Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

O objetivo geral deste procedimento é determinar a estrutura de complexos macromoleculares por análise de partícula única de dados de criomicroscopia eletrônica usando o software de processamento de imagem SPHIRE. O crio-EM de partícula única está se tornando uma tecnologia convencional para estudar estruturas de macromoléculas em resolução quase atômica. O SPHIRE é um novo pacote de software que permite o processamento semiautomatizado de dados crio-EM de maneira amigável.

A principal vantagem do SPHIRE é o mecanismo de validação automática. A maioria dos procedimentos precisa ser executada apenas uma vez, e os resultados são objetivos e reprodutíveis. O crio-EM de alta resolução pode ser usado para colocar resíduos individuais, fornecendo assim informações cruciais sobre a organização e a função de máquinas micromoleculares complexas.

Indivíduos novos neste método devem ter em mente que a obtenção de uma estrutura de alta resolução depende muito da qualidade da amostra e dos dados de entrada. Para começar a usar o aplicativo SHIRE, abra a GUI no terminal. Abra os UTILITÁRIOS para exibir uma imagem de criomicroscopia com e2display.

Use a ferramenta de medição integrada para medir o eixo de partícula mais longo em angstrom por pixel. Abra as configurações do projeto. Defina o tamanho da janela CTF para pelo menos o tamanho da caixa de partículas.

Defina o tamanho da caixa de partículas para um número par, pelo menos 1 1/2 vezes o diâmetro da partícula. Defina o raio da partícula para pelo menos metade do comprimento medido. Insira a simetria do grupo de pontos, se conhecida, e a massa molecular aproximada.

Registre as configurações. Em seguida, no menu FILME, abra o alinhamento de vídeo do Micrograph. Defina os caminhos de arquivo executáveis unblur e summovie.

Escolha um filme de micrografia não alinhado bruto e substitua a variável de nome de arquivo por um curinga para definir o padrão de caminho da micrografia de entrada. Nomeie o diretório de saída. Preencha o número de quadros de filme, a tensão do microscópio e a exposição por quadro.

Execute o processo para gerar micrografias médias com correção de movimento ponderadas e sem ponderação. Em seguida, abra o menu CTER e selecione Estimativa de CTF. Defina as micrografias de dose não ponderada como entrada.

Nomeie o diretório de saída e preencha os parâmetros de coleta de dados. Defina a frequência mais baixa para 0285 angstroms inversas e a frequência mais alta para 0,285 angstroms inversas. Execute o processo para gerar uma lista de parâmetros CTF.

Em seguida, abra o menu JANELA e selecione Seleção de partículas. Defina as micrografias ponderadas por dose como entrada e inicie o utilitário e2boxer. Execute a separação de partículas manual ou automaticamente.

Extraia as partículas selecionadas em pilhas de imagens e combine as pilhas em uma única pilha de imagens virtuais em um banco de dados BDB. Depois que as partículas forem selecionadas e empilhadas, abra o menu ISAC e selecione Agrupamento 2D do ISAC. Defina a pilha de imagens virtuais no banco de dados BDB como a entrada.

Estime o número de imagens por classe. Preencha os parâmetros restantes e gere as médias das classes 2D. Quando a classificação 2D estiver concluída, use o utilitário Exibir dados para exibir as médias de classe reproduzíveis validadas.

Verifique se várias orientações de partículas estão representadas e se as médias das classes são de qualidade satisfatória. Gere uma nova pilha de imagens virtuais contendo apenas partículas pertencentes às médias de classe validadas. Em seguida, abra o menu VIPER e use o utilitário Exibir dados para visualizar as médias das classes.

Exclua as médias de classe de baixa qualidade ou mostrando vistas idênticas da partícula. Salve as médias de classe restantes em um novo arquivo. Em seguida, selecione Modelo 3D inicial RVIPER e use a pequena seleção de médias de classe como entrada.

Execute o comando para gerar um modelo 3D reproduzível inicial da proteína. Inspecione o modelo no programa de gráficos moleculares Chimera. Compare o modelo com uma estrutura conhecida de uma proteína homóloga ou domínio da proteína de interesse.

Retorne ao menu VIPER no SPHIRE e selecione Criar referência 3D. Gere um modelo de referência 3D inicial com o tamanho de pixel correto e uma máscara 3D. Abra o menu MERIDIEN e selecione Refinamento 3D.

Preencha a pilha de imagens de entrada e os caminhos iniciais do arquivo de referência 3D. Nomeie o diretório de saída e defina a máscara do modelo de referência como a máscara 3D. Selecione Aplicar máscara 2D rígida.

Defina a resolução inicial para entre 20 e 25 angstroms e execute o refinamento 3D para produzir os meios-volumes não filtrados. Em seguida, veja em meio volume não filtrado em Quimera. Determine um limiar de binarização no qual todas as densidades de proteínas estão conectadas, mas os artefatos de ruído não.

Retorne ao menu MERIDIEN do SPHIRE e abra a Máscara 3D adaptativa. Insira a entrada de meio volume não filtrada e o limite de binarização. Nomeie a máscara de saída e execute o processo para gerar uma máscara 3D de bordas suaves.

