Name: Análise de terminação da transcrição Usando Approach (TRO) específico BrUTP vertente Transcrição Run-on (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprenda a análise da terminação da transcrição em leveduras usando o método TRO específico de fita com BrUTP. Esta técnica permite distinguir polimerases transcritoras de mRNA de polimerases transcritoras pervasivas em Saccharomyces cerevisiae.

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Pesquisa no laboratório de Ansari foi financiada pela bolsa de pesquisa (No. MCB 1020911) da National Science Foundation.

NOTA: Este método foi utilizado no artigo de investigação relatada em Medler, S e Ansari, A. 2. 1. Cultivar e colheita das células <ol><li> Iniciar um mL de cultura de células em meio YPD (10 g de extracto / L de levedura, 20 g / L de peptona, 2% de dextrose) 5 a partir de uma placa de Saccharomyces cerevisiae recentemente riscada. </li><li> Deixar crescer as células durante a noite num agitador orbital a 30 ° C e 250 rpm. </li><li> Dilui-se a cultura crescida durante a noite a 100 vezes para um volume final de 100 ml em meio YPD num frasco de 250 mL confundido. NOTA: Um total de 100 mL de cultura é necessária por reacção TRO; Se forem necessárias várias reacções, deve ser usado um maior volume de cultura. </li><li> Crescer as células até uma densidade óptica de 0,8-1,0 a 600 nm (A 600 ~ 0,8-1,0). </li><li> Colher as células por centrifugação a 820 xg durante 5 min a 4 ° C num tubo cónico de 50 mL estéril. </li><li> Ressuspender as células em 10 mL de gelo frio de bu TMNffer (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, MgCl2 5 mM, NaCl 100 mM) e incuba-se em gelo durante 5 min. </li><li> Centrifuga-se a 820 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar as células. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. </li></ol> 2. permeabilização e preparação de células para Run-on Assay <ol><li> Ressuspender as células em 1 ml de solução de sarcosil a 0,6% por pipetagem para cima e para baixo suavemente usando um truncada P 1,000 ponta. Transferir a suspensão de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL gelada. </li><li> Agitar suavemente as células a 4 ° C durante 25 min num agitador de plataforma. NOTA: tubos de microcentrífuga deve ser embalado num tubo cónico de 50 mL com gelo para manter a temperatura a frio, evitando a possibilidade de quaisquer novos eventos de iniciação que ocorrem no promotor nesta fase. </li><li> Centrifugar as células a 1200 x g durante 6 min a 4 ° C utilizando uma mesa de centrifugação refrigerada. </li><li> Com cuidado, aspirar o sobrenadante para remover qualquer excesso de líquido da permeabilized sedimento celular. </li></ol> 3. Transcrição Run-on Reaction <ol><li> Adicionar 150 uL de transcrição run-em tampão (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, KCl 100 mM, MgCl2 10 mM, 2 mM de DTT (ditiotreitol), 0,75 mM de cada um de ATP, CTP, GTP, e BrUTP, 200 U de RNase inibidor) para a pelete de células permeabilizadas. </li><li> Misture suavemente pipetando para cima e para baixo usando um truncada P 200 ponta. NOTA: Se o processamento de várias amostras, manter tudo em gelo até que todas as amostras estão prontos e em seguida, avance para a próxima etapa. </li><li> Incubar durante 5 min a 30 ° C num banho de água. NOTA: Ajustar o tempo de incubação entre 1 a 5 minutos para assegurar a incorporação óptimo de BrUTP no ARN nascente. </li><li> Parar a reacção por adição de 500 ul de reagente de isolamento de ARN de pronto-para-uso frio. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li></ol> 4. Extracção de ARN <ol><li> Adicionar 200 mL de pérolas de vidro lavadas com ácido para a célula suspensiem (passo 3.4) e agitar vigorosamente durante 20 min a 4 ° C num misturador de vórtice. </li><li> Perfurar o fundo do tubo de microcentrífuga utilizando uma agulha 22 G quente e colocá-lo na parte superior de um tubo cónico de 15 mL estéril. