Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

O objetivo geral deste protocolo é auxiliar na determinação do tamanho de espumas ou microcargas não reticuladas quimicamente derivadas da matriz extracelular específica de tecidos, para aplicações em modelos de cultura celular in vitro tridimensionais ou como scaffolds pro-regenerativos em sistemas de entrega celular. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de biologia celular aplicada e engenharia de tecidos, como a forma pela qual o microambiente celular tridimensional media a função celular e a regeneração tecidual. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a fabricação de scaffolds com geometrias ajustáveis que mimetizam a composição nativa da MEC específica do tecido e que são estáveis em culturas de longo prazo sem reticulação adicional.

Após liofilizar a MEC derivada do tecido de acordo com o protocolo descrito no texto, use tesoura cirúrgica afiada para picar finamente o tecido descelularizado. Para criomilhar o tecido processado, preencha uma câmara de moagem de aço inoxidável de 25 mililitros para um sistema de moinho de bolas de laboratório com a MEC liofilizada e picada, e adicione duas bolas de moagem de aço inoxidável de 10 mililitros. Feche a câmara de moagem carregada e submerja-a completamente em nitrogênio líquido por três minutos.

Em seguida, moa a amostra congelada a 30 hertz por três minutos. Repita a imersão em nitrogênio líquido e a moagem até que a MEC seja moída em um pó fino. Pese 250 miligramas de MEC picada ou criomoida e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Adicione cinco mililitros de tampão NaH2PO4 22 M ao tubo de centrífuga e marque o nível do líquido no tubo. Em seguida, prepare uma solução estoque de alfa amilase adicionando 7,5 miligramas de alfa amilase a um mililitro de tampão NaH2PO4 22 M. Depois, adicione 100 microlitros da solução estoque de alfa amilase à amostra.

Em seguida, adicione NaH2PO4 22 molar para obter um volume final de 10 mililitros. Agite continuamente a suspensão a 300 RPM e temperatura ambiente por 72 horas. Centrifugue a suspensão a 1500 ×g por 10 minutos.

Colete cuidadosamente e descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet de matriz extracelular digerida. Em seguida, use 10 mililitros de NaCl a cinco por cento diluído em água bidestilada para ressuspender o material em pellet e agite continuamente por 10 minutos a 300 RPM. Repita a lavagem mais duas vezes antes de usar 10 mililitros de água bidestilada para ressuspender o pellet.

Em seguida, agite continuamente a suspensão a 300 RPM à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após centrifugar a amostra novamente, colete e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de matriz extracelular digerida. Adicione ácido acético 2 molar até a marca de cinco mililitros.

E vortex. Em seguida, agite continuamente a suspensão a 120 RPM e 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, utilizando um homogeneizador manual equipado com uma sonda dentada de 10 milímetros de largura, homogeneíze a suspensão de MEC à temperatura ambiente em intervalos de 10 segundos até que não restem fragmentos visíveis.

Coloque a suspensão em um béquer com água fria entre os intervalos de homogeneização para evitar superaquecimento. Incube a suspensão de MEC a 37 graus Celsius com agitação contínua a 120 rpm até que a suspensão esteja morna. Em seguida, use ácido acético 2 molar para diluir a suspensão da amostra até a concentração desejada.

Com uma seringa de três mililitros e uma agulha de 18 calibres, preencha o molde desejado com a suspensão de MEC. Espumas podem ser fabricadas em uma variedade de geometrias, dependendo do formato do molde. Cubra e congele os moldes a menos 20 ou menos 80 graus Celsius.

Em seguida, coloque os moldes em um frasco para liofilizador. Conecte o frasco ao sistema de liofilização do laboratório e seque os moldes por 24 horas ou até completa secagem. Incube a suspensão de ECM criomoida com agitação contínua a 100 rpm durante a noite.

Carregue três mililitros de suspensão de ECM em uma seringa de três mililitros com encaixe luer e acople um conjunto de infusão com asas à abertura da seringa. Fixe a seringa na bomba de infusão. Em seguida, prenda a agulha a um suporte universal e posicione a ponta da agulha verticalmente a uma distância de quatro a seis centímetros do topo de um frasco Dewar de formato baixo.

Em seguida, conecte um eletrodo com grampo de jacaré à ponta da agulha, garantindo também que o grampo de jacaré esteja ligado ao terminal positivo da fonte de alta tensão. Dobre uma tira de folha de alumínio sobre a borda do frasco de vácuo. Em seguida, conecte um segundo eletrodo com grampo de jacaré à borda externa da folha.

