Name: Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a medir glutamato tônico e fásico in vivo usando microeletrodos enzimáticos em camundongos transgênicos TauP301L. Este método minimamente invasivo permite monitorar dinâmicas de neurotransmissores em regiões específicas do hipocampo.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Associação de Alzheimer (MNR; NIRG-12-242187), WVU Faculdade Research Senado Grant (MNR), e WVU PSCOR Grant (RNM).

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<li>Hefendehl, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+synaptic+glutamate+transporter+dysfunction+in+vivo+to+regions+surrounding+Abeta+plaques+by+iGluSnFR+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging.</a> Nat Commun. 7, 13441(2016).</li>
<li>Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+in+the+regulation+of+extracellular+glutamate+by+neurons+and+glia+in+the+rat+striatum+two+days+after+diffuse+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury.</a> J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).</li>
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GG é o único proprietário de Quanteon, LLC que faz com que o sistema de gravação FAST-16 usado para medições de glutamato neste estudo. JEQ é um consultor pago para Quanteon.

A técnica MEA permite a medição da cinética rápida de libertação de neurotransmissores e a absorção in vitro e in vivo. Assim, a tecnologia produz uma vasta variedade de saída de dados, incluindo os níveis de neurotransmissores tónicas, a libertação de neurotransmissores evocados, e depuração neurotransmissor. No entanto, porque o uso de AAM é um procedimento relativamente complexo, existem numerosos factores que podem necessitar de ser optimizado para utilização com sucesso. Por exemplo, durante a cal...

Medindo alterações de neurotransmissores no cérebro é uma ferramenta essencial para neurocientistas o estudo de doenças do sistema nervoso central (SNC) que são muitas vezes caracterizados por desregulao de neurotransmissores. Embora microdiálise em combinação com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC / CE) tem sido o método mais amplamente utilizado para medir alterações nos níveis de neurotransmissores extracelulares 1, 2, 3, 4, a resolução espacial e temporal de sondas de microdiálise pode não ser ideal para neurotransmissores , tais como o glutamato, que são estreitamente regulada no espaço extracelular 5, 6. Devido aos recentes avanços na genética e na imagem, existem métodos adicionais que podem ser utilizadas para mapear glutamato in vivo. Usando repórteres glutamato fluorescentes geneticamente codificados (iGluSnFR) umd de dois fotões imagiologia, os investigadores são capazes de visualizar a libertação de glutamato por neurónios e astrócitos, tanto in vitro e in vivo, 7, 8, 9. Notavelmente, este permite a gravação de um maior campo de visão e não perturbar as ligações intrínsecas do cérebro. Enquanto estas novas técnicas ópticas permitem a visualização da cinética de glutamato e medição de respostas evocadas sensoriais e actividade neuronal, eles não têm a capacidade para quantificar a quantidade de glutamato no espaço extracelular em regiões cerebrais discretas. Um método alternativo é a matriz de microeléctrodos ligado a enzima (MEA), que pode medir selectivamente níveis de neurotransmissores extracelulares, tais como o glutamato, através da utilização de um esquema de gravao por auto-referenciados. A técnica MEA tem sido usado para estudar alterações na glutamato extracelular seguintes cerebral traumáticalesão 10, 11, 12, envelhecimento 13, 14, estresse 15, 16, epilepsia 17, 18, doença de Alzheimer 19, 20, e a injecção de um mímico viral 21 e representa um aperfeiçoamento em relação às limitações espaciais e temporais inerentes microdiálise. Considerando microdiálise restringe a capacidade de medir perto da sinapse 22, 23, AAM têm uma alta resolução espacial que permite a medidas selectivas de transbordamento glutamato extracelular perto sinapses 24, 25. Em segundo lugar, a resolução temporal baixa de microdiálise (1-20 min) limita a capacidade para investigar odinâmica rápida de liberação de glutamato e desembaraço que ocorrem no milésimo de segundo para a segunda faixa de 26. Como as diferenças na libertação ou alívio de glutamato pode não ser evidente em medidas de tónico, descansando os níveis de glutamato, pode ser essencial que a libertação de glutamato e depuração ser directamente medido. AAM permitir tais medidas, devido à sua alta resolução temporal (2 Hz) e baixos limites de detecção (&lt;1 um). Em terceiro lugar, AAM permitir a análise de alterações em sub neurotransmissores dentro de uma região particular do cérebro, tais como o hipocampo de rato ou de ratinho. Por exemplo, usando MEAs que pode ter como alvo, separadamente, o giro dentado (DG), cornu Ammonis 3 (CA3) e cornu Ammonis 1 (CA1), do hipocampo, as quais estão ligadas através de um circuito trisynaptic 27, para examinar as diferenças sub em glutamato extracelular. Por causa do tamanho das sondas de microdiálise (1 - 4 mm) de comprimento e o dano causado pela implantação 28 &lt;/ sup&gt;, 29, as diferenças sub-regionais são difíceis de abordar. Além disso, os sistemas ópticos de só permitir a estimulação através de estímulos externos, tais como uma estimulação suiça ou cintilação luz, que não permite a estimulação sub-7. Um benefício final de AAM em relação a outros métodos, é a capacidade para estudar estas sub-regiões in vivo, sem perturbar as ligações extrínsecos e intrínsecos. Aqui, descrevemos a forma como um sistema de gravação (por exemplo, FAST16mkIII) em combinação com AAM, que consiste de um microeléctrodo de vários locais de cerâmica à base, pode ser diferencialmente revestido sobre os locais de gravação para permitir a agentes interferentes a ser detectado e removido o sinal de analito. Nós também demonstrar estas matrizes podem ser utilizadas para estudos baseados em amperometria de glutamato in vivo regulação dentro da DG, CA3, e sub-regiões do hipocampo CA1 de RTG anestesiado (TauP301L) 4510 ratinhos, um m utilizadamodelo ouse da doença de Alzheimer. Além disso, nós fornecemos confirmação da sensibilidade do sistema de MEA com a dinâmica rápidas de libertação de glutamato e depuração por tratamento dos ratinhos com o riluzol, uma droga demonstrado in vitro para diminuir a libertação de glutamato e aumentar a captação de glutamato 30, 31, 32, 33, e demonstrando essas respectivas alterações in vivo no modelo do rato TauP301L.

