Name: Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas Mycobacterium tuberculosis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprenda a gerar agregados de macrófagos infectados por Mycobacterium tuberculosis em placas de 96 poços para testes de suscetibilidade a drogas. Este método simples e compatível com BSL-2 recapitula barreiras de penetração celular fisiológicas, produzindo resultados mais preditivos da eficácia in vivo.

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Agradecemos ao Dr. Frank Wolschendorf pelo acesso ao leitor automatizado de placas de imagem Cytation 3. Este trabalho foi financiado em parte pela concessão R01-AI104499 do NIH para OK. Partes do trabalho foram realizadas nas instalações do UAB CFAR e pelo UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, que são financiados pelo NIH/NIAID P30 AI027767 e pelo NIH 5P30 AR048311.

NOTA: Como M. tuberculosis mc 2 6206 é uma estirpe avirulenta 17, 18, todo o trabalho neste protocolo pode ser realizada em uma instalação de segurança biológica 2 Nível (BSL-2). 1. As condições de cultura para Green Fluorescent Protein Expressando M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb GFP) NOTA: O M. tuberculosis H37Rv derivado auxotróf ica estirpe MC 6206 2 (Δ PANCD, Δ leuCD) transformada com o plasmídeo que expressa GFP pMN437 é utilizado ao longo deste protocolo 16. É possível substituir a tensão Mtb-GFP com não expressando GFP do tipo selvagem tensão para permitir mais fácil acessibilidade da estirpe para os investigadores. No entanto, a expressão da GFP é desejável para permitir a confirmação visual da fagocitose e formação de agregados de M. tuberculosis / macrófagos. para lonarmazenagem a longo prazo g, Mtb -GFP foram congeladas a -80 ° C em meio completo (7H9 descritos no passo 1.1) suplementado com 20% de glicerol. <ol><li> Prepare completa meios de Mtb -GFP (7H9-C), completando 7H9 meio com 10% de Middlebrook OADC, 0,02% de tiloxapol, 24 ug / mL de ácido D-pantoténico, 50 ug / ml de L-leucina e 50 ug / ml de higromicina B. </li><li> Descongelar um frasco de Mtb -GFP e adicionar a 10 ml de 7H9-C num frasco de PETG fundo rectangular 30 mL. </li><li> Incubar a 37 ° C num agitador rotativo (50 rpm). Tome as medições de densidade óptica (DO 600) todos os dias até DO600 atinge 1.0 (aproximadamente 5-8 dias). </li><li> Diluir e da cultura passagem como necessário para manter um OD 600 entre 0,2-1,0. </li><li> Para a infecção, utilizar uma cultura estabelecida de Mtb -GFP dentro da fase de crescimento logarítmico (DO600 de 0,6-1). Para evitar culturas aglomerada, sonicar o frasco de cultura de M. tuberculosis num banho de água (130 W; 3 x 5 s pulsos) ONCe ou duas vezes por semana </li></ol> 2. Condições de cultura para As células THP-1 <ol><li> Prepare completa meios de células THP-1 (meio RPMI-C), completando meio RPMI 1640 com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino, 2 mM de L-glutamina, e 10 mM de HEPES. </li><li> Incubar as células em um frasco T-75 a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou por citometria de fluxo em dias alternados e manter as células THP-1 a uma densidade entre 0,1-0600000 por mL. </li></ol> 3. Infecção protocolo para gerar estruturas Mtb / macrófagos agregadas <ol><li> THP-1 preparação de células (por placa de 96 poços) <ol><li> Centrífuga 7 X 10 6 células THP-1 a 250 xg durante 5 min. Ressuspender em 7 mL de meio RPMI-C. </li></ol></li><li> Preparação Mtb -GFP <ol><li> Centrifugar 2,8 x 10 8 Mtb -GFP a 3200 xg durante 5 minutos numa centrifuga-L baldecantar uma conversão de OD 600 1.0 = 3 x 10 8 bactérias / mL. </li><li> Lavar uma vez com RPMI-C e centrifuga-se tal como no passo 3.2.1. </li><li> Ressuspender em 7 mL de meio RPMI-C e agitar com vortex durante 10 s. </li></ol></li><li> Infecção Nota: Consulte a Figura 1 para modelo. <ol><li> Prepara-se uma placa de 96 cavidades por adição de 200 uL de água estéril em filas A e H e as colunas 1 e 12 para um aro de água para evitar a evaporação do meio de cultura. </li><li> Adicionar 200 uL de RPMI-C para a coluna 2 (B2 para G2) para o controlo de fundo (em branco). </li><li> Para infectar, adicione suspensão Mtb -GFP (passo 3.2) para suspensão de células THP-1 (passo 3.1) e