepara-se uma mistura reaccional de PCR: 5? L de 10x tampão Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 uM de iniciadores para a frente 3, 0,2 fiM de primer reverso 3, MgSO 2 mM de 4, 1 ng de pET20b 1A59 ADN-3 plasmídeo, e 2,5 L ( unidade) de polimerase de ADN Pfu; adicionar ddH2O para um volume final de 50 uL. <ol><li> amostras de execução em um termociclador automático, utilizando os seguintes parâmetros: Ciclo 1 (94 ºC por 5 min); ciclos 2-36 (94 ºC durante 30 s, 63 ° C durante 30 s, e 72 ºC durante 60 s); e ciclo de 37 (72 ºC durante 7 min). </li></ol></li><li> Extrai-se a reacção em cadeia da polimerase (PCR) produtos usando um kit de purificação de PCR para facilitar a 5 após a digestão com enzimas de restrição. </li><li> Digerir os fragmentos de ADN amplificados por PCR com Ndel e Xhol as enzimas de restrição e ligar cada um destes fragmentos de ADN Ndel e Xhol clivado-enzima pET-20b (+) do vetor. Transformar as construções em células de Escherichia coli-DH-5a competente 6. <ol><li> Preparar a mistura de digestão em tampão de digestão (20 mM Tris-acetato, Mg 10 mM (CH3COO) 2, KCH 50 mM 3 COO, e DTT 1 mM, pH 7,9) com 1 ug de ADN amplificado por PCR ou pET-20b (+) DNA do vector, e 2 U de Ndel e Xhol as enzimas de restrição, num volume final de 20 uL. </li><li> Misture a mistura de digestão suave e rapidamente girar para baixo. Incubar a 37 ° C durante 2 h num banho seco de corte para assegurar a completa da restrição sentares. </li><li> Extrair os fragmentos de ADN digerido com enzimas de restrição, utilizando um kit de purificação de PCR 5 para facilitar a seguinte construção de plasmídeo. </li><li> Preparar a mistura de ligação em tampão de ligação (Tris 66 mM, MgCl2 5 mM, ATP 1 mM, e DTT 5 mM, pH 7,5) com 100 ng de ADN pré-digeridas, amplificado por PCR, 10 ng de pré-digerido pET-20b (+) ADN do vector, e 5 L de ligase de ADN de T4 num volume final de 10 uL. </li><li> Misture a mistura de ligação com cuidado e rapidamente girar para baixo. Incubar a 16 ° C durante 18 h num banho de água. </li><li> Coloque 10 uL das amostras de ligação em 100 ul de células DH-5α-competentes e misturar suavemente antes da colocação do tubo de microcentrífuga em gelo durante 30 min. Coloque o tubo de microcentrífuga em um banho seco a 42 ºC durante 90 s para induzir choque de calor 7. Imediatamente transferir o tubo em gelo durante 2 min. </li><li> Adicionar 900 uL de meio de Luria-Bertani (LB) (1% de Bacto-triptona, 0,5% de Bacto levedura extracT, e 0,5% de NaCl, pH 7,0) ao tubo. Incubar a 37 ° C com agitação 150 rpm durante 45 min. Agregar as células por centrifugação a 4000 x g durante 10 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento com 50 ul de caldo LB e espalhar cada transformação em placas pré-aquecido LB contendo 100 ug / ml de ampicilina. Incubar as placas a 37 ºC durante 16 h. </li><li> Pegar uma única colónia usando uma ponta de 200 mL e colocá-lo em caldo 3 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina em um tubo de 15 frouxamente tapado mL. Incubar a 37 ° C com agitação 150 rpm durante 12 h. </li><li> Extrai-se a ADN de plasmídeo a partir de 8 cada cultura e sequenciar-lo utilizando um promotor de T7 e iniciadores de terminador T7 para confirmar a sequência 9. </li></ol></li><li> Após confirmação da sequência, transformar 10 ng de DNA de pET-20b estes (+) plasmídeos com diferentes comprimentos de gene da proteína de revestimento YGNNV na estirpe BL-21 (DE3) de E. coli por nósing o método de choque de calor 7. Siga os passos 2.3.6-2.3.8 para realizar a transformação. </li><li> Transferir uma única colónia de cada um de E. coli transformada BL-21 de células em caldo de 3 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina num tubo de 15 ml tapado frouxamente. Incubar a cultura a 37 ° C com 150 rpm tremendo. </li><li> Arrefece-se a cultura a 25 ° C quando a OD600 da cultura é de cerca de 0,6 e adicionar IPTG para uma concentração final de 0,4 mM para induzir a expressão da proteína recombinante. Incubar a cultura para um extra de 4 h a 25 ºC com 200 rpm tremendo. </li><li> Transferir 1 ml da cultura para um tubo de microcentrífuga. Agregar as células por centrifugação a 12000 xg durante 1 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 100 uL de tampão de desnaturação (ureia 8 M, fosfato de sódio 20 mM, e NaCl 0,5 M, pH 7,4) por pipetagem