Name: Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à A. fumigatus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprenda a avaliar a atividade antifúngica de neutrófilos humanos primários e monócitos em tempo real usando conídios fluorescentes de A. fumigatus e microscopia de vídeo de células vivas. Este método permite identificar defeitos na imunidade inata.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo MRC e da Universidade de Aberdeen (MRC Centro de Micologia Médica) e pela Award Estratégico Wellcome Trust - Micologia Médica fúngica Imunologia (SFB, JMB, JK, AW). Um agradecimento especial é dada ao apoio do Fundo Chloe. TMH é apoiado por um subsídio do Instituto Nacional de Saúde (NIH, código RO1 093.808) e do Memorial Sloan Kettering Cancer Center é suportado pelo NIH P30 concessão CA008748. Além disso, TMH é um investigador na patogênese da doença infecciosa apoiado pelo Fundo Burroughs Wellcome. Queremos agradecer a Aberdeen Microscopia e Facility Histologia pela sua ajuda e apoio.

O protocolo para a obtenção de neutrófilos e células mononucleares de sangue periférico (PBMC) é baseada em métodos publicados anteriormente 9. O uso de amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa humana da Universidade de Aberdeen. Antes de começar certifique-se todas as aprovações éticas estão no local para a retirada de sangue de voluntários saudáveis ​​e / ou pacientes com a finalidade do experimento descrito. Manter as células no gelo sempre que possível para aumentar a sua sobrevivência. 1. A. fumigatus Cultura e Condições <ol><li> Prepare meio de ágar mínimo de glucose tal como descrito 10. <ol><li> Ajustar meios para pH 6,5 usando NaOH 1 M e autoclave a 120 ° C durante 20 min. </li><li> Deixa-se arrefecer para 65 ° C. </li><li> Trabalhando numa cara de fluxo estéril, verter 30 mL de meio arrefecido em um frasco T75 e deixa-se arrefecer com o gargalo do frasco que descansa sobre uma pipeta de 25 ml a create uma inclinação agar. </li></ol></li><li> Streak a dsRed Af293- estirpe de A. fumigatus no agar e incubar durante 7 dias a 37 ° C + 5% de CO 2. Dois frascos irá produzir cerca de 10 9 conídios em 5 mL de solução salina de fosfato tamponada (PBS) pré-biotinilação. </li></ol> 2. A. fumigatus e Rotulagem Preparação Nota: Ao realizar este ensaio, pela primeira vez, preparar o parental Af293- estirpe de A. fumigatus. Retirar amostras de ambas as estirpes em tubos de microcentrífuga e etiquetar apenas um de cada estirpe, como descrito abaixo. Isso permitirá que se tenha conídios controle sem cor e conídios com uma única cor, ou dsRed ou AF633, para testar a configuração e equipamentos. <ol><li> Colheita A. fumigatus conidia por imersão da cultura com 30 mL de PBS + 0,05% Tween-80. Filtra-se a suspensão resultante através de um filtro celular de 40? M para um tubo de 50 mL para remover fragmentos de hifas. </li><li> Centrifuge a 805 xg durante 10 min, remover o sobrenadante e lava-se uma vez em 20 ml de PBS estéril. conídios piscina a partir de duas placas da mesma estirpe durante o passo de lavagem. </li><li> Seguindo o passo de lavagem, ressuspender o sedimento em 5 mL de PBS e de transferência de alíquotas de 1 ml de suspensão de conídios em tubos de microcentrífuga. 1 ml de suspensão de cada estirpe é geralmente suficiente para a imagem de células vivas. Enrole as alíquotas restantes na folha e armazenar a 4 ° C. </li><li> alíquotas de centrífuga de suspensão de conídios a 9300 xg durante 10 min à temperatura ambiente e cuidadosamente remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 mL de conídios 0,05 M de NaHCO3, pH 8,3. </li><li> Preparar 10 mg biotina / 200 mL de dimetilsulfóxido solução estoque (DMSO) através da reconstituição de 25 mg de biotina em 500 uL de DMSO. Adicionar 10 uL de biotina / solução de estoque de DMSO ao tubo de microcentruga, a cobertura em folha de alumínio e incuba-se durante 2 horas num agitador rotativo a 4 ° C. <ol><li> Alíquota o restante da biotina / DMSO estoque solution e congelar a -20 ° C para utilização em experiências subsequentes. </li></ol></li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de conídios em 1 mL de Tris-HCl pH 8,0 100 durante 1 h para desactivar biotina livre flutuação. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Lava-se a pelete duas vezes com 1 mL de PBS estéril e ressuspender o sedimento em 1 mL de PBS. </li><li> Dissolve-se 1 mg de estreptavidina-AF633 em 0,5 mL de PBS para fazer uma solução estoque a 2 mg / mL. Adicionar 10 ul de 2 mg / mL de estreptavidina-AF633 por 1 ml de suspensão de conídios e incubar durante 40 min à temperatura ambiente num agitador rotativo coberto de folha de alumínio. O restante Estreptavidina-AF633 pode ser congelada em alíquotas para utilização em experiências subsequentes. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de conídios em 1 mL de PBS e contar os conídios usando um hemocitómetro a uma diluição de 1: 1000 (1: 100 e, em seguida, 01:10). Ajustar a concentração de conídios de 3,6 x 10 6 / mL com CO2 meios independentes, enrole em tiras e armazenar a 4 ° C. NOTA: Os conídios são agora rotulados com AF633 e será referido como conídios FLARE. </li><li> Opcional: Se é necessária a estimulação com conídios inchado, após a contagem de conídios (passo 2.9), dilui-se conídios de 7,2 x 10 6 / mL em base de azoto de levedura meio (YNB) e adicionar 500 uL de suspensão de conídios de 4,5 ml de meio YNB em um autoclave 50 mL Erlenmeyer. Cobrir e colocar o balão em um incubador com agitação (200 rpm a 37 ° C) durante 6 h. <ol><li> Transferir o meio para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 805 xg durante 10 min à temperatura ambiente e lava-se uma vez em PBS. Centrifugar novamente e ressuspender o pellet em 1 ml de CO 2 forma independente, dando 3,6 x 10 6 conídios / ml. Nota: Os conídios frequentemente aglutinar depois que se tornam inchados fazendo preciso contar difícil, é aconselhável para calcular com o counted números de conídios descansando utilizados. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento de neutrófilos humanos, e monócitos <ol><li> Desenhar 20 ml de sangue venoso de voluntários saudáveis ​​em dois tubos de 10 mL de sangue, contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Para cada doador separadamente, verter 20 mL de sangue em um tubo de 50 ml e dilui-se com 15 mL de PBS. </li><li> Subjazia o sangue com 15 mL de uma solução de isolamento de linfócitos (densidade 1,077 g / mL) com uma agulha de seringa e ferro. Coloque a agulha na parte inferior do tubo e suavemente forçar a solução de isolamento de linfócitos para fora. Centrifugar a 630 xg durante 20 min sem travão e baixo aceleração. </li><li> Prepare PBS, arrefecidas em gelo. NOTA: As etapas 3,4 e 3.5 devem ser seguidos simultaneamente para gerar monócitos (3.4) e (3.5) neutrófilos. </li><li> Usando um pastette, colher a camada de PBMC. Esta é a camada no centro entre o soro amarelo (superior) e a solução transparente isolamento dos linfócitos camada (inferior), etransferir para um tubo de 50 ml fresco. <ol><li> Encher o tubo com o PBMC até 50 mL com PBS frio e centrifugar a 582 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e lava-se duas vezes com PBS frio e ressuspender em 1 ml de PBS por 20 ml de sangue de doadores utilizados inicialmente. </li><li> Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com um hemocitómetro. </li><li> Prepara-se uma solução tampão por adição de 26 ml de soro inactivado