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 1 min a 4 ° C para recolher o lisado celular. Transferir o lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 500 uL de reagente de isolamento de ARN a frio e 200 ul de clorofórmio ao lisado celular. Misturar os conteúdos num misturador de vortex e centrifugar a 16168 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrifugação. </li><li> Adicionar um volume igual de fenol a frio / clorofórmio / álcool isoamílico (125: 24: 1) pH 4-5. Agita-se vigorosamente em um misturador de vórtice e centrifugar a 16168 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir a fase contendo ARN aquosa superior para um novo tubo de microcentrifugação. Repita o passo 4.6 mais duas vezes. </li><li> Para a fase aquosa contendo o ARN final, adicionar 5 M de NaCl stocK para obter uma concentração final de 0,3 M. Adicionar 3 vezes o volume de etanol frio para precipitar o ARN. <ol><li> Incubar durante 1 hora ou durante a noite a -20 ° C. NOTA: Execute os passos 4.9 - 4.11, enquanto as contas anti-BrdU estão sendo incubadas para bloquear (veja o passo 5.3). </li></ol></li><li> Centrifuga-se a 16168 xg durante 20 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de ARN em 100 mL de DEPC (dietilpirocarbonato) água. </li><li> Usar um isolamento Mini Kit RNA para separar o ARN dos nucleótidos não incorporados BrUTP. Elui-se o ARN a partir da coluna com 100 mL de água isenta de RNase. </li><li> Incubar o ARN em um banho de água a 65 ° C durante 5 min e, em seguida, transferidos para o gelo durante pelo menos 2 min. </li></ol> 5. Afinidade de purificação de ARN marcado com BrUTP <ol><li> A 25 mL de anti-BrdU resolvido grânulos, adicionar 500 mL de 0,25x SSPE (Sodium Saline Fosfato EDTA) tampão de ligação (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4 </sub&gt;, 0,02 M de EDTA, pH 7,4, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween, NaCl a 37,5 mM). Centrifuga-se a 200 xg durante 30 s a 4 ° C e remover o sobrenadante. </li><li> Repita o passo 5.1 três vezes. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de bloqueio (1 x tampão de ligação, 0,1% de polivinilpirrolidona, 1 mg ultra-pura de albumina de soro bovino (BSA)) às pérolas e agitar suavemente durante 1 - 2 h a 4 ° C num agitador de plataforma. </li><li> Lavam-se as esferas duas vezes mais com 500 uL de tampão de ligação, tal como descrito na etapa 5.1. </li><li> Adicionar 400 ul de tampão de ligação para os grânulos. </li><li> Transferir 100 uL de ARN (a partir do passo 4.11) directamente para os grânulos. Incubar, com agitação suave durante 1 - 2 h a 4 ° C num agitador de plataforma. </li><li> Lava-se a grânulos sequencialmente com 500 uL de tampão de ligação, a 500 mL de tampão de sal baixo (SSPE 0,2x, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween), 500 mL de tampão de sal elevado (0,25x SSPE, 1 mM de EDTA, 0,05% de Tween, 100 mM de NaCl), e duas vezes com 500 ul de tampão TE 1X (TET, 0,05% de Tween), que giram na200 xg durante 30 s a 4 ° C entre cada lavagem. </li><li> Elui-se o ARN BrUTP rotuladas de grânulos sequencialmente, duas vezes com 150 ul e uma vez com 200 ul de tampão de eluição (20 mM de DTT, 150 mM de NaCl, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, SDS a 0,1%), por incubação durante 4 min a 42 ° C num banho de água, seguida por uma breve centrifugação para separar os grânulos a partir do sobrenadante. </li></ol> 6. A precipitação do ARN BrUTP Labeled <ol><li> Adicionar 500 uL de frio de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (125: 24: 1) pH 4-5 para a afinidade purificado BrUTP ARN marcado. Misturar num misturador de vortex e centrifugar a 16168 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrifugação. </li><li> Adicionar estoque 5 M de NaCl para obter uma concentração final de 0,3 M e 3 vezes o volume de etanol frio para precipitar o ARN. </li><li> Incubar a -20 ° C durante a noite. </li><li> Recolhe-se o ARN precipitado por centrifugação a 16168 xg durante 30 min a 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Remover o sobrenadante e permitir que o sedimento seco ao ar durante 10 min. </li><li> Ressuspender o sedimento de ARN em 26 jil de água com DEPC. </li><li> Determinar a concentração final de ARN através da medição da absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. Além disso, determinar a proporção 260/280. Um rácio ~ 2 é indicativa de uma amostra de ARN puro. </li><li> Armazenar as amostras de RNA em alíquotas a -80 ° C até ser necessário para a síntese de cDNA. </li></ol> 7. transcrição reversa do RNA BrUTP marcado <ol><li> Ajustar a concentração de RNA para 100 ng / mL utilizando água DEPC. Use 0,5 ug de ARN por cada reacção de síntese de cDNA. NOTA: A concentração de molde de ARN pode variar de 0,5 a 1,0 ug a alcançar a síntese de cDNA óptimo. </li><li> Realizar a transcrição reversa do ARN utilizando vários iniciadores reversos concebidos a jusante do local (local de terminação) de poli (A), como mostrado na Figura 3A. </li><li> Para cada reacção de transcrição reversa, adicionam-se 5 ul de ARN TemplatE (0,5 g), 1 uL de mistura de dNTP (10 mM cada), 2 uL do iniciador reverso C, D, E, F ou G (50 ^ M cada) (ver Figura 3A) e água isenta de nuclease. O volume reaccional final em cada tubo é de 13 pL. NOTA: O número de reacções de transcrição inversa dependerá do número de iniciadores reversos usados ​​para a síntese de cDNA. Por exemplo, para ASC1 foram utilizados cinco iniciadores reversos e por isso cinco reacções de transcrição inversa foram criadas. Rotular os tubos como C, D, E, F e G na base do iniciador inverso utilizado para a síntese de cDNA. </li><li> Incubar os tubos contendo uma cadeia molde de ARN, de mistura de dNTP e iniciadores num termociclador a 65 ° C durante 5 min para remover qualquer conformação estrutural secundária, e depois arrefece-se a 4 ° C durante pelo menos 2 min. </li><li> Adicionar 1 ml de transcriptase reversa (200 U / mL), tampão 4 uL e 2 ul de DTT 0,1 M a cada tubo contendo o molde de ARN e iniciador (passo 7.4). Misture com cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Realizar a transcrição reversa através da incubação da mistura de reacção num termociclador a 42 ° C durante 60 min. </li><li> Inactivar a transcriptase reversa a 65 ° C durante 20 min. </li><li> Armazenar o cDNA a -20 ° C ou prosseguir para o próximo passo. </li></ol> 8. A amplificação de ADNc <ol><li> Realizar a reacção de PCR para a amplificação de cada preparação de ADNc (marcada C, D, E, F e G para ASC1) do passo 7.8 do seguinte modo: Molde 3.0 ADNc uL do passo 7.8, 1.0 ul iniciador directo B (10 uM), 1,0 uL iniciador C reversa ou tampão de PCR 10x polimerase D ou e ou F ou G (10? M), 2,5 mL, 0,5 uL de mistura de dNTP (10 mM cada), 1,0 mL de MgCl 2 (2,5 mM), 15,5 mL de PCR água grau de pureza, e 0,5 uL enzima polimerase termoestável. NOTA: diferentes diluições de molde de ADNc que vão desde 1: 5 a 1: 100 devem ser testados para optimizar o rendimento do produto de PCR. Um iniciador directo único promotor proximal será utilizada para amplificar o ADNcobtidos utilizando diferentes iniciadores inversos. Por exemplo, um único iniciador B para a frente localizado perto do promotor foi usado em combinação com cinco iniciadores reversos de C para G para ASC1. BC, BD, BE, BF BG e foram usadas em tubos etiquetados como C, D, E, F e G, respectivamente, como mostrado na Figura 3A. </li><li> Executar o PCR, utilizando os seguintes parâmetros de ciclos térmicos: um ciclo de 95 ° C durante 2 min (de arranque a quente para a activação da polimerase), 30 - 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s (desnaturação), 54 ° C durante 15 s (recozimento) , 68 ° C durante 1 min (extensão), e um ciclo de 68 ° C durante 5 min (extensão final). NOTA: A temperatura de recozimento pode variar dependendo dos iniciadores específicos a ser utilizado e a extensão de tempo irá variar, dependendo do tamanho esperado do produto. </li><li> Separa-se o produto de PCR por electroforese em 0,8%, 1,5%, ou de 2% de agarose géis dependendo do tamanho esperado do produto. </li><li> Quantificar o produto de PCR como descrito em El Kaderi et ai. , 2012 11. NOTA: Como alternativa, usar estratégia em tempo real de RT-qPCR para quantificar a quantidade de transcritos nascentes. </li></ol>

<ol><li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li>