para cima e para baixo com uma micropipeta. Misturar em vórtice vigoroso. NOTA: O sol da amostradoras deve agora ser semi-transparente, um pouco pegajoso, e pronto para o ensaio de hibridação dot-blot. </li></ol> 3. Projeto e Síntese de péptidos sobrepostos <ol><li> Concepção e sintetizar 3 série peptídeos 20-meros que cada coincidem com o seu sucessor por 10 resíduos de aa da região de 195-338 aa da proteína de revestimento YGNNV para diminuir a região do epitopo de RG-M56 mAb por transferência de pontos. </li><li> Concepção e sintetizar peptídeos 3 três 8-Mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, e 199 VLCRWSVR 206) com uma sobreposição de 6 resíduos aa para o próximo peptídeo sintético para diminuir a região do epitopo de 195-206 aa por transferência de pontos. </li><li> Concepção e sintetizar 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 e 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, e 197 VSVLCR 202), e 5-meros péptidos (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, e 198 SVLCR 202) com uma sobreposição de 6, 5, e 4 resíduos de aa, respectivamente, Onto seus péptidos vizinhos para minimizar o região de epítopo por dot blotting. </li></ol> 4. Dot-blot hibridação <ol><li> Dissolve-se cada péptido sintetizado em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a uma concentração final de 10 mg / mL. NOTA: Para superar a solubilidade variada de péptidos sintéticos, todos os péptidos sintéticos devem ser dissolvidos em DMSO. DMSO é um bom solvente para dissolver completamente péptidos hidrofóbicos ou hidrofílicos. </li><li> Embeber a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com metanol durante 2 min. NOTA: membrana PVDF é até resistente a DMSO 100%; outros podem não ser assim. </li><li> Equilibrar a membrana de PVDF com tampão Towbin modificado (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS a 0,1%, pH 8,3) para2 minutos. NOTA: 10-20% (v / v) de metanol pode ser adicionado ao tampão Towbin modificados para melhorar os resultados de transferência. </li><li> Lavar um pedaço de papel de cromatografia com o tampão Towbin modificado. Colocar a membrana de PVDF sobre o papel de cromatografia. Espere até que o tampão Towbin modificado tenha desaparecido da superfície da membrana de PVDF antes de continuar para a próxima etapa. </li><li> Adicionar 2 mL de cada amostra de péptido para a membrana com uma ponta de 10 uL. Ar seco a membrana de PVDF sobre o papel de cromatografia durante 10 min. Adicionar a cada amostra de péptido lenta e gradualmente para a membrana para evitar o excesso de difusão. </li><li> Bloquear a membrana em tampão TBST (0,05% (v / v) de Tween-20, Tris 20 mM, e NaCl 150 mM, pH 7,4) com leite magro a 5% durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Adicionar RG-M56 mAb a uma diluição final de 1: 1000 em tampão TBST com 5% de leite desnatado à membrana. Incubar a membrana a 37 ° C durante 1 h com agitação suave. </li><li> Remover o anticorpo assimlução. Lava-se a membrana em tampão TBST durante 5 min com agitação suave. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho, Fe, conjugado com fosfatase alcalina) numa diluição final de 1: 5000 em tampão TBST com 5% de leite desnatado à membrana. Incubar a membrana a 37 ° C durante 1 h com agitação suave. </li><li> Descartar a solução do anticorpo. Lava-se a membrana em tampão TBST durante 5 min com agitação suave. Repita o passo de lavagem duas vezes. </li><li> Desenvolver a membrana com uma solução de substrato BCIP / NBT temperatura ambiente durante 15 min no escuro. Parar o desenvolvimento por lavagem da membrana com ddH2O quando o sinal aparece. </li><li> Ar seco da membrana e capturar a imagem dot-blot utilizando um sistema de imagem. </li><li> Medir a intensidade de cada dot blot usando uma imagem análise de software 3. </li></ol> 5. varrimento de alanina e Substituição <ol><li> Projetar e sintetizar 3 alanina e methipeptídeos de substituição onine. Substituir cada resíduo aa com alanina para o péptido 8-mer 195 VNVSVLCR 202 e sintetizar peptídeos 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 e 195 VNVSVLCA 202 . Substitua resíduo aa leucina 200 a metionina para criar o péptido epitópico SJNNV genótipo 195 VNVSVMCR 202. </li><li> Siga Seção 4 para realizar pesquisa de alanina e mutagénese de substituição dot blot. </li></ol>