por calor de vitelo fetal (FCS) e 2,1 mL de EDTA 0,5 M a 500 ml de HBSS. Centrifugar as células durante 10 min a 515 x g e ressuspender em 40 ul de solução tampão por 1 x 10 7 culas. </li><li> Transferir a suspens celular para um tubo de 15 mL e adicionar 10 ul de microesferas de CD14 por 1 x 10 7 culas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C, certificando-se de misturar os tubos a cada 5 min. </li><li> Lave as células por adição de 1 mL de solução tampão por 1 x 10 7 culas e centrifuge a 515 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente até 1 x 10 8 culas em 500 uL de solução tampão. </li><li> Coloque 1 coluna por amostra em um separador magnético de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro lava-se a coluna uma vez com 500 uL de solução tampão. </li><li> Pipetar 500 uL de suspensão de células através da coluna, esperar para a coluna secar e em seguida lavar, repetindo esta três vezes com solução tampão. </li><li> Colocar um novo tubo de 15 mL por baixo da coluna e levar a coluna fora do separador magnético. Em seguida, lavar as células para fora da coluna dentro do tubo com 1 mL de solução tampão. </li><li> Adicionar 4 ml de solução tampão e centrifugar a 515 xg durante 10 min, e em seguida ressuspender em 1 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) médio. </li><li> Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com umhemocitômetro. </li><li> Ajustar a concentração de células de 6 x 10 5 / ml com RPMI e semear 200 mL num prato de imagiologia à base de vidro de 35 mm. Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte, antes da imagem, remover o meio RPMI e adicionar 200 uL de CO 2 forma independente. Nota: Estes monócitos também podem ser diferenciadas em vários subconjuntos de macrófagos antes da imagiologia. Se esta é uma técnica a ser explorada, é um excelente ponto de partida é o artigo recente de Ohradanova-Repic et al. 1 1. </li></ol></li><li> Após a colheita da camada de PBMC, remover todo o soro e a maior parte da solução de isolamento de linfócitos, mas ter cuidado para não remover a pequena faixa branca no topo do sedimento vermelho como esta irá conter a maior parte dos neutrófilos. <ol><li> Preparar um estoque de tampão 10x hipotónico a lise por adição de 83 g de NH4Cl e 10 g de KHCO3 em 1 L de água estéril. Armazenar a 4 °C. </li><li> Diluir esta 10x estoque com água estéril e adicioná-lo aos tubos. Em seguida, inverter cuidadosamente 3 vezes e incubar em gelo durante 15 min. </li><li> Centrifugar a 394 xg durante 10 min e ressuspender em tampão de lise hipotónico durante 10 min em gelo. </li><li> Centrifugar a 394 xg e lavar duas vezes com PBS frio. Ressuspender em 1 ml de CO 2 forma independente por doador. </li><li> Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com um hemocitómetro. </li><li> Por citometria de fluxo, para ajustar a concentração de 6 x 10 5 / ml e adicionar a suspensão de células de 400 ul de uma placa de 24 poços. Para a microscopia, adicionar 200 uL da mesma suspensão de células para uma placa de imagiologia à base de vidro de 35 mm. Nota: imagiologia de Neutrófilos ou citometria de fluxo deve ser iniciado imediatamente devido à sua propensão para sofrer apoptose, se não estimuladas. Se isso não for possível neutrófilos deve ser mantido emgelo e utilizadas o mais rapidamente possível (dentro de um mesmo dia). </li></ol></li></ol> 4. Citometria de Fluxo <ol><li> Adicionar 200 ul de 1,2 x 10 6 / mL conídios ALARGAMENTO para as células na placa de 24 poços, e, em seguida, adiciona-se 100 mL de 20 ug / mL de voriconazol. Adicionar 300 uL de meio RPMI e incubados durante 16 h a 37 ° C com 5% de CO 2. NOTA: O voriconazol é adicionado para evitar a germinação de conídios. </li><li> Adicionam-se 25 uL de uma solução de estoque 1 mM Calcofluor-branco para cada poço para uma concentração final de 25 uM e incubar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Centrifugar a 582 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e lava-se duas vezes com PBS. </li><li> Para colher as células aderentes (monócitos), adicionar 1 ml de PBS com EDTA a 3 mM a cada poço e incubar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2. Com cuidado, lavar as células para fora da placa por pipetagem e recolher células em um tubo. </li><li> Lavar uma vez em tampão de FACS (soro de vitelo fetal a 2% a PBS), e em seguida ressuspender em tampão FACS para análise de FACS. <ol><li> Para a análise FACS, primeiro ajustar os parâmetros de compensação do citetro de fluxo e configurado portões positivos usando tubos de compensação de cor única, incluindo conídios sem cor: dsRed + conídios, AF633 + conídios, e Calcofluor Branco + conídios (gerado como em 4.2). </li><li> Definir porta conídios livre com base em dispersão frontal e lateral usando conídios sem cor. Definir porta célula em dispersão frontal e lateral, excluindo a porta conídios livre. </li><li> Analisar tubo de amostra através da gravação de 10.000 eventos. NOTA: As células associadas com conídios ao vivo será dsRed + e AF633 +. Células associadas com conídios morto será apenas AF633 +. células espectador que não se envolveram conídios será dsRed- e AF633-. As populações de células envolvidos-conídios são ainda analisados ​​por coloração com Calcofluor branco no canal azul do Pacífico. Conídios que permanecem fora das células será calcofluor Branco +, e conídios que foram internalizados seráCalcofluor White-. </li></ol></li></ol> 5. celular Vivo Vídeo Microscopy Nota: A escolha de microscópio dependerá do que estiver disponível localmente, mas a configuração microscópio terá de incluir uma fase invertida, uma câmara ambiental aquecida a 37 ° C e os filtros de excitação / emissão adequados para dsRed (532/561 nm) e AF633 (633 nm). conídios FLARE não funcionam com o laser de 488 nm, em vez do laser 532/561 nm para dsRed. Ao realizar esta experiência para esta primeira vez, utilizar os conídios de controlo sem cor e de cor única para testar para a fluorescência de fundo e a infiltração entre a dsRed e canais AF633. <ol><li> Ligar o aquecedor do microscópio antes da experiência e permitir tempo suficiente para a câmara de controlo do ambiente para aquecer a 37 ° C. O tempo necessário para estabilizar a temperatura da câmara para variará para diferentes configurações do microscópio. </li><li> Ligue o microscópio e computador, e eisanúncio do software de imagem. Monte o prato de imagem no palco microscópio e ajustar o foco para encontrar os neutrófilos ou monócitos humanos. </li><li> Para dsRed e AF633, defina a potência do laser para 10% e tempo de exposição a 1 s nas configurações de aquisição. </li><li> Remover o slide de imagem e adicionar 100 uL de 3 x 10 6 / mL de suspensão de conídios ALARGAMENTO aos poços apropriados (volume total de 300 ul / poço). Anote o tempo que se alargam conídios são adicionados ao prato. </li><li> Devolver o slide para o palco e ajustar a sensibilidade da câmera para dsRed e AF633 para ver claramente os conídios, mas não expor demais a imagem. Configurar uma lista de pontos de estágio se a aquisição multi-ponto é necessária. </li><li> Comece imaginando quando todos os pontos estão em foco, os canais são otimizados e o tempo de ciclo e duração está definida. O tempo de ciclo e a duração da imagem depende da questão experimental. O objectivo é manter o tempo de ciclo tão curto quanto possível (≤2 min) com um min permitindo uma análise em profundidade de UPTdinâmica ake. </li></ol>