Em seguida, abra Nitidez e selecione os dois semivolumes não filtrados. Defina a máscara 3D de meio volume de borda suave como a máscara fornecida pelo usuário. Execute o processo que mescla os meios-volumes e, em seguida, filtra e aprimora o volume mesclado.

Abra o arquivo de log para exibir a estimativa de resolução final. Gere um mapa 3D da distribuição angular de partículas da pilha de imagens de entrada gerada durante o refinamento 3D. Abra o modelo 3D nítido e filtrado no Chimera.

Inspecione o mapa de densidade e seus recursos de alta resolução. Abra a distribuição angular em Quimera e verifique se os ângulos de Euler são distribuídos isotropicamente. Abra o menu SORT3D e selecione Estimativa de variabilidade 3D.

Gere um mapa de variabilidade 3D a partir da pilha virtual de imagens de partículas pertencentes às médias de classe validadas. Gere uma máscara 3D binarizada a partir deste mapa de variabilidade para o agrupamento 3D focado subsequente. Em seguida, abra o RSORT3D de agrupamento 3D e selecione o diretório do refinamento 3D anterior como entrada.

Nomeie o diretório de saída e defina as máscaras 3D globais e focadas. Use pelo menos 5.000 a 10.000 imagens por grupo para grandes conjuntos de dados. Execute o processo de classificação para gerar volumes de cada grupo 3D homogêneo.

Use o Chimera para identificar a estrutura com a resolução aparente mais alta. Retorne ao menu SORT3D no SPHIRE e abra o Refinamento de subconjunto local. Defina o caminho do arquivo de texto do subconjunto para o arquivo de agrupamento de ID de partícula correspondente à estrutura de resolução mais alta.

Defina o diretório de refinamento 3D para o diretório que contém os meios-volumes não filtrados e a iteração de reinicialização para a iteração de resolução mais alta do refinamento 3D anterior. Execute o comando para gerar meios-volumes locais não filtrados. Em seguida, crie uma máscara 3D de bordas suaves a partir de um dos meios-volumes locais.

Mescle os meios-volumes locais e aprimore o volume mesclado sem aplicar um filtro passa-baixa. Em seguida, abra o menu LOCALRES e clique em Resolução Local. Selecione os meios-volumes locais.

Em seguida, selecione a máscara de borda suave local. Defina a resolução geral para a resolução absoluta estimada ao aumentar a nitidez do volume local mesclado. Calcule a resolução local do volume.

Em seguida, abra o Filtro Local 3D. Defina o volume local não filtrado nítido como entrada. Selecione o mapa de resolução local e a máscara 3D de bordas suaves.

Aplique o filtro de resolução local ao volume nítido para produzir o modelo 3D final. Abra o volume resultante e o mapa de resolução local no Chimera. Inicie a ferramenta Cor da superfície e escolha o volume no menu e a opção de colorir a superfície de acordo com a resolução local.

O complexo de toxinas TcdA1 foi visualizado por criomicroscopia. Todas as imagens mostraram partículas únicas claramente discerníveis e anéis Thon estendendo-se a uma resolução de mais de quatro angstroms no espectro de potência. As partículas foram selecionadas usando e2boxer e, em seguida, foram extraídas em uma pilha de imagens.

As médias de classe bidimensionais foram geradas por alinhamento e agrupamento iterativo estável, ou ISAC. Essas médias de classe foram usadas para calcular um modelo 3D reprodutível com RVIPER. Este modelo concordou bem com a estrutura cristalina previamente resolvida de TcdA1.

O refinamento 3D automático deste modelo usando MERIDIEN gerou uma resolução quase atômica map. 3D análise de variabilidade indicou flexibilidade localizada da região terminal N marcada com histidina, os domínios de ligação ao receptor e o domínio de ligação a TcB. Foram realizados cálculos de resolução local.

O modelo nítido foi filtrado localmente e uma escala de cores correspondente à resolução local foi aplicada, mostrando concordância topológica entre áreas de alta variabilidade e áreas de baixa resolução. A estrutura crio-EM final de resolução de 3,5 angstrom de TcdA1 mostrou densidades claras para a maioria das cadeias laterais. Um mapa de densidade com esse nível de detalhe pode ser usado para a construção de modelos atômicos de novo.

Usando essa abordagem, uma estrutura de resolução quase atômica pode ser obtida em horas ou alguns dias, sem informações estruturais a priori. Ao tentar este procedimento, use apenas dados de alta qualidade e verifique os resultados intermediários. A heterogeneidade composicional e estrutural da amostra crio-EM pode ser um fator limitante para atingir uma resolução quase atômica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter agora uma boa compreensão de como usar o SPHIRE para determinação estrutural crio-EM. Como você viu, as rotinas de agrupamento incluídas no SPHIRE permitirão que você não apenas resolva a estrutura da proteína de interesse, mas também estude a dinâmica conformacional e forneça uma visão mecanicista crucial sobre mecanismos moleculares complexos.