<ol><li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variations+of+myelomatous+cells+%28proceedings%29%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).</li>
<li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00293.x/abstract">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li>
<li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+%28GGNNV%29+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).</li>
<li>Lai, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00303.x/abstract">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li>
<li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation%3A+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24(2011).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Miraprep%3A+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+in+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li>
<li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+ayu+%28Plecoglossus+altivelis%29+Pit-1+in+Escherichia+coli%3A+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li>
<li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li>
<li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. <a target="_blank" href="http://library.wur.nl/WebQuery/clc/1931063">The Aquaculture of Groupers</a>. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).</li>
<li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li>
<li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins%3A+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li>
<li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus%3A+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).</li>
<li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses%3A+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li>
<li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este relatório.

Este protocolo oferece uma técnica rápida e simples para identificar um epitopo linear reconhecido-mAb. Tomando em consideração o custo da síntese de péptidos e da eficiência da produção de péptidos que sintetizam, da região antigénica da proteína de revestimento de vírus foi reduzido por expressão de proteínas recombinantes em série truncados antes da análise de varrimento de péptidos. Como tal, o sistema de expressão pET de E. coli fiável e eficiente foi usado para produzir estas proteínas recombinantes em sé...

No sistema imunitário, a recombinação de segmentos V, D, J e permite a anticorpos para criar grandes variações de regiões determinantes de complementaridade (CDR) para se ligar a vários antigénios para proteger o hospedeiro contra a infecção patogénica. A defesa de neutralização de anticorpos contra antigénios depende da complementaridade espacial entre as CDR dos anticorpos e os epítopos de antigénios. Portanto, o conhecimento desta interacção irá ajudar molecular concepção de uma vacina profilática e desenvolvimento de fármacos péptido terapêutico. No entanto, esta interacção de neutralização pode ser influenciada tanto por vários domínios antigénicos a partir de um único antigénio e por vários CDRs de anticorpos, os quais, por conseguinte, tornam o processo de determinação epitopo mais complexo. Felizmente, o desenvolvimento da tecnologia do hibridoma, o qual funde a células produtoras de anticorpos com células de mieloma individuais, permite um lote constante dividindo de células para segrete um anticorpo específico, conhecido como um anticorpo monoclonal (mAb) 1. As células de hibridoma produzem estes puros, mAb de elevada afinidade para se ligar a um único domínio antigénico de um antigénio específico. Com a relação do anticorpo-antigénio estabelecida, várias abordagens, incluindo varrimento de péptidos, pode ser utilizado para determinar o epítopo de um antigénio usando o mAb correspondente. Desenvolvimentos recentes na tecnologia peptídeo sintético fizeram a técnica de exploração peptídeo mais acessível e mais conveniente para executar. Resumidamente, uma série de péptidos sintéticos que se sobrepõem são produzidos de acordo com uma sequência do antigénio alvo e estão associados a uma membrana em suporte sido para a hibridação de mAb. digitalização péptido não só oferece uma maneira simples para mapear a região de ligação do anticorpo, mas também facilita o aminoácido (AA) por meio de mutagénese de varrimento resíduo ou substituição para avaliar a interacção de ligação entre cada resíduo AA do péptido epítopo e as CDR do anticorpo. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aqui, o presente estudo descreve um protocolo para a identificação eficiente do epitopo linear da proteína de revestimento garoupa amarelo vírus da necrose nervoso (YGNNV) usando um mAb neutralizante 2, 3, 4. O protocolo inclui mAb preparação, a construção e expressão de proteínas recombinantes em série truncadas, de criação de péptidos sintéticos sobrepostos, hibridação dot-blot, o varrimento de alanina, e mutagénese de substituição. Considerando o elevado custo da síntese de péptidos, o passo de truncagem em série das proteínas recombinantes de uma proteína alvo desejado foi modificado, e a região antigénica foi reduzida para cerca de 100 a 200 resíduos aa antes da análise dot-blot matriz peptídica sintética foi realizada.