<ol><li>Kosmidis, C., Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+spectrum+of+pulmonary+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis.</a> Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).</li>
<li>Warris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+pulmonary+Aspergillus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect%22%5BJournal%5D)">The biology of pulmonary Aspergillus infections.</a> J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).</li>
<li>Henriet, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocytes+kill+Aspergillus+nidulans+by+reactive+oxygen+species-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms.</a> Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).</li>
<li>Sheppard, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methodologies+for+the+determination+of+pulmonary+fungal+burden+in+experimental+murine+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis.</a> Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).</li>
<li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> J Vis Exp. (71), e50196(2013).</li>
<li>Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deploying+FLAREs+to+Visualize+Functional+Outcomes+of+Host-Pathogen+Encounters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1004912(2015).</li>
<li>Jhingran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+conidial+fate+and+measuring+host+cell+antifungal+activity+using+a+reporter+of+microbial+viability+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung.</a> Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).</li>
<li>Espinosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+orchestrate+innate+antifungal+immunity+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung.</a> PLoS Pathog. 10 (2), e1003940(2014).</li>
<li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4427075">Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque.</a> J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).</li>
<li>Shimizu, K., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+involvement+of+a+cAMP-dependent+protein+kinase+in+a+G+protein+signaling+pathway+regulating+morphological+and+chemical+transitions+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans.</a> Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).</li>
<li>Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+monocytes+and+derived+subsets+of+macrophages+and+dendritic+cells+by+the+HLDA10+monoclonal+antibody+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel.</a> Clin Transl Immunology. 5 (1), e55(2016).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este método descreve um inovador método in vitro para estudar a actividade anti-fúngica de fagócitos primários humanos contra A. fumigatus utilizando fluorescente repórter Aspergillus (queimador) conídios, imagens de células vivas e citometria de fluxo. Estudos anteriores demonstraram o valor acrescentado de utilizar ALARGAMENTO conídios tanto in vivo em infecção fúngica experimental murino e avaliação in vitro da imunidade anti-fúngico 6, 7. Combinando ALARGAMENTO conídios com esta técnica de imagem de células vivas próxima geração permite uma configuração para medir a viabilidade de conídios individual durante as interacções dinâmicas in vitro. O método descrito tem o potencial para investigar as funções específicas e importância de certos processos celulares de células imunes em suas respostas antifúngicas. Em adição, as respostas antifúngicas de fagócitos de pacientes que sofrem de específicosdefeitos de componentes individuais definidos no seu sistema imune pode ser avaliado em maior pormenor. Muito respostas antifúngicas primeiros e iniciais podem ser estudadas em grande detalhe ao longo de 6 h de imagiologia contínua. Isto permite que, mesmo para diferenças subtis a ser detectada, tal como a velocidade de migração dos fagócitos para o fungo, as taxas de internalização, dinâmica de eventos fungicidas 12, o que seria indistinguível usando métodos convencionais de fagocitose. Qualquer tipo de célula pode ser usada com este método; os tipos celulares utilizadas aqui foram seleccionados porque estes fagócitos constitui a primeira e segunda linhas de defesa das vias aéreas humanas contra A. fumigatus 13. Curiosamente, as diferenças muito claros pode ser observado entre a forma como monócitos e neutrófilos engatar com conídios de repouso e inchado e hifas. Monócitos dificilmente migram para conídios, enquanto neutrófilos exibir atividade muito mais migratória. mar fluorescente adicionalkers tais como marcadores vivos mortos nas células imunes pode ser incluído no ensaio, para proporcionar perspectivas sobre a sobrevivência de fagócitos seguinte interacções com Aspergillus. Interessantes aplicações potenciais futuras para esta tecnologia incluem a co-cultura de diferentes tipos de células hospedeiras, as consequências para respostas anti-fúngicos (por exemplo, macrófagos sobre uma monocamada epitelial, células dendríticas derivadas de monócitos em conjunto com os neutrófilos), e a medição em tempo real da reactivo produção de espécies de oxigénio ou de neutrófilos formação armadilha extracelular após a estimulação com o Aspergillus. Alguns pontos precisam de ser observado ao utilizar este protocolo, acima de tudo a configuração laboratório necessário: um microscópio com uma fase invertida, uma câmara ambiental estável a 37 ° C, e de excitação / emissão para filtros dsRed (532/561 nm) e AF633 ( 633 nm). A capacidade do microscópio para manter as células em foco e reter a imersão em óleo (particularmente relevante durante multi-ponto aquisição) deve ser monitorizada periodicamente devido à longa duração da imagiologia. Para a quantificação da actividade fungicida citometria de fluxo instalações são necessários. Além disso, aprovações institucionais e éticos apropriados precisam estar no lugar para trabalhar com dador saudável e as amostras de sangue do paciente e fungos derivados geneticamente manipulados. É altamente recomendável para utilizar amostras de sangue fresco (utilização no mesmo dia) para aumentar a viabilidade celular e preservar a funcionalidade. Idealmente, o isolamento de células é realizada imediatamente após a tiragem de amostras de sangue e os neutrófilos são fotografada imediatamente após o isolamento. Em conclusão, uma técnica de imagem de células vivas próxima geração de avaliar em grande actividade antifúngica detalhe fagócitos contra A. fumigatus é descrito. Esta tecnologia pode fornecer uma perspectiva única sobre as interacções celulares-fúngicos individuais no início de defesas imunitárias inatas contra Aspergillus.