<li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586(2015).</li>
<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
<li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disengaging+polymerase%3A+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li>
<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo TRO específica de cadeia usada aqui foi adaptado do protocolo utilizado para análise GRO-seq (Global Run On-Sequencing) em células de mamíferos 12. Nós com sucesso modificado o protocolo para estudar a transcrição nascente na brotação levedura. Para analisar especificamente o defeito terminação da transcrição, nós ajustamos o protocolo ainda mais por se livrar da etapa de hidrólise RNA. Isto permitiu-nos detectar especificamente o comprimento transcrições completas nascentes que inici...

O ciclo de transcrição eucariótica consiste em três etapas principais; iniciação, alongamento e terminação. A terminação de transcrição por ARN-polimerase II consiste de dois distintos, passos 3 interdependentes. O primeiro passo envolve a clivagem, poliadenilação e de libertação de ARNm a partir do molde, e é imediatamente seguida por uma segunda etapa, marcada por desengate da polimerase a partir do modelo. Terminação adequada é crucial para a reciclagem da polimerase durante o início / reinício da transcrição, para evitar a interferência com a transcrição dos genes a jusante, e para manter a transcrição aberrante em cheque, limitando a transcrição de penetrante não codificante de ARN 4, 5. Apesar dos avanços recentes, a terminação é, de longe, o passo menos entendida do ciclo de transcrição de ARN polimerase II. Um ensaio fiável terminação é essencial para o estudo do mecanismo de underlying terminação da transcrição por ARN-polimerase II in vivo. Um número de abordagens experimentais são utilizados para detectar o defeito um gene de terminação de transcrição de forma activa sob condições fisiológicas. Estes incluem Northern blot, Chip fator de terminação (imunoprecipitação da cromatina) e no ensaio de TRO tradicional. Cada uma destas técnicas tem algumas vantagens e desvantagens. O ensaio TRO tradicional costumava ser a abordagem mais confiável e sensível para a detecção de um defeito de terminação da transcrição in vivo 1. Este ensaio localiza as moléculas de polimerase transcricionalmente activos em diferentes regiões de um gene dentro da célula. Sob condições normais, o ensaio mostra moléculas de polimerase de transcrição engajadas rigorosamente distribuídas entre a região do promotor e terminador do gene (Figura 1A). Após o término com defeito, no entanto, a polimerase é incapaz de ler o sinal de terminaçãoe é detectado na região a jusante da extremidade 3 &#39;do gene (Figura 1B). Um defeito de terminação da transcrição é manifestada na presença de uma polimerase de sentido-transcrição que iniciada a partir da região do promotor proximal, e sendo incapaz de ler o sinal de terminação, continua a transcrição da região a jusante da extremidade 3 &#39;de um gene, como mostrado na figura 2A. Com a constatação de que o genoma eucariota exibe a transcrição generalizada esmagadora no sentido, bem como indicações anti-senso e em torno de um gene 6, 7, 8, 9, 10, logo ficou claro que o ensaio TRO tradicional não pode detectar se o sinal de polimerase a jusante de um gene representa uma transcrição iniciada pelo promotor (Figura 2A) ou um ARN aberrante que iniciou Somewhere no meio do gene ou a jusante do elemento terminador (Figura 2B), ou a polimerase de transcrição no sentido anti-sentido a partir da extremidade 3 &#39;do gene (Figura 2C). O ensaio específico de cadeia TRO usando BrUTP descrito aqui pode distinguir se o sinal de polimerase readthrough observada representa ARNm com sentido alargado iniciada pelo promotor ou um transcrito anti-sentido que iniciou a jusante do gene sob exame. Temos utilizado com sucesso esta abordagem para demonstrar o papel da Kin28 quinase na terminação da transcrição em brotamento levedura 2. Empregando a abordagem aqui vamos mostrar que Rna14 é necessária para a terminação da transcrição de ASC1 em brotamento levedura.

