Análise de terminação da transcrição Usando Approach (TRO) específico BrUTP vertente Transcrição Run-on

O objetivo geral deste procedimento é estudar a terminação da transcrição pela RNA polimerase para levedura em brotamento sob condições in vivo pela transcrição específica da fita executada na abordagem. Este método ajuda a responder à questão-chave de saber se a polimerase transcricionalmente ativa detectada além das três extremidades primárias do gene é aquela iniciada a partir da região promotora. A principal vantagem deste método é que ele pode distinguir uma polimerase transcrita de MRNA de uma polimerase transcrita de forma generalizada que iniciou transcrições e estará nas três extremidades primas do gene.

Esta técnica pode ser estendida para estudar a terminação da transcrição por outras RNA polimerases e leveduras devido à natureza conservante da terminação por diferentes polimerases. Embora este método possa fornecer informações sobre o papel preciso dos fatores de terminação no ciclo de transcrição da levedura, ele também pode ser estendido para estudar a terminação em eucariotos superiores. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a permeabilização celular e a transcrição executada em paradas, pois requerem uma execução cuidadosa, e os transcritos nascentes também podem ser difíceis de purificar.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez a partir da abordagem de busca GRO, que fornece um instantâneo de todo o genoma da posição das polimerases transcricionalmente ativas de uma maneira específica da fita. A demonstração visual deste método é crítica, pois a execução da transcrição e a purificação do RNA são difíceis de realizar devido à baixa quantidade e natureza instável dos transcritos nascentes. Antes de iniciar a transcrição, execute a reação, cultive, colha e permeabilize células de levedura de crescimento exponencial, para obter uma paleta de células permeabilizadas.

Para iniciar a reação, adicione 150 microlitros de transcrição executada em tampão à paleta de células permeabilizadas. Usando uma ponta P-200 truncada, misture delicadamente pipetando para cima e para baixo. Coloque a amostra no gelo.

Depois que todas as amostras tiverem sido ressuspensas na execução da transcrição em tampão, incubar as amostras por cinco minutos a 30 graus Celsius em banho-maria. Pare a reação adicionando 500 microlitros de reagente de isolamento de RNA pronto para uso a frio a cada amostra. Incube por cinco minutos em temperatura ambiente.

Comece o procedimento de extração de RNA adicionando 200 microlitros de esferas de vidro lavadas com ácido a cada suspensão celular e agitando vigorosamente em um misturador de vórtice por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após 20 minutos, use uma agulha quente de calibre 22 para perfurar o fundo de cada tubo de microcentrífuga e coloque o tubo no topo de um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Centrifugue a 300 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius e transfira o lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Adicione 500 microlitros de reagente de isolamento de RNA frio e 200 microlitros de clorofórmio ao lisado celular. Misture o conteúdo no misturador de vórtice e centrifugue a 16, 168 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.

Adicione um volume igual de álcool isoamílico de fenol clorofórmio frio. Agitar vigorosamente no misturador de vórtice e centrifugar a 16 168 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Transferir a fase aquosa superior contendo o ARN para um novo tubo de microcentrífuga.

Adicione um volume igual de álcool isoamílico de fenol clorofórmio frio, vórtice e centrifugue novamente. Ao RNA final contendo a fase aquosa, adicione um volume apropriado de um estoque de cloreto de sódio de cinco molares para obter uma concentração final de 0,3 molar. Adicione três vezes o volume de etanol frio para precipitar o RNA.

Incube por uma hora, ou durante a noite, a 20 graus Celsius. Quando a precipitação de RNA estiver concluída, centrifugue a 16, 168 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e ressuspenda a paleta de RNA em 100 microlitros de água DEPC.

Use um kit de isolamento de RNA para separar o RNA dos nucleotídeos de trifosfato de bromouridina não incorporados e eluir o RNA da coluna com 100 microlitros de água livre de RNAse. Incube o RNA em banho-maria a 65 graus Celsius por cinco minutos. E depois transfira para o gelo por pelo menos dois minutos.

Inicie este procedimento preparando as esferas anti-bromo DU enquanto o RNA está sendo precipitado. Para cada amostra, adicione 500 microlitros de tampão de ligação EDTA de fosfato salino de sódio 0,25 X a 25 microlitros de grânulos sedimentados. Centrifugue a 200 vezes G por 30 segundos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante.