Aspergillus fumigatus é um fungo patogénico oportunista e causa fúngica mais comum de infecções pulmonares invasivas no hospedeiro imunocomprometido 1, 2. Entender como as células imunológicas do hospedeiro reconhecer e eliminar Aspergillus é uma importante área de pesquisa de fungos, no entanto, os ensaios de fungicidas atualmente disponíveis têm limitações significativas. Métodos comumente usados para medir a actividade fungicida incluem ensaios colorimétricos e determinação de unidades formadoras de colónias 3, 4. No entanto, tais métodos proporcionam informação sobre a viabilidade fúngica num único ponto de tempo, em vez de visualizar a interacção dinâmica entre hospedeiro e agente patogénico. Por conseguinte, estes métodos não podem ter em conta o facto de um fungo foi eliminado ou simplesmente (temporariamente) restrito em crescimento ou a actividade metabólica. Nós desenvolvemos um método capaz de observar fungiciactividade dal directamente enquanto captura simultaneamente a informação detalhada em relação a fagocitose, a migração dos fagócitos e inibição do crescimento de fungos. Anteriormente, um protocolo foi publicado utilizando imagiologia em tempo real como um meio para medir a fagocitose de Candida albicans por uma linha de células de macrófago de ratinho 5. Este conceito tem sido agora mais desenvolvida para resolver as lacunas de conhecimento em nossa compreensão das interacções Aspergillus com células do sistema imunológico, utilizando conídios 6, 7, 8 fluorescente repórter Aspergillus (queimador). Estes conídios expressar um fluoróforo vermelho (dsRed) e são marcadas com um segundo fluoróforo (Alexa Fluor 633). Uma vez que um conídios FLARE é morto, ele pára de produzir dsRed e os restantes dsRed desaparece, enquanto o AF633 permanece fluorescente e estar vinculado ao conídios. Isso cria uma distinção clara entre fu vivos e mortoscélulas NGAL durante imagens de células vivas e citometria de fluxo, permitindo também o acompanhamento do destino dos conídios indivíduo após a sua interação com células do sistema imunológico. Os ensaios descritos proporcionam um método eficaz de visualizar a interacção entre células do sistema imunológico do hospedeiro e Aspergillus e vai ser de valor considerável no esclarecimento das vias de sinalização celulares responsáveis por mecanismos efectores antifúngicos em células imunitárias inatas. Outras aplicações incluem a visualização como alterações no crescimento de Aspergillus, tais como o interruptor de descanso para os conídios inchado, ou a partir de conídios inchado para hifas, afectar o reconhecimento e função de fagócitos. O protocolo que se segue descreve detalhadamente como a obtenção de monócitos humanos e neutrófilos; como preparar os conídios FLARE; e como capturar suas respostas com vídeo microscopia e citometria de fluxo. Embora a utilização de células imunitárias humanas isoladas a partir de sangue do doador é descrita aqui, estatécnica provou igualmente eficazes usando uma variedade de populações de células de murino.

