Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models

O objetivo geral deste procedimento é medir as alterações tônicas e fásicas do glutamato extracelular in vivo usando matrizes de microeletrodos ligados a enzimas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como se os níveis de neurotransmissores extracelulares e a dinâmica rápida de liberação e depuração de neurotransmissores são alterados em estados de doença. A principal vantagem dessa técnica é que os MicroElectrode Arrays podem medir mudanças específicas de neurotransmissores em regiões cerebrais discretas, tornando-a uma abordagem espacial e temporalmente precisa, sendo minimamente invasiva.

Demonstrando o procedimento estarão Holly Hunsberger e Ryan Heslin do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, reveste um par de locais de registro em um MEA com a enzima desejada e um par diferente de locais de registro com a matriz proteica inativa. Em seguida, elabore a glutamato oxidase ou matriz proteica usando uma seringa Hamilton de 10 microlitros.

Pressione suavemente o êmbolo para dispensar uma pequena gota de solução na ponta da seringa. Para atingir os locais de registro MEA, sob um microscópio de dissecação, aplique a solução nos locais de registro apropriados entrando em contato brevemente com os locais de registro com a gota da solução, que representa uma camada. Defina um temporizador para um minuto entre as aplicações de revestimento e os locais de gravação.

Agora, coloque o eletrodo de referência através da abertura no braço de plástico. Baixe o eletrodo de referência em um béquer contendo PBS e certifique-se de que ele não entre em contato com o fundo do béquer. Em seguida, conecte o eletrodo de referência ao estágio principal e conecte o MEA ao mPD banhado ao estágio principal.

Baixar o MEA no copo da solução, de modo a que apenas a ponta MEA fique submersa na solução. Não mergulhe a ponta MEA em líquido além da bolha preta. Isso pode danificar o MEA.

Em seguida, selecione o ícone de galvanoplastia na área de trabalho. No menu da ferramenta de galvanoplastia, verifique se as configurações corretas foram inseridas. Depois, selecione o software de saída para concluir a galvanoplastia.

Enxágue as pontas dos eletrodos revestidos com mPD com água DI e guarde por 24 horas antes de calibrar. Neste procedimento, ligue uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius e conecte o estágio principal ao sistema de controle de gravação. Em seguida, insira a ponta MEA em 40 mililitros de PBS 0,5 molar agitado.

Em seguida, conecte o eletrodo de referência ao estágio principal. Agite a ponta do eletrodo de referência para garantir que não haja bolhas de ar. Depois disso, abra o programa de gravação, verifique se as configurações estão corretas, escolha o número MEA, clique em Calibração e pressione iniciar.

Aguarde de cinco a 10 minutos para o equilíbrio e comece a calibração assim que a linha de base se estabilizar. Em seguida, selecione Linha de base e adicione 500 microlitros de ácido ascórbico. Em seguida, selecione Interferente quando a corrente atingir um novo platô estável.

Se o MEA for devidamente galvanizado, nenhuma alteração deve ser observada. Em seguida, adicione 40 microlitros de L-glutamato 20 milimolares. Quando a corrente atingir um novo platô estável, marque a primeira adição como analito.

Repita três vezes para um total de três adições de glutamato. Em seguida, adicione 40 microlitros de dopamina. E selecione Substância de teste.

Posteriormente, adicione 40 microlitros de peróxido. Selecione Substância de teste e clique no botão Parar quando a calibração estiver concluída. Nesta etapa, coloque a micropipeta centralmente entre todos os quatro locais de gravação de platina e monte-a 50 a 100 micrômetros acima do MEA usando cera pegajosa e massa de modelar.

Usando um adaptador CC, prenda o fio positivo vermelho ao fio de prata preparado no lado do pino dourado e prenda o fio negativo preto ao cátodo do banho de platina. Em seguida, conecte o adaptador DC e procure o processo de revestimento correto. Bolhas devem aparecer no eletrodo do banho e o eletrodo de referência deve ficar cinza prateado.

Neste procedimento, coloque o animal no dispositivo estereotáxico e use as barras auriculares para estabilizar sua cabeça. Certifique-se de que o animal esteja preso e que a cabeça não se mova. Em seguida, aplique pomada para os olhos usando um aplicador de algodão estéril.

Depois disso, raspe a cabeça com um aparador. E remova o pelo perto das orelhas usando uma pequena tesoura cirúrgica. Em seguida, aplique iodo e álcool no couro cabeludo três vezes alternadamente.

Em seguida, faça uma incisão no meio do couro cabeludo e espalhe a pele. Absorva qualquer sangue com uma ponta de algodão estéril e aplique peróxido de hidrogênio para facilitar o aparecimento de bregma e lambda. Certifique-se de que a cabeça esteja posicionada corretamente, medindo o dorso-ventral e o medial-lateral do bregma e lambda.

Defina as coordenadas em bregma como zero e marque as coordenadas de destino. Em seguida, perfure ao redor da marca. Depois, anexe o MEA ao estágio principal.

Encha novamente a pipeta com a primeira solução desejada. Certifique-se de deixar uma lacuna na pipeta sem solução para que a solução que está sendo expelida possa ser examinada. Em seguida, conecte o tubo à micropipeta de vidro.

Encontre bregma com o MEA anexado e defina as coordenadas como zero. Mova o MEA para as coordenadas desejadas e abaixe lentamente o MEA até que a ponta toque o cérebro. Em seguida, zere a coordenada dorsal-ventral e, em seguida, abaixe lentamente o MEA no cérebro.

Coloque o eletrodo de referência em um local remoto do MEA, de modo que ainda esteja em contato líquido com o cérebro para completar o circuito. No programa de gravação, clique no eletrodo calibrado desejado e, em seguida, clique em realizar experimento para iniciar a gravação. Depois de obter uma linha de base estável, defina o ejetor de pressão para 0.6 segundos e 0.5 psi e pressione o botão vermelho no ejetor de pressão para ejetar.

Registre o tempo e a pressão, bem como os tiques de volume movidos na folha de injeção e faça anotações, se necessário. Depois disso, remova o MEA com a micropipeta acoplada, enxágue com água DI e mergulhe-o em PBS durante a noite até que todo o sangue desapareça. Nas regiões CA3 e CA1 do hipocampo, os níveis tônicos de glutamato foram significativamente aumentados nos camundongos TauP301L tratados com veículo, um efeito atenuado pelo tratamento com riluzol.

Aqui, os registros representativos da linha de base corresponderam à liberação de glutamato evocado por cloreto de potássio no CA3 mostraram que o tratamento com riluzol atenuou o aumento significativo na amplitude da liberação de glutamato observada em camundongos Vehicle-TauP301L. A aplicação local de cloreto de potássio produziu um aumento robusto no glutamato extracelular que retornou rapidamente aos níveis tônicos. O aumento significativo do cloreto de potássio evocou a liberação de glutamato no DG, CA3 e CA1 observado nos camundongos TauP301L tratados com veículo após a aplicação local de cloreto de potássio ter sido atenuada com o tratamento com riluzol.

Esta seção do hipocampo manchada de violeta cresil confirma a localização das trilhas MEA em CA3 e CA1. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar as etapas de solução de problemas listadas no manuscrito. Por exemplo, para reduzir sinais ruidosos, lembre-se de aterrar o sistema e seguir as etapas em tempo hábil.