Lave as contas três vezes com o tampão de encadernação. Depois de remover o sobrenadante da terceira lavagem, adicione 500 microlitros de tampão de bloqueio aos grânulos e agite suavemente por uma a duas horas a quatro graus Celsius em um agitador de plataforma. Lave as contas mais duas vezes com 500 microlitros de tampão de ligação.

Remova o sobrenadante da segunda lavagem e adicione 400 microlitros de tampão de ligação aos grânulos. Transfira 100 microlitros de RNA diretamente para as contas. Incubar com agitação suave durante uma a duas horas a quatro graus Celsius num agitador de plataforma.

Gire a 200 vezes G por 30 segundos a quatro graus Celsius e depois remova o sobrenadante. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de ligação às contas. Gire a 200 vezes G por 30 segundos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante.

Desta forma, lave os grânulos sequencialmente com tampão de ligação, tampão com baixo teor de sal, tampão com alto teor de sal e duas vezes com tampão TET. Para eluir o RNA marcado com trifosfato de bromouridina das contas, adicione 150 microlitros de tampão de eluição e incube por quatro minutos a 42 graus Celsius em banho-maria. Gire para baixo brevemente e colete o sobrenadante.

Desta forma, eluir sequencialmente duas vezes com 150 microlitros e uma vez com 200 microlitros de tampão de eluição. Cerca de 500 microlitros de RNA marcado com trifosfato de bromouridina purificado por afinidade devem ser obtidos de cada amostra. Para precipitar o RNA marcado com trifosfato de bromouridina purificado por afinidade, adicione 500 microlitros de álcool isoamílico clorofórmio de fenol frio a cada amostra.

Vórtice e centrífuga a 16, 168 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione o volume apropriado de um estoque de cloreto de sódio de cinco molares para obter uma concentração final de 0,3 molar.

Em seguida, adicione três vezes o volume de etanol frio. Incube a 20 graus Celsius durante a noite para precipitar o RNA. No dia seguinte, coletar o RNA precipitado por centrifugação a 16.168 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Retire o sobrenadante e deixe a paleta secar ao ar durante 10 minutos. Ressuspenda a paleta de RNA em 26 microlitros de água DEPC. Determine a concentração final de RNA medindo a absorbância a 260 nanômetros usando um espectrofotômetro.

Armazene as amostras de RNA e alíquotas a 80 graus Celsius até que sejam necessárias para a síntese de cDNA. A transcrição específica da fita de trifosfato de bromouridina executada na abordagem foi usada para testar a exigência de RNA 14 para o término da transcrição do gene ASC1 em leveduras em brotamento. O RNA marcado com trifosfato de bromouridina do mutante RNA 14-1 e suas células isogênicas do tipo selvagem foi purificado e transcrito reversamente com os primers C, D, E, F e G. O cDNA correspondente foi amplificado por PCR usando os pares de primers B e C, B e D, B e E, B e F e B e G, e fracionado em géis de agarose.

A presença de produtos amplificados por PCR dos pares de primers B e E, B e F e B e G no mutante reflete um fenótipo de leitura de terminação. Nas células do tipo selvagem, no entanto, a transcrição executada no sinal foi limitada até o elemento terminador e não houve transcrição detectável executada no sinal além da região terminadora. Este gráfico mostra a quantificação dos géis com cinco RNA S como controle de normalização.

A detecção de transcritos nascentes iniciados pelo promotor que leem o sinal de terminação no mutante, mas não nas células do tipo selvagem, confirma que o RNA 14 é um fator de terminação. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a transcrição executada na reação é fundamental para obter um resultado bem-sucedido.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como a busca de GRO, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o papel de um fator na terminação em todo o genoma. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da transcrição explorarem a terminação por outras RNA polimerases em leveduras e sistemas eucarióticos superiores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a transcrição, executar reações e purificar transcrições rotuladas nascentes.

Não se esqueça de que o RNA pode ser extremamente instável e precauções como usar luvas, manter a temperatura em torno de quatro graus Celsius e usar agentes livres de RNAse devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.