<table><tbody><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>T75 frasco</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 175</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>10592955</td><td>https://nl.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>40 &micro; m filtro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188 261</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>50 mL Falcon tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>MilliQ</td><td>Millipore</td><td>QGARD00R1</td><td>Nanopure water funciona de forma semelhante. http://www.merckmillipore.com/</td></tr><tr><td>Sondas Moleculares</td> <td>de Biotina</td><td>B-6352</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Streptavidin-AF633</td><td>Sondas Moleculares&nbsp;</td><td>S-21375</td><td>AF633 é o único fluoróforo testado até agora que permanece visível nos fagossomos. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr><tr><td>Tubos de sangue EDTA</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455036</td><td>Qualquer tubo de sangue com um agente anticoagulante deve funcionar. http://www.greinerbioone.com/en/start/</td></tr> <tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>http://www3.gehealthcare.com/</td></tr><tr><td>Azul tripano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV3008401</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>Microesferas CD14</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>Outros métodos de isolamento de monócitos também podem ser usados, preferimos este método, pois proporciona uma pureza alta consistente de monócitos sem ser trabalhoso. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>MS Colunas</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Veja o comentário em microesferas CD14. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>72400-021</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>CO2 meio independente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045054</td><td>Necessário se não houver troca suficiente de CO2 durante a imagem. https://www.thermofisher.com/uk/en/home</td></tr><tr><td>&micro;-slide 8 poços fundo de vidro</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Esta é a placa de imagem que usamos, no entanto, qualquer placa de imagem de vidro de tamanho adequado deve funcionar. Sistema de</td></tr> <tr><td>imagem de células vivas http://ibidi.com/ UltraVIEW VoX 3D</td><td>Perkin Elmer</td><td>L7267000</td><td>Inclui software de volocidade para aquisição e análise. http://www.perkinelmer.com/</td></tr> <tr><td>Calcofluor branco</td><td>Sigma</td><td>18909</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Voriconazol</td><td>Sigma</td><td>PZ0005</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>BD LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citômetro de fluxo usado. https://www.bdbiosciences.com/</td></tr></tbody></table>

imagens ao vivo de antifúngicos atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; a. fumigatus</em

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus é um fungo patogénico oportunista causando infecções invasivas em hospedeiros imunocomprometidos, com uma elevada taxa de letalidade. Investigação investigar respostas imunológicas contra A. fumigatus, foi limitada pela falta de ensaios consistentes e fiáveis para a medição da actividade anti-fúngica de células imunes específicas in vitro. Um novo método é descrito para avaliar a actividade anti-fúngica dos monócitos e neutrófilos primários a partir de dadores humanos contra A. fumigatus utilizando fluorescente repórter Aspergillus conídios (queimador). Estes conídios conter um repórter dsRed geneticamente codificado, que é constitutivamente expressa pela conídios ALARGAMENTO vivo, e são externamente marcadas com Alexa Fluor 633, que é resistente à degradação no interior do fagolisossoma, permitindo assim uma distinção entre os conídios de A. fumigatus vivo e morto. microscopia de vídeo e citometria de fluxo são posteriormente usados ​​para visualizar o Interactião entre conídios e células imunitárias inatas, avaliar a actividade fungicida ao mesmo tempo, proporcionando uma riqueza de informação sobre a migração dos fagócitos, a fagocitose e a inibição do crescimento de fungos. Esta nova técnica já forneceu excitantes novos insights sobre a interação patógeno-hospedeiro de células imunes primárias contra A. fumigatus. É importante notar a configuração laboratório necessário para realizar este ensaio, incluindo a microscopia necessário e citometria de fluxo instalações, e a capacidade para trabalhar com sangue do dador humano e fungos geneticamente manipuladas. No entanto, este ensaio é capaz de gerar grandes quantidades de dados e pode revelar insights detalhados para a resposta anti-fúngico. Este protocolo foi utilizado com êxito para estudar a interacção hospedeiro-patogénio de células imunitárias primárias contra A. fumigatus. É importante observar a configuração de laboratório necessário para executar este ensaio, incluindo a microscopia necessário e citometria de fluxo facilities, e a capacidade para trabalhar com sangue do dador humano e fungos geneticamente manipuladas. No entanto, este ensaio é capaz de gerar grandes quantidades de dados e pode revelar insights detalhados para a resposta anti-fúngico. Este protocolo foi utilizado com êxito para estudar a interacção hospedeiro-patogénio de células imunitárias primárias contra A. fumigatus.