misture bem por pipetagem. A densidade de células THP-1 final é de 5 x 10 5 por ml e a multiplicidade correspondente de infecção é de 40. </li><li> Verter a suspensão de células THP-1 / Mtb -GFP em um reservatório de 25 ml. </li><li> Adicionar 200 mL de THP-1 / suspensão Mtb -GFP a todos os 96 poços restantes (B3 através G11) usinga pipeta multi-canal. NOTA: Se múltiplos que trabalha com placas de 96 poços, ressuspender regularmente a restante suspensão de células THP-1 / Mtb no reservatório para assegurar uma mistura uniforme é adicionado a cada poço. </li><li> Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 7-10 dias. </li><li> Mudar meios a cada 2 dias, removendo-se lentamente 100 ul meios gasto a partir do topo de cada poço e suavemente adicionando 100 ul de RPMI pré-aquecido-C utilizando uma pipeta multi-canal. Não ressuspender poços e perturbar os agregados de Mtb / macrófagos no fundo dos poços. </li><li> Examine visualmente os poços por microscopia de fluorescência (objetiva 4-10x) diariamente, tomando nota do tamanho do Mtb agregados / macrófagos. Por dia 10/07, Mtb agregados / macrófagos deve ser suficientemente grande (consulte a Figura 2 para referência) para prosseguir para testes de eficácia da droga (Seção 4). </li><li> Se desejado, capturar imagens dos 96 poços utilizando um sistema de imagem de células automatizado equipadocom o campo luminoso e filtro GFP define para documentar a formação de agregados Mtb / macrófagos. NOTA: Se os usuários não têm acesso a um sistema de imagem automatizado, imagens de poços representativos podem ser tomadas utilizando qualquer microscópio apropriado com capacidades de GFP e de campo brilhante. </li></ol></li></ol> 4. Crescimento Ensaio de Inibição de Avaliação de Drogas eficácia contra Mtb Derivado do Mtb / macrófagos Agregados <ol><li> Preparação de drogas (em triplicado condições para duas drogas) NOTA: Ver Figura 1A para o modelo. <ol><li> Numa placa de 96 poços separada, adicionar 125 uL de meios de 7H9-C para B2 através de G10. </li><li> Preparar dois fármacos com o dobro da maior concentração final desejada em 1 ml de 7H9-C para dar conta da diluição no passo 4.2.4. </li><li> Adicionar 250 uL de cada fármaco aos poços B11-C11-D11 e E11-F11-G11, respectivamente, para tratamentos em triplicado. </li><li> Usando uma pipeta multi-canal, em série dilute os fármacos de teste de duas vezes por movendo 125 mL de B11-G11-G10 em B10. Misturar por pipetagem de 5 vezes em cada passo. </li><li> Continuar a mover-se 125 uL da coluna a coluna (direita para a esquerda) do outro lado da placa, e depois de parar a coluna 4. </li><li> Depois de se misturar coluna 4, descartar 125 mL num recipiente de desperdícios. As colunas 2 e 3 não deve conter quaisquer drogas para permitir o uso como um fundo (em branco) e controlo de crescimento positivo. NOTA: Como alternativa, siga modelo na Figura 1B para bibliotecas de teste de drogas. Cada placa de 96 poços pode acomodar 58 drogas numa concentração única. Preparar esta placa de drogas utilizando o dobro da concentração final desejada, uma vez que será diluída pela metade na etapa 4.2.4. </li></ol></li><li> O tratamento medicamentoso: <ol><li> Recuperar a placa de 96 poços contendo o Mtb infectados macrófagos (agregados de Mtb / macrófagos). </li><li> Cuidadosamente decantar todos os poços relevantes (B2 através G11) com uma pipeta de multi-canal.Executar esta de um modo em dois passos: primeiro remover 150 mL sem inclinação da placa, e em seguida, retirar o suporte restantes (~ 50 ul) através da inclinação da placa e inserindo a ponta da pipeta para o bordo inferior do poço. Como Mtb / macrófagos agregados são aderentes ao fundo do poço, nenhum material deve ser perdida. </li><li> Suavemente adicionar 100 de meio 7H9-C a todos os poços relevantes (B2 através G11) da placa contendo os agregados / macrófagos de M. tuberculosis. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal, transferir 100 ul do fármaco que contém placa de 96 poços (passo 4.1) aos poços correspondentes da placa de infecção. </li><li> Lugar em saco selado e incubar durante 3 dias a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 5. A quantificação da droga Eficácia Utilizando o Ensaio de Microtitulação Resazurina <ol><li> Prepare resazurina solução mãe a uma concentração final de 0,8 mg / ml em H 2 O. Filtra-se através de 0,22 um de tamanho dos poros da membrana de PVDF para a esterilização.