<table><tbody><tr><td>Meio Hybrid-SFM</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA Polymerase&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EP0502&nbsp;</td><td>Incluindo buffers</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>Incluindo tampões</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Incluindo tampões</td></tr><tr><td>XhoI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Incluindo tampões</td></tr><tr><td>pET-20b (+) vetor</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH-5&alpha; célula competente</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL-21(DE3) célula competente</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo&nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>Isopropiltio-&beta;-D-tiogalactosídeo (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno 20 Monolaurato de Sorbitano (Tween-20)</td> <td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>cabra Anti-rato IgG, anticorpo Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td> do fragmento do Fc</tr><tr><td>Immobilon-P (fluoreto de polivinilideno, PVDF)</td> <td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G Agarose Fast Flow</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificação</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 Sistema de imagem</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador MyCycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de um epítopo de célula b linear monoclonal antibody-péptido reconhecido digitalização-assistida

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

A identificação de um epítopo antigénico pelo sistema imunológico permite a compreensão do mecanismo de protecção de anticorpos que podem facilitar o desenvolvimento de vacinas e de drogas peptídicas neutralizantes. Péptido de varrimento é um método simples e eficiente, que diretamente mapeia o epitopo linear reconhecido por um anticorpo monoclonal (mAb). Aqui, os autores apresentam uma metodologia de determinação epitopo envolvendo proteínas em série truncadas recombinantes, design peptídeo sintético, e hibridação dot-blot para o reconhecimento antigênico da proteína de revestimento do vírus da necrose nervoso usando um mAb neutralizante. Esta técnica baseia-se na hibridação dot-blot de péptidos sintéticos e os mAbs em um (PVDF) de membrana de fluoreto de polivinilideno. A região mínima antigénico de uma proteína de revestimento virai reconhecido pelo mAb M56-RG pode ser reduzida por passo-a-passo aparado mapeamento do péptido para um epitopo peptidico 6-mer. Além disso, a mutagénese de varrimento de alanina e o resíduo subtuição pode ser realizado para caracterizar a importância de ligação de cada resíduo de aminoácidos que constituem o epítopo. Os resíduos que flanqueiam o local de epitopo foram encontrados para jogar um papel crítico na regulação da conformação peptídica. O péptido epitopo identificado podem ser usadas para formar cristais de complexos de péptido-anticorpo epitopo para um estudo de difracção de raios-X e a competição funcional, ou para terapêutica.

O objetivo deste experimento foi identificar um epitopo através Dot blot usando mAb. Para limitar rapidamente e eficientemente para baixo da região antigénica reconhecido por mAb, a todo o comprimento e proteínas de revestimento recombinante YGNNV truncados em série com uma marcação de fusão 6xHis no terminal C foram expressos a partir de um sistema de expressão de E. coli de PET 10 (Figura 1A). As proteínas recombinantes resultantes fora...