<table><tbody><tr><td>FAST-16mkIII-8 canais</td><td>Quanteon</td><td>16mkIII</td><td></td></tr><tr><td>Microeletrodos matrizes</td><td>CenMet</td><td>W4 ou 8-TRK</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-3059</td><td>10 g (expira após 1 mês)</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-6257</td><td>100 mL (expira após 6 meses)</td></tr><tr><td>Glutamato Oxidase</td><td>US Biological ou Sigma Aldrich</td><td>G4001-01 ou 100646</td><td>50 UI (expira após 6 meses)</td></tr><tr><td>Seringas</td><td>Hamilton Hamilton</td><td>#80383</td><td>2 seringas</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>UN1230</td><td>4 L</td></tr><tr><td>m-Cloridrato de fenilenodiamina (mPD)</td><td>ACROS Organics</td><td>1330560250</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Eletrodos de referência (RE-5B)</td><td>BAS</td><td>MF-2079</td><td>3 eletrodos</td></tr><tr><td>Magnético alimentado por bateria placa de agitação</td><td>Cole-parmer</td><td>EW-04804-01</td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1626</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>TCI</td><td>50-81-7</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloridrato de dopamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>62-31-7</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>VWR</td><td>UN2920</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Cloreto de pósssio</td><td>VWR</td><td>7447-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>de cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>7647-40-7</td><td>1 kg</td></tr> de <tr><td>cloreto de cálcio</td><td>MP</td><td>153502</td><td>100 g</td></tr><tr><td>de hidróxido de sódio</td><td>BDH</td><td>1310732</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de pipetas de ejeção de pressão de vidro CenMet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera pegajosa</td><td>Kerrlab</td><td>625</td><td>Pode ser comprado de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Microsyringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Massa de modelar</td><td>WalMart</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fio de prata</td><td>AM systems</td><td>#786500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>BDH</td><td>7647010</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Fio de platina</td><td>AM Systems</td><td>778000</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de solda</td><td>Lowes ou Home Depot</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Multímetro</td><td>WalMart</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Dispositivo</td> <td>estereotáxicoStoelting</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Digital Lab Standard</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Microscópio Meiji EMZ</td><td>Broca Meiji</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dremel</td><td>Micro</td><td></td></tr><tr><td>Metricide</td><td>Metrex</td><td>102800</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>VWR</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Tesoura de cirurgia</td><td>VWR</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Cotonetes estéreis</td><td>Puritan</td><td>25806</td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos Pomada</td><td>Puralube Vet Pomada</td><td></td><td>Obter do veterinário</td></tr><tr><td>Cotonetes de iodo</td><td>VWR</td><td>S48050</td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Cotonetes com álcool</td><td>Drogaria local</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Campo de cirurgia estéril</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Solução salina estéril</td><td>Teknova</td><td>S5815</td><td>Pode fazer sua própria solução usando filtros</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (3%)</td> <td>Farmácia</td><td></td> local <td>Pode comprar de diferentes fornecedores</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>WalMart</td><td></td><td>Pode comprar de diferentes fornecedor</td></tr></tbody></table>