<table><tbody><tr><td>Mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td>pH 4-5</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase, placenta humana</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU grânulos</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>New England Biolabs</td><td>M03368L</td><td>ou uma enzima equivalente</td></tr><tr><td>Advantage 2 polimerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>ou uma enzima equivalente</td></tr><tr><td>5-Bromouridina 5' trifosfato de sódio sal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino ultrapura (BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>Asc1 F</td><td></td><td></td><td>CTATGGAATGGGGGTTTTAAG</td></tr><tr><td>Asc1 G</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5' 5s reverso</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3' 5s reverso</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

análise de terminação da transcrição usando approach (tro) específico brutp vertente transcrição run-on

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Este manuscrito descreve um protocolo para a detecção de defeito de transcrição de terminação in vivo. O protocolo de TRO específica de cadeia simples usando BrUTP descrito aqui é uma poderosa abordagem experimental para analisar o defeito de terminação da transcrição sob condições fisiológicas. Tal como o ensaio de TRO tradicional, baseia-se na presença de uma polimerase de transcricionalmente activos para além da extremidade 3 &#39;do gene como um indicador de um defeito de transcrição de terminação 1. Ela supera dois principais problemas encontrados com o ensaio TRO tradicional. Em primeiro lugar, ele pode detectar se a polimerase de leitura através do sinal de terminação é a que iniciou a transcrição a partir da região do promotor proximal, ou se é simplesmente que representa uma polimerase pervasively transcrição que iniciou não especificamente a partir de um lugar no corpo ou a 3 &#39; terminal do gene. Em segundo lugar, pode distinguir se o sinal de polimerase transcricionalmente activo para além doa região do terminador é verdadeiramente a polimerase de ARNm transcrever readthrough sentido ou um sinal de ARN anti-sentido não codificante iniciou-terminador. Em resumo, o protocolo envolve a permeabilização das células de levedura em crescimento exponencial, permitindo que os transcritos que iniciados in vivo para alongar na presença do nucleótido BrUTP, purificando o RNA BrUTP marcado pela abordagem de afinidade, transcrição reversa do ARN nascente purificada e amplificando o cDNA usando iniciadores específicos de cadeia que flanqueiam a as regiões de terminação do gene promotor e 2.

Para demonstrar a aplicabilidade do procedimento TRO-específica BrUTP-fio na detecção de um defeito de terminação da transcrição, foi utilizado um mutante de terminação-defeituoso, sensível à temperatura de RNA14 chamado rna14-1. O papel de Rna14 na terminação de transcrição por ARN-polimerase II foi demonstrada utilizando o ensaio de TRO tradicional que detectado RNA na região do terminador-proximal de genes seleccionados 1. O sinal de detecção ...

Descrevemos uma abordagem experimental básica para análise da terminação da transcrição pela RNA polimerase II in vivo usando BrUTP pela abordagem run-on de transcrição específica da fita (TRO) em leveduras de brotamento. Este protocolo pode ser estendido para estudar a terminação da transcrição por outras RNA polimerases tanto em leveduras quanto em eucariotos superiores.