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

O objetivo geral deste protocolo é identificar um epítopo linear de células B reconhecido por anticorpos monoclonais utilizando proteínas recombinantes com truncamentos seriados e varredura por peptídeos mediante hibridização em dot blot. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a interação molecular entre o antígeno e o anticorpo. As principais vantagens desta técnica são sua simplicidade e eficiência.O epítopo identificador pode então ser utilizado em investigações mais completas, como em aplicações terapêuticas e diagnósticas. O procedimento será demonstrado por Chien-Wen Chen, um pós-doutorando do meu laboratório. Para começar, cultive células híbridas monoclonais de camundongo RGM56 em um meio livre de soro híbrido.Mantenha culturas celulares em frascos T175 a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após cinco dias de incubação, colete o meio de cultura quando este ficar amarelo e centrifugue o sobrenadante a 4.500 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o pellet de detritos celulares para obter o anticorpo em solução.Em seguida, adicione dois mililitros de suspensão de agarose com proteína G a 50% a uma coluna de cinco mililitros e equilibre a resina com 10 mililitros de PBS gelado, correspondendo a 10 volumes da resina pré-carregada. Aplique 200 mililitros da solução de anticorpo previamente preparada na coluna equilibrada e descarte a fração que passa pela coluna. Lave a coluna duas vezes usando 10 mililitros de PBS gelado.Por fim, para eluir o anticorpo da resina, adicione 10 mililitros de solução de glicerina milimolar com pH 2,7 à coluna. Colete frações de 900 microlitros em tubos de microcentrifugação previamente preenchidos com 100 microlitros de tampão de neutralização 10X. Armazene o anticorpo purificado em solução de glicerol 50% suplementada com azida de sódio a menos 20 graus Celsius.Prepare os plasmídeos e transforme células de E. coli BL21 conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, transfira uma única colônia para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de caldo LB suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina e tampe o tubo parcialmente. Incube o cultivo a 37 graus Celsius com agitação de 150 RPM.Monitore a densidade óptica do cultivo a 600 nanômetros. Quando atingir cerca de 0,6, resfrie o cultivo para 25 graus Celsius. Em seguida, adicione IPTG em uma concentração final de 0,4 milimolar para induzir a expressão da proteína recombinante.Incube a cultura por mais quatro horas a 25 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Após a incubação, transfira um mililitro da cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue as células a 12.000 × g por um minuto e descarte o sobrenadante.Pipetando para cima e para baixo com uma micropipeta, reconstitua o pellet celular em 100 microlitros de tampão de desnaturação. Em seguida, homogeneíze a suspensão resultante por vortexagem vigorosa para obter uma amostra pronta para uso de proteína recombinante. Para prosseguir com a hibridização em dot-blot, dissolva cada peptídeo sintético em DMSO para obter soluções de 10 miligramas por mililitro.Em seguida, ative a membrana de PVDF em metanol por dois minutos e equilibre-a com o tampão de Towbin modificado por mais dois minutos. Enxágue um pedaço de papel de cromatografia com o tampão de Towbin modificado e coloque a membrana de PVDF equilibrada sobre ele. Deixe a membrana repousar até que o tampão desapareça de sua superfície.Usando uma ponteira de 10 microlitros, adicione dois microlitros de cada amostra de peptídeo ou proteína recombinante sobre a membrana e deixe secar ao ar por 10 minutos. A aplicação de um símbolo na membrana é a etapa mais crítica deste protocolo. O carregamento de uma quantidade precisa de amostra em uma pequena área da membrana de PVDF exige atenção cuidadosa.Em seguida, bloquee a membrana em tampão TBST suplementado com 5% de leite desnatado durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Dilua o anticorpo monoclonal RGM56 em tampão TBST suplementado com 5% de leite desnatado. E adicione a solução de anticorpo à membrana.Incube a membrana a 37 graus Celsius por uma hora com agitação suave. Após a incubação, remova a solução de anticorpo e lave a membrana duas vezes em tampão TBST por cinco minutos com agitação suave.Em seguida, adicione à membrana a solução do anticorpo secundário diluído em tampão TBST com 5% de leite desnatado. Incube a membrana por uma hora a 37 graus Celsius com agitação suave. Após a incubação, descarte a solução de anticorpo e lave a membrana duas vezes em tampão TBST por cinco minutos com agitação suave.Em seguida, desenvolva a membrana com a solução de substrato por 15 minutos à temperatura ambiente e no escuro. Quando o sinal aparecer, interrompa a reação lavando a membrana com água bidestilada. Após secar a membrana ao ar, capture a imagem do dot blot utilizando um sistema de imagem.Por fim, utilizando um software de análise de imagem, meça a intensidade de cada ponto do dot blot. Apresenta-se aqui a proteína codificadora completa do vírus da necrose nervosa, compreendendo os aminoácidos de um a 338, juntamente com suas variantes truncadas em série. Para confirmar a expressão das proteínas nas células bacterianas transformadas, foi realizada uma análise por dot blot com anticorpo anti-6XHis, demonstrando a presença de todas as proteínas em estudo.Em seguida, as proteínas recombinantes foram analisadas por hibridização em dot blot, na qual foi utilizada a anticorpo monoclonal RG-M56. A análise revelou que o epítopo proteico reconhecido pelo anticorpo está presente no peptídeo de 195 a 338. Por fim, um epítopo constituído por 20 ou oito resíduos de aminoácidos foi identificado por meio de varredura com peptídeos.A varredura com alanina mostrou que substituições dos resíduos de valina nas posições 197 e 199, bem como de uma cistina na posição 201, aboliram a capacidade de ligação do epítopo e a hibridização em dot-blot. Da mesma forma, a afinidade reduzida de ligação foi observada na análise da intensidade de ligação, confirmando que os resíduos identificados são essenciais para a ligação do epítopo ao anticorpo monoclonal RGM56. Essa técnica de identificação de peptídeos pode ser utilizada para desenvolver medicamentos peptídicos terapêuticos ou drogas peptídicas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse...