Conecte-o ao terminal de terra da fonte de alimentação. Encha o frasco de Dewar com nitrogênio líquido até aproximadamente um centímetro do topo, de modo que três quartos da folha fiquem submersos. Em seguida, ajuste a bomba de seringa para uma taxa de infusão de 30 mililitros por hora e aplique a pulverização eletrostática nas amostras de acordo com o protocolo descrito no texto.

Após a conclusão da infusão, despeje cuidadosamente o excesso de nitrogênio líquido do Dewar, deixando o microcarregador suspenso em aproximadamente 25 mililitros de nitrogênio líquido para garantir que permaneçam congelados. Transfira imediatamente os microcarregadores com o nitrogênio líquido para um tubo de centrífuga de 50 mililitros, despejando em um único movimento contínuo. Em seguida, utilize uma espátula para recolher quaisquer microcarregadores congelados remanescentes no Dewar.

Adicione-os à centrífuga também. Para preparar a liofilização, cubra o tubo de centrífuga com folha de alumínio perfurada com pequenos orifícios. Coloque os tubos de centrífuga cobertos em um frasco de liofilizador.

Em seguida, conecte imediatamente o frasco ao liofilizador e seque as amostras durante a noite. Transfira cuidadosamente a espuma liofilizada para um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo etanol absoluto em excesso. De maneira semelhante, re-suspenda os microcarradores liofilizados em etanol absoluto em excesso dentro do tubo de centrífuga original utilizado para a coleta.

Usando uma pipeta serológica, filtre os microcarregadores por meio de uma peneira de aço inoxidável com tamanho de malha definido para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros para remover quaisquer agregados e selecionar as faixas de tamanho desejadas. Incube a amostra a quatro graus Celsius por quatro horas ou até que a espuma ou os microcarregadores tenham sedimentado no fundo do tubo de centrífuga. Em seguida, sob capela de fluxo laminar e com técnica asséptica, utilize uma pipeta serológica para remover o etanol absoluto dos andamios e adicione etanol 95% em excesso diluído com PBS estéril.

Incube as estruturas em quatro graus Celsius durante quatro horas ou até que as estruturas afundem no fundo do recipiente de reidratação. Reidrate gradualmente as estruturas por meio de uma série de etanol. Em cada etapa, incube as estruturas a quatro graus Celsius até que afundem no fundo do recipiente, antes de trocar a solução.

Substitua o PBS estéril por mais duas lavagens para remover o etanol residual. Armazene as amostras em PBS estéril a 100% a quatro graus Celsius até o momento do cultivo celular. Utilize os scaffolds de uma a duas semanas após a reidratação.

Mostrados aqui estão exemplos dos tipos de espumas e microcarregadores derivados da matriz extracelular (ECM) fabricados utilizando tecido adiposo descelularizado, tecido dérmico descelularizado de suíno e ventrículo esquerdo descelularizado de suíno. Demonstrando que as técnicas podem ser aplicadas para gerar bioescafolds específicos de tecido utilizando uma variedade de tecidos descelularizados como fontes de ECM.

Após criomoinho ou piquetagem, digestão enzimática e homogeneização, as amostras podem ser dispensadas em um recipiente antes da congelação e liofilização. Esta figura representa espumas moídas de DAT, DDT e DLV reidratadas, sintetizadas em um molde de placa de cultura de tecidos de 48 poços. Essas espumas de DAT, DDT e DLV foram fabricadas com ECM criomoido em uma concentração de 35 miligramas por mililitro e uma temperatura de congelamento de menos 80 graus Celsius.

Para fabricar microcargas derivadas da MEC utilizando uma técnica de eletrosspraying, para cada concentração da suspensão de MEC, o calibre da agulha, a taxa de infusão e a voltagem podem ser ajustados para gerar microcargas esféricas discretas, com diâmetro variando de 350 a 500 micrômetros, após reidratação controlada. Por fim, as microcargas de DAT, DDT e DLV mostradas aqui por MEV revelam que a ultraestrutura em tamanho pode variar dependendo da fonte de MEC descelularizada. Os métodos apresentados neste vídeo podem ser utilizados para fabricar uma diversa gama de microcargas e espumas específicas de tecidos, compostas por MEC pura, não ligada quimicamente, utilizando tecido descelularizado como fonte da matriz.

Após esses procedimentos, as espumas e os microcarríeis podem ser semeados com células sob condições estáticas ou dinâmicas e podem ser aplicados como um substrato instrutivo para células em culturas celulares in vitro e em aplicações in vivo.