utilizando biossensores baseados em enzyme medir tonic e phasic glutamato na doença de alzheimer rato models

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

interrupção neurotransmissor é muitas vezes um componente-chave de doenças do sistema nervoso central (CNS), desempenhando um papel na patologia subjacente a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, depressão e ansiedade. Tradicionalmente, microdiálise foi o mais comum (louvado) técnica para examinar as alterações de neurotransmissores que ocorrem nestes distúrbios. Mas porque microdiálise tem a capacidade de medir as alterações lentas 1-20 minutos através de grandes áreas de tecido, ele tem a desvantagem de invasividade, potencialmente destruir as ligações intrínsecas dentro do cérebro e uma capacidade de amostragem lenta. Uma técnica relativamente nova, a matriz de microeléctrodos (MEA), tem numerosas vantagens para a medição de alterações de neurotransmissores específicos dentro de regiões cerebrais discretas à medida que ocorrem, para fazer uma abordagem espacialmente e temporalmente preciso. Além disso, utilizando AAM é minimamente invasivo, permitindo a medição de alterações de neurotransmissores in vivo. Em nosso laboratório, nós have sido especificamente interessados ​​em mudanças no neurotransmissor, glutamato, relacionada com a patologia da doença de Alzheimer. Como tal, o método descrito aqui foi usado para avaliar as perturbações do hipocampo potenciais em glutamato em um modelo de rato transgénico da doença de Alzheimer. Resumidamente, o método utilizado envolve o revestimento de um microeléctrodo de multi-local com uma enzima muito selectiva para o neurotransmissor de interesse e utilizando locais de auto-referenciar para subtrair o ruído de fundo e os interferentes. Depois de plaqueamento e de calibração, o MEA pode ser construído com uma micropipeta e reduzido para a região do cérebro de interesse utilizando um dispositivo estereotáxico. Aqui, o método descrito envolve a anestesiar RTG (TauP301L) 4510 e ratinhos utilizando um dispositivo estereotáxico para alvejar com precisão sub-regiões (DG, CA1, e CA3) do hipocampo.

Embora esta tecnologia pode ser usada para medir alterações na glutamatérgica sinalização em muitos tipos de modelos animais, tais como lesão traumática cerebral, envelhecimento, estresse e epilepsia, aqui vamos demonstrar como a tecnologia MEA pode ser usado para examinar alterações glutamatérgicos no modelo de rato transgénico de taupatia humano 19, 20. O RTG (TauP301L) 4510 ratinho expressa a mutao P301L em tau associada a dem...

Aqui, descrevemos a configuração, navegação software e análise de dados para um método espacial e temporalmente precisa de medir a tônica e fásica mudanças glutamato extracelulares in vivo utilizando matrizes de microeletrodos ligado a enzima (MEA).

Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

O objetivo geral deste procedimento é medir alterações tónicas e fásicas do glutamato extracelular in vivo utilizando Microplataformas de Eletrodos enzimáticos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência, como por exemplo se os níveis extracelulares de neurotransmissores e a dinâmica rápida da liberação e remoção de neurotransmissores estão alteradas em estados patológicos. A principal vantagem desta técnica é que as Microplataformas de Eletrodos conseguem medir alterações específicas de neurotransmissores em regiões cerebrais discretas, tornando-a uma abordagem precisa tanto no tempo como no espaço, além de ser minimamente invasiva.Os procedimentos serão demonstrados por Holly Hunsberger e Ryan Heslin do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, recubra um par de sítios de registro em uma MEA com a enzima desejada e um par diferente de sítios de registro com a matriz proteica inativa. Em seguida, aspire a glutamato oxidase ou a matriz proteica utilizando uma seringa Hamilton de 10 microlitros.Pressione suavemente o êmbolo para dispensar uma pequena gota da solução na ponta da seringa. Para direcionar os sítios de gravação da MEA, sob

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Modelos transgênicos (Tg) do mouse do AD uma excelente oportunidade para investigar como e por que níveis Aâ ou tau na mudança CSF como a doença progride em pacientes humanos. Aqui, nós demonstramos uma refinada técnica de punção da cisterna magna para amostragem CSF serial do mouse.

A técnica de coleta de líquido cefalorraquidiano Serial da Cisterna Magna em rato

Uma das características patológicas da doença de Alzheimer é a formação de amilóide β proteína placas neuríticas positivo. Neste protocolo, descrevemos dois métodos para detectar placas neuríticas em camundongos transgênicos modelo AD: detecção imunohistoquímica utilizando o método ABC e DAB e detecção fluorescente usando o método thioflavin S coloração.

Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo

Neste vídeo, um Multielectrode Array (MEA) revestido com glutamato oxidase é implantado no tecido cerebral de um ratinho anestesiado. A solução de glutamato é injetada no espaço extracelular onde o MEA detecta os níveis de glutamato, permitindo o monitoramento em tempo real da captação de glutamato pelos astrócitos.

Monitoramento de glutamato in vivo em tempo real usando uma matriz de microeletrodos revestidos com enzimas

Descreve-se aqui uma abordagem de rastreio comportamental escalonada que pode ser utilizada para pesquisar compostos que exibem eficácia in vivo sobre comportamentos motores cognitivos e funcionais em modelos de ratinho transgénicos de β-amiloidose e tauopatia. Esses métodos são otimizados para pesquisar compostos para atividades em tarefas de memória de curto prazo e de trabalho.

Avaliação de Alternância Espontânea, Reconhecimento de Objetos Novos e Clasping de Membros em Modelos de Rato Transgênico de Neuropatologia Amilóide-β e Tau

Este documento detalha a utilização do potencial fixo amperométrico gravações usando eletrodos de fibra de carbono e tecnologia enzimática biosensor para medir a liberação de dopamina e glutamato com alta resolução temporal durante o comportamento natural de gratificante na hamster fêmea.

Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Aqui apresentamos um protocolo para medir fluxos in vitro ca2+ em neurônios de cérebro médio e seus efeitos a jusante no caspase-3 usando culturas primárias de cérebro médio do rato. Este modelo pode ser empregado para estudar alterações fisiosiopatológicas relacionadas à atividade anormal do Ca2+ em neurônios do cérebro médio, e para tela de novas terapêuticas para propriedades anti-apoptóticas.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Descrevemos um protocolo para avaliação de curvas dose-resposta para estimulação extracraniana em termos de medidas de campo elétrico cerebral e um biomarcador relevante de fluxo sanguíneo cerebral. Como esse protocolo envolve a colocação invasiva de eletrodos no cérebro, a anestesia geral é necessária, com respiração espontânea preferida em vez de respiração controlada.

Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da...

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Nós estabelecemos modelos do rato de leucomalácia periventricular (LPV), a lesão cerebral predominante em prematuros caracterizada por lesões na substância branca periventricular. Hipóxia / isquemia com / sem infecção sistêmica são as principais causas de LPV. Ligadura da carótida unilateral e exposição a hipóxia com / sem injeção de lipopolissacarídeo cria PVL-como lesões em camundongos P6.

Modelos de mouse de leucomalácia periventricular

Aprenda a medir glutamato tônico e fásico in vivo usando microeletrodos enzimáticos em camundongos transgênicos TauP301L. Este método minimamente invasivo permite monitorar dinâmicas de neurotransmissores em regiões específicas do hipocampo.

Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models

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