Os resultados representativos são mostrados seguindo o protocolo descrito. A Figura 1 ilustra um vídeo ao vivo de células 6 h representante com neutrófilos humanos e conídios ALARGAMENTO. dsRed (vermelho) é expressa pelos próprios conídios enquanto eles foram rotulados com AF633 (Magenta). A Figura 2 é uma imagem a partir de um único ponto de tempo a partir de um filme semelhante ao exibido na Figura 1, que ilustra a diferença entre os conídios ALARGAMENTO vivo e morto. conídios mortas são distinguidos de conídios ao vivo por perder o seu sinal dsRed (vermelho), mantendo uma fluorescência AF633 brilhante (magenta). A. fumigatus conídios muitas vezes sobreviver dentro fagócitos para mais de 6 h. Portanto, para quantificar de forma eficaz a matar, a citometria de fluxo são mostrados parcelas durante um período de incubação de 16 h na Figura 3. Estes dados foram obtidos com uma ce macrófagos alveolaresA linha ll como um exemplo, mas pode ser realizada com qualquer tipo de célula. Na Figura 4, a migração é mostrado na primeira hora de estimulação para os neutrófilos humanos, bem como a sua velocidade e movimento direccional. A Figura 5 mostra a percentagem de neutrófilos e monócitos que ingeriram 1, 2, 3 ou mais conídios enquanto a Figura 6 mostra o número de conídios que germinam em hifas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig1.jpg" /> Figura 1: Em células vivas, filme microscopia vídeo de neutrófilos humanos e conídios FLARE. Os neutrófilos foram isolados a partir de sangue humano e semearam-se em conjunto com conídios ALARGAMENTO em CO 2 forma independente a uma razão de 1: 3, respectivamente. A visualização foi iniciada directamente a 37 ° C com um microscópio confocal de fiação disco. As imagens foram captadas a intervalos de 1 min e 55 s ao longo de um período de 6 h. Escala da barra = 10 m.Um ampliada em vídeo é mostrado com os canais separados para esclarecer o papel da conídios ALARGAMENTO com DIC no canto superior esquerdo, dsRed (vermelho) no canto superior direito, AF633 (verde) no canto inferior esquerdo e o vídeo incorporada no canto inferior direito . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">Por favor clique aqui para baixar este vídeo.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig2.jpg" /> Figura 2: Imagem ponto de tempo único demonstrando a diferença entre conídios FLARE ao vivo e morto. Os neutrófilos humanos foram estimulados com conídios ALARGAMENTO e fotografada com um microscópio confocal de fiação disco. Uma imagem foi tirada dos filmes gerados. conídios mortas são distinguidos de hifas por ter perdido a sua dsRed (vermelho: superior direito) do sinal, mantendo a sua fluorescência AF633 (verde: inferior esquerdo). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">Por favor clique aqui para</a><html> ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig3.jpg" /> Figura 3: Quantificação e validação de fagocitose e morte de conídios de A. fumigatus. Mouse células de macrófagos alveolares (MH-S) foram incubadas com conídios queima, em uma proporção de 1: 1 durante 16 horas na presença de voriconazol. culas MH-S associados com conídios vivo são mostrados na porta vermelho (+ dsRed AF633 +). culas MH-S associados com conídios mortas são mostrados no portão azul (dsRed-AF633 +). células espectador MH-S estão apresentados na porta de ouro. Calcofluor White, um corante fluorescente de células-impermeável que se liga à parede da célula fúngica, é usado para distinguir os conídios extracelular (Branco Calcofluor +) a partir de conídios intracelular (Calcofluor White-). Como uma validação extra para o método, é mostrado que o tratamento com 2 uM citocalasina D inibe a captação de conídios por culas MH-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg&quot;&gt;Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig4.jpg" /> Figura 4: A migração de neutrófilos humanos, e monócitos contra conídios de A. fumigatus. Os neutrófilos foram isolados a partir de sangue humano e semearam-se em conjunto com conídios ALARGAMENTO em CO 2 forma independente a uma razão de 1: 3, respectivamente. A visualização foi iniciada directamente a 37 ° C com um microscópio confocal de fiação disco. As imagens foram captadas a intervalos de 1 min e 55 s ao longo de um período de 6 horas. Migração de todos os neutrófilos humanos individuais por campo foi manualmente rastreados usando software de rastreamento que descansa contra o (A) e inchada (B) conídios durante 1 h. Os dados representam uma estrutura de células para cada condição do mesmo dador. O factor sinuosos (C), uma medida de directiomovimento nal, e velocidade (D) foram, então, quantificada usando o mesmo software. Média ± SEM para 3 dadores são mostrados com 30 células por doador mais de 2 expericias independentes. *: P &lt;0,05 (teste t de Welch corrigido). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig5.jpg" /> Figura 5: Fagocitose de conídios de A. fumigatus por neutrófilos humanos, e monócitos. Os neutrófilos e os monócitos foram isolados a partir de sangue humano e semearam-se em conjunto com conídios ALARGAMENTO em CO 2 forma independente a uma razão de 1: 3, respectivamente. A visualização foi iniciada directamente a 37 ° C com um microscópio confocal de fiação disco. As imagens foram captadas a intervalos de 1 min e 55 s ao longo de um período de 6 h. Fagocitose foi medida como a quantidade de células contêming ALARGAMENTO conídios após 4 h de estimulação. Os dados são apresentados como média ± EPM de 3 dadores e 3 quadros por doador mais de 2 expericias independentes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig6.jpg" /> Figura 6: Inibição da germinação de A. fumigatus conidia por neutrófilos e monócitos. Os neutrófilos e os monócitos foram isolados a partir de sangue humano e semearam-se em conjunto com conídios ALARGAMENTO em CO 2 forma independente a uma razão de 1: 3, respectivamente. A visualização foi iniciada directamente a 37 ° C com um microscópio confocal de fiação disco. As imagens foram captadas a intervalos de 1 min e 55 s ao longo de um período de 6 horas. A inibição da germinação dos fungos foi examinado através da medição da percentagem de conídios que tinha germeinated após 2, 4 e 6 h de co-cultura. Os dados são apresentados como média ± EPM de 3 dadores e 3 quadros por doador mais de 2 expericias independentes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a atividade antifúngica de células imunes humanas primárias em tempo real usando fluorescente Aspergillus repórter conídios em conjunto com microscopia de vídeo ao vivo de células e citometria de fluxo. Dados gerados fornecer informações sobre hospedeiras cell- interacções Aspergillus tais como actividade fungicida, a fagocitose, a migração de células e inibição do crescimento de fungos.