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

Este vídeo demonstra uma técnica que aplica a tecnologia de microarray de peptídeos para traçar o perfil da especificidade dos anticorpos que reconhecem modificações pós-traducionais (PTMs) em peptídeos de histonas. Uma lâmina de microarray contendo peptídeos de histonas conjugados com fluoróforo imobilizado com combinações conhecidas de PTM é tratada com anticorpos específicos de PTM alvo. Esse processo ajuda a identificar a especificidade do anticorpo para o alvo e sua potencial reatividade...

Uma tecnologia de microarray de peptídeos para perfis de especificidade de anticorpos

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou design. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II dimensionado para placas de 384 poços é descrito. Este formato de baixo custo deve ser útil nos campos da deimmunization proteína e design e desenvolvimento de vacinas.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Este protocolo descreve o desenvolvimento de dois anticorpos monoclonais (mAbs) da classe IgG fortemente reativos à mioglobina de cetáceos. Esses mAbs são aplicados em uma tira de teste imunocromatográfica de ouro coloidal baseada no formato sanduíche para diferenciar o Mb de cetáceos de focas e outros animais.

Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para a descoberta dos reagentes de afinidade do peptide, uma alternativa robusta para anticorpos. O método de classificação semi-automatizadas aqui simplificou biopanning para diminuir a ocorrência de falsos positivos. Aqui ilustramos o processo de pensamento e técnicas aplicadas na avaliação de candidatos e minimizando a análise a jusante.

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

Incompatibilidades em sequências de antigénios (HLA) leucocitário humano entre doador e beneficiários pares são a principal causa de rejeição mediada por anticorpo em transplante de órgãos. Aqui nós apresentamos o uso de matrizes de antígeno personalizado com base em sequências HLA dos doadores individuais para sondar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos.

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de moléculas de 1b complexo principal de histocompatibilidade não-clássica. Imunização com resumos de Qa-1-ligação foi mostrada para aumentar o tecido-específica Regulamento imune e amenizar várias doenças auto-imunes. Neste documento descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo sobreposição para a identificação de epitopos de Qa-1 em uma proteína.

Biblioteca de peptídeo sobreposição para mapear os resumos de Qa-1 em uma proteína

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

Com base em uma matriz de peptídeos derivadas do vírus da hepatite B (HBV), as respostas de células T CD4 específicas do HBV poderiam ser avaliadas em paralelo com a identificação de epítopos de células T CD4 específicas do HBV.

Análise das respostas e identificação de epítopos de células T T específicas do HBV com base em uma matriz de peptídeos

Aprenda a identificar epítopos lineares de células B reconhecidos por anticorpos monoclonais usando varredura de peptídeos e hibridização dot-blot. Este método simples e eficiente auxilia aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

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