Análise de terminação da transcrição Usando Approach (TRO) específico BrUTP vertente Transcrição Run-on

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a terminação da transcrição pela RNA polimerase para levedura em brotamento sob condições in vivo pela transcrição específica da fita executada na abordagem. Este método ajuda a responder à questão-chave de saber se a polimerase transcricionalmente ativa detectada além das três extremidades primárias do gene é aquela iniciada a partir da região promotora. A principal vantagem deste método é que ele pode distinguir uma polimerase transcrita de MRNA de uma polimerase transcrita de forma generalizada que iniciou transcrições e estará nas três extremidades primas do gene.Esta técnica pode ser estendida para estudar a terminação da transcrição por outras RNA polimerases e leveduras devido à natureza conservante da terminação por diferentes polimerases. Embora este método possa fornecer informações sobre o papel preciso dos fatores de terminação no ciclo de transcrição da levedura, ele também pode ser estendido para estudar a terminação em eucariotos superiores. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a permeabilização celular e a transcrição executada em paradas, pois requerem uma execução cuidadosa, e os transcritos nascentes também podem ser difíceis de purificar.Tivemos a ideia para este método pela primeira vez a partir da abordagem de busca GRO, que fornece um instantâneo de todo o genoma da posição das polimerases transcricionalmente ativas de uma maneira específica da fita. A demonstração visual deste método é crítica, pois a execução da transcrição e a purificação do RNA são difíceis de realizar devido à baixa quantidade e natureza instável dos transcritos nascentes. Antes de iniciar a transcrição, execute a reação, cultive, colha e permeabilize células de levedura de crescimento exponencial, para obter uma paleta de células permeabilizadas.Para iniciar a reação, adicione 150 microlitros de transcrição executada em tampão à paleta de células permeabilizadas. Usando uma ponta P-200 truncada, misture delicadamente pipetando para cima e para baixo. Coloque a amostra no gelo.Depois que todas as amostras tiverem sido ressuspensas na execução da transcrição em tampão, incubar as amostras por cinco minutos a 30 graus Celsius em banho-maria. Pare a reação adicionando 500 microlitros de reagente de isolamento de RNA pronto para uso a frio a cada amostra. Incube por cinco minutos em temperatura ambiente.Comece o procedimento de extração de RNA adicionando 200 microlitros de esferas de vidro lavadas com ácido a cada suspensão celular e agitando vigorosamente em um misturador de vórtice por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após 20 minutos, use uma agulha quente de calibre 22 para perfurar o fundo de cada tubo de microcentrífuga e coloque o tubo no topo de um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Centrifugue a 300 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius e transfira o lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Adicione 500 microlitros de reagente de isolamento de RNA frio e 200 microlitros de clorofórmio ao lisado celular. Misture o conteúdo no misturador de vórtice e centrifugue a 16, 168 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.Adicione um volume igual de álcool isoamílico de fenol clorofórmio frio. Agitar vigorosamente no misturador de vórtice e centrifugar a 16 168 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Transferir a fase aquosa superior contendo o ARN para um novo tubo de microcentrífuga.Adicione um volume igual de álcool isoamílico de fenol clorofórmio frio, vórtice e centrifugue novamente. Ao RNA final contendo a fase aquosa, adicione um volume apropriado de um estoque de cloreto de sódio de cinco molares para obter uma concentração final de 0,3 molar. Adicione três vezes o volume de etanol frio para precipitar o RNA.Incube por uma hora, ou durante a noite, a 20 graus Celsius. Quando a precipitação de RNA estiver concluída, centrifugue a 16, 168 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e ressuspenda a paleta de RNA em 100 microlitros de água DEPC.Use um kit de isolamento de RNA para separar o RNA dos nucleotídeos de trifosfato de bromouridina não incorporados e eluir o RNA da coluna com 100 microlitros de água livre de RNAse. Incube o RNA em banho-maria a 65 graus Celsius por cinco minutos. E depois transfira para o gelo por pelo menos dois minutos.Inicie este procedimento preparando as esferas anti-bromo DU enquanto o RNA está sendo precipitado. Para cada amostra, adicione 500 microlitros de tampão de ligação EDTA de fosfato salino de sódio 0,25 X a 25 microlitros de