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a atividade antifúngica de células imunes humanas primárias em tempo real, utilizando conídios repórter fluorescentes de Aspergillus e microscopia de vídeo de células vivas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre as respostas imunes contra infecções fúngicas em populações específicas de pacientes, particularmente a resposta imune inata que ocorre precocemente após a exposição a fungos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser utilizada para identificar defeitos específicos na imunidade inata e antifúngica, como fagocitose, migração celular, morte celular e inibição do crescimento fúngico.Para começar, plaqueie a linhagem de aspergillus fumigatus AF293, portadora do gene repórter fluorescente dsRed, em ágar preparado em dois frascos T75. Incube os cultivos a 37 graus Celsius, 5%CO2 por sete dias para obter aproximadamente 10 elevado à 9ª conídios. Após a incubação, imerja os cultivos em 20 mililitros de PBS com 0,05% de Tween 80 e colete os conídios de A fumigatus.Em seguida, utilizando um filtro celular de 40 micrômetros, filtre as suspensões resultantes em um tubo de 50 mililitros para remover fragmentos hifais. Após a filtração das suspensões, centrifugue-as a 805 vezes G por 10 minutos. Descarte então os sobrenadantes e re-suspenda os pellets em 20 mililitros de PBS estéril.Por fim, reúna as amostras e centrifugue a suspensão resultante mais uma vez. Reuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS e transfira alíquotas de um mililitro da suspensão de conídios obtida para tubos de microcentrífuga. Centrifugue as alíquotas a 9.300 × g, em temperatura ambiente, durante 10 minutos.Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet de conídios em um mililitro de bicarbonato de sódio 0,05 molar com pH de 8,3. Para marcar os conídios, adicione 10 microlitros da solução estoque de biotina ao tubo de microcentrífuga, cubra a amostra com papel alumínio e incube por duas horas em um agitador a quatro graus Celsius. Após centrifugar a amostra marcada com biotina por 10 minutos a 9.300 ×g, remova cuidadosamente o sobrenadante.Em seguida, re-suspenda o pellet de conídios em um mililitro de uma solução de Tris-HCl 100 micromolar com pH de 8,0. Incube esta suspensão a quatro graus Celsius por uma hora com agitação suave para desativar a biotina não ligada. Centrifugue a amostra a 9.300 ×g por 10 minutos.Remova cuidadosamente o sobrenatante resultante, lave o pellet com um mililitro de PBS estéril e reconstitua o pellet em um mililitro de PBS. Em seguida, adicione 10 microlitros de uma solução estoque de Streptavidina-AF633 a um mililitro da suspensão de conídios. Incube esta suspensão, coberta com papel alumínio, por 40 minutos à temperatura ambiente em um agitador rotativo.Centrifugue a amostra a 9.300 × g por 10 minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet de conídios em um mililitro de PBS. Usando um hemocitômetro, conte os conídios em uma diluição de 1 para 1.000 e, então, ajuste a concentração de conídios para 3,6 × 10⁶ conídios por mililitro com meio independente de CO₂.Por fim, envolva a suspensão com papel alumínio e armazene a quatro graus Celsius. Colete e dilua uma amostra de sangue humano com PBS. Em seguida, use uma seringa com agulha de ferro para subcamadear a amostra de sangue com 15 mililitros de um meio para isolamento de células mononucleares.Centrifugue a amostra a 630 vezes G durante 20 minutos sem freio e com aceleração baixa. Colete com uma pipeta de Pasteur a camada central de PBMC localizada entre o soro amarelo e a camada transparente de solução de isolamento de linfócitos. Em seguida, transfira a suspensão coletada para um novo tubo de 50 mililitros.Dilua os PBMC com PBS para obter 50 mililitros da suspensão e lave as células. Após a lavagem, misture 20 microlitros da suspensão celular com 160 microlitros de PBS e 20 microlitros de azul de tripano e conte as células utilizando um hemocitômetro. Após a contagem, dilua até uma concentração apropriada em um tubo de 15 mililitros, centrifugue as células por 10 minutos a 515 × g e, em seguida, re-suspenda-as utilizando 40 microlitros de uma solução tampão por 1 × 10⁷ células.Adicione 10 microlitros de MicroBeads CD14 por um vezes 10 à 7ª potência de células e misture bem. Incube a amostra a quatro graus Celsius por 15 minutos, certificando-se de misturar o tubo a cada cinco minutos. Após a conjugação, lave as células com um mililitro da solução tampão por um vezes 10 à 7ª potência de células e centrifugue a suspensão a 515 vezes G por 10 minutos.Em seguida, re-suspenda até um vezes 10 à oitava potência de células em 500 microlitros da solução tampão. Monte uma coluna que será usada com uma única amostra em um separador magnético seguindo as instruções do fabricante e lave a coluna uma vez com 500 microlitros da solução tampão. Adicione 500 microlitros da suspensão celular na coluna.Após secar, lave a coluna três vezes usando solução tampão. Coloque um novo tubo de 15 mililitros sob a coluna e desconecte a coluna do separador magnético. Em seguida, utilizando um mililitro de solução tampão, elua as células da coluna para dentro do tubo.Lave e ressuspenda as células eluídas em meio RPMI. Após ajustar a densidade celular para seis vezes 10 à 5ª células por mililitro, semeie 200 microlitros da suspensão em uma placa de imagem com base de vidro de 35 milímetros. Incube a cultura durante a noite a 37 graus celsius com 5%CO2.Para isolar neutrófilos, remova todo o soro e a maior parte da solução de isolamento de linfócitos da amostra de sangue restante após a coleta de PBMCs. Certifique-se de não remover a fina camada branca localizada acima do pellet vermelho. Mantendo as células no gelo, lise os glóbulos vermelhos e centrifugue os neutrófilos remanescentes a 394 vezes G. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS frio e, então, ressuspenda em um mililitro de meio independente de CO2.Para citometria de fluxo, ajuste a densidade celular para seis vezes 10 à 5ª células por mililitro e adicione 400 microlitros da suspensão celular a uma placa de 24 poços. Adicione 200 microlitros da mesma suspensão celular a uma placa de imagem com fundo de vidro de 35 milímetros para exame microscópico. Para visualizar dsRed e Alexa Fluor 633 durante a microscopia, pré-aqueça o aquecedor do microscópio e ligue o microscópio e o computador.Em seguida, adicione 100 microlitros de suspensão de conídios FLARE a três vezes 10 à 6ª por mililitro nos poços apropriados da placa de imagem. Registre o horário em que os conídios FLARE são adicionados. Coloque a placa de imagem na platina do microscópio e, nas configurações de aquisição, ajuste a potência do laser para 10% e o tempo de exposição para um segundo.E ajuste a sensibilidade da câmera para obter uma imagem nítida, mas não superexposta, de dsRed e AF633, e configure uma lista de pontos de estágio. Inicialize a aquisição de imagens quando todos os pontos estiverem em foco, os canais de fluorescência estiverem otimizados e o tempo de ciclo e a duração forem definidos. São apresentadas aqui imagens obtidas durante um cultivo simultâneo de neutrófilos e conídios FLARE.O sinal fluorescente verde correspondente à marcação com AF633 é visível em conídios vivos e mortos. Enquanto a fluorescência de dsRed pode ser observada exclusivamente em conídios vivos. Assim, dentre todos os conídios detectados, apenas aqueles simultaneamente marcados com ambos os corantes e visíveis como pontos magenta são vivos.A fagocitose e a eliminação de conídios de A fumigatus co-cultivados com células de macrófagos alveolares de camundongo foram quantificadas utilizando citometria de fluxo. Na análise, os macrófagos espectadores são marcados com um quadrante laranja, enquanto os macrófagos associados a conídios mortos e positivos apenas para a marcação com AF633 são mostrados dentro do quadrante azul. Além disso, os conídios mortos não revelam coloração com calcoflúor branco, indicando sua localização intracelular.Conídios vivos marcados com dsRed e AF633 são identificados por um portão vermelho; esses conídios também são internalizados por células de macrófagos, conforme evidenciado pela redução da marcação com calcoflúor branco. Por fim, foi avaliada a influência de A. fumigatus na migração de neutrófilos humanos, revelando aumento no movimento e na velocidade dessas células imunes em resposta a conídios inchados, em comparação com conídios em repouso. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em oito horas para uma única população celular.Durante a realização deste procedimento, é importante lembrar-se de manter suas células sobre gelo. Após este procedimento, outros métodos, como a medição de espécies reativas de oxigênio ou citocinese, podem ser realizados para fornecer informações adicionais sobre a resposta imune inata antifúngica na mesma população celular. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de imunologia fúngica explorarem a fagocitose e a eliminação antifúngica utilizando patógenos fúngicos em células imunes primárias.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar em tempo real as respostas imunes inatas antifúngicas de células imunes humanas primárias, utilizando conídios marcadores fluorescentes de Aspergillus e microscopia de vídeo em células vivas. Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano pode ser perigoso e que precauções adequadas de EPI sempre devem ser tomadas para prevenir a transmissão de infecções.

live-imaging-antifungal-activity-human-primary-neutrophils-monocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

Este vídeo demonstra imagens de células vivas para a análise da atividade antifúngica em neutrófilos humanos usando conídios repórteres fluorescentes de Aspergillus. Inicialmente, a fluorescência vermelha e magenta é detectada dentro dos neutrófilos, enquanto a fluorescência vermelha diminui com o tempo, indicando a degradação dos conídios e confirmando a atividade antifúngica dos neutrófilos.

Avaliação em tempo real da atividade antifúngica de células imunes humanas primárias

Descrevemos métodos para live-célula vídeo de...

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Defensinas de plantas desempenham um papel importante nas defesas vegetais contra patógenos. Para uma utilização eficaz destes peptides antifúngicos como agentes antifúngicos, compreender seus modos de ação (MOA) é crítica. Aqui, um método de imagem de viver-pilha é descrito para estudar aspectos críticos do MOA destes peptides.

Imagem latente da viver-pilha de células fúngicas para investigar os modos de entrada e localização Subcellular da planta antifúngico defensinas

Este protocolo fornece um método rápido e confiável para medir quantitativamente a fagocitose de Aspergillus fumigatus conidia por phagocitos primários humanos usando citometria de fluxo e para discriminar a fagocitose da conidia de mera adesão a leukócitos.

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

Os protocolos aqui descritos fornecem um guia para visualizar e quantificar a atividade de proteases neutrófilos na escarro humana. As aplicações dessa análise abrangem desde a avaliação de tratamentos anti-inflamatórios, até validação de biomarcadores, triagem de medicamentos e grandes estudos clínicos de coorte.

Monitoramento de Elastase e Cathepsin G Atividade em Amostras de Espiuma Humana

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.

Bainhas de milho destacadas para imagens de células vivas da infecção por patógenos fúngicos foliares de milho

Aprenda a avaliar a atividade antifúngica de neutrófilos humanos primários e monócitos em tempo real usando conídios fluorescentes de A. fumigatus e microscopia de vídeo de células vivas. Este método permite identificar defeitos na imunidade inata.

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à

Explorar mais vídeos