grânulos sedimentados. Centrifugue a 200 vezes G por 30 segundos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante.Lave as contas três vezes com o tampão de encadernação. Depois de remover o sobrenadante da terceira lavagem, adicione 500 microlitros de tampão de bloqueio aos grânulos e agite suavemente por uma a duas horas a quatro graus Celsius em um agitador de plataforma. Lave as contas mais duas vezes com 500 microlitros de tampão de ligação.Remova o sobrenadante da segunda lavagem e adicione 400 microlitros de tampão de ligação aos grânulos. Transfira 100 microlitros de RNA diretamente para as contas. Incubar com agitação suave durante uma a duas horas a quatro graus Celsius num agitador de plataforma.Gire a 200 vezes G por 30 segundos a quatro graus Celsius e depois remova o sobrenadante. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de ligação às contas. Gire a 200 vezes G por 30 segundos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante.Desta forma, lave os grânulos sequencialmente com tampão de ligação, tampão com baixo teor de sal, tampão com alto teor de sal e duas vezes com tampão TET. Para eluir o RNA marcado com trifosfato de bromouridina das contas, adicione 150 microlitros de tampão de eluição e incube por quatro minutos a 42 graus Celsius em banho-maria. Gire para baixo brevemente e colete o sobrenadante.Desta forma, eluir sequencialmente duas vezes com 150 microlitros e uma vez com 200 microlitros de tampão de eluição. Cerca de 500 microlitros de RNA marcado com trifosfato de bromouridina purificado por afinidade devem ser obtidos de cada amostra. Para precipitar o RNA marcado com trifosfato de bromouridina purificado por afinidade, adicione 500 microlitros de álcool isoamílico clorofórmio de fenol frio a cada amostra.Vórtice e centrífuga a 16, 168 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione o volume apropriado de um estoque de cloreto de sódio de cinco molares para obter uma concentração final de 0,3 molar.Em seguida, adicione três vezes o volume de etanol frio. Incube a 20 graus Celsius durante a noite para precipitar o RNA. No dia seguinte, coletar o RNA precipitado por centrifugação a 16.168 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius.Retire o sobrenadante e deixe a paleta secar ao ar durante 10 minutos. Ressuspenda a paleta de RNA em 26 microlitros de água DEPC. Determine a concentração final de RNA medindo a absorbância a 260 nanômetros usando um espectrofotômetro.Armazene as amostras de RNA e alíquotas a 80 graus Celsius até que sejam necessárias para a síntese de cDNA. A transcrição específica da fita de trifosfato de bromouridina executada na abordagem foi usada para testar a exigência de RNA 14 para o término da transcrição do gene ASC1 em leveduras em brotamento. O RNA marcado com trifosfato de bromouridina do mutante RNA 14-1 e suas células isogênicas do tipo selvagem foi purificado e transcrito reversamente com os primers C, D, E, F e G. O cDNA correspondente foi amplificado por PCR usando os pares de primers B e C, B e D, B e E, B e F e B e G, e fracionado em géis de agarose.A presença de produtos amplificados por PCR dos pares de primers B e E, B e F e B e G no mutante reflete um fenótipo de leitura de terminação. Nas células do tipo selvagem, no entanto, a transcrição executada no sinal foi limitada até o elemento terminador e não houve transcrição detectável executada no sinal além da região terminadora. Este gráfico mostra a quantificação dos géis com cinco RNA S como controle de normalização.A detecção de transcritos nascentes iniciados pelo promotor que leem o sinal de terminação no mutante, mas não nas células do tipo selvagem, confirma que o RNA 14 é um fator de terminação. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a transcrição executada na reação é fundamental para obter um resultado bem-sucedido.Seguindo este procedimento, outros métodos, como a busca de GRO, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o papel de um fator na terminação em todo o genoma. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da transcrição explorarem a terminação por outras RNA polimerases em leveduras e sistemas eucarióticos superiores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a transcrição, executar reações e purificar transcrições rotuladas nascentes.Não se esqueça de que o RNA pode ser extremamente instável e precauções como usar luvas, manter a temperatura em torno de quatro graus Celsius e usar agentes livres de RNAse devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

analysis-termination-transcription-using-brutp-strand-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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