</li><li> Preparar solução de trabalho de resazurina por mistura de solução de resazurina, H2O e Tween-80 (solução a 20% em H2O) em uma proporção de 2: 1: 1. As concentrações finais são de 0,4 mg / mL de resazurina e 5% de Tween-80. </li><li> Utilizando um leitor de placa, a instalação de um programa para ler a fluorescência a 530 nm de excitação e 590 nm de emissão a cada 30 min durante 24 h a 37 ° C. leitor de placas pré-quente a 37 ° C. </li><li> Adiciona-se 20 uL de solução de trabalho de resazurina a todos os poços relevantes (B2 a G11) da placa de drogas tratada (passo 4.11) usando uma pipeta de multi-canal. </li><li> Coloque placa no leitor de placa e iniciar o programa criado no passo 5.3. NOTA: Para facilitar o processamento de grandes volumes de placas de ensaio, que é suficiente para desenvolver o ensaio em uma incubadora a 37 ° C e realizar único fluorescência lê a cada 24 h. Isto também se aplica a usuários que não têm acesso a um leitor de placas com capacidades cinéticas e incubação. </li></ol>

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<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
<li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, nós descrevemos em detalhe um modelo de infecção por Mtb alternativa adequada para testes de eficácia da droga. Este modelo leva em conta dois fatores-chave que devem ser dadas mais consideração durante o processo de início de desenvolvimento TB: a presença de barreiras fisiologicamente relevantes para a penetração da droga e as alterações metabólicas de Mtb durante a infecção. Embora tenhamos mostrado previamente os benefícios do nosso modelo de infecção e propôs a possibilidade de expansão da i...

<html> A tuberculose (TB) continua a ser uma séria ameaça à saúde global, apesar da disponibilidade de regimes de quimioterapia anti-tuberculose há mais de 40 anos 1. Isto é devido em parte à exigência de períodos de tratamento longo de mais de seis meses usando várias combinações de medicamentos, o que leva a paciente a não conformidade 2. O surgimento de tuberculose resistente a medicamentos nos últimos anos tem agravado os problemas em um campo onde o desenvolvimento bem sucedido de drogas clinicamente aprovados é praticamente inexistente 3. Na verdade, apesar do desenvolvimento exaustiva de drogas anti-TB, apenas uma única droga foi aprovada pela FDA para uso clínico nos últimos 40 anos 4. Assim, as novas gerações de medicamentos anti-tuberculose são urgentemente necessárias para resolver este problema. Um problema fundamental na descoberta TB é a falta de sucesso da transferência a partir de compostos com actividade in vitro para a eficácia no ambiente clínico= &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Inicialmente, as abordagens baseadas alvo foram utilizadas para pesquisar drogas anti-Mtb 5, que não se traduziu em células bacterianas inteiras. Mesmo quando são utilizadas células de M. tuberculosis, que é frequentemente realizada usando caldo cultivado culturas, que não prevêem com precisão a eficácia do fármaco in vivo, 8, 9. Estes problemas têm sido reconhecidas e ensaios de rastreio de drogas contra macrófagos contendo M. tuberculosis ou M. tuberculosis latente foram estabelecidas com êxito 8, 10, 11, 12. No entanto, mesmo esses ensaios mais avançados, não dão conta suficiente para as barreiras de penetração que as drogas encontram nas lesões pulmonares não vascularizados, e na focos de necrose no local da infecção. De fato, Até mesmo para a primeira linha TB rifampicina droga, a dose sub-óptima tem sido questionada devido à inadequada no tecido vivo e líquido cefalorraquidiano (LCR) penetração 13, 14, 15, bem como diminuição da eficácia contra intracelular Mtb 8, 9. Como tal, os novos modelos e ensaios que tenham em conta esses parâmetros durante o processo de desenvolvimento de liderança no início, sem dúvida, melhorar a TB esforços de descoberta de drogas. Para atender a essa necessidade, que recentemente estabeleceu um 2 BSL-modelo de infecção barato, rápido e compatível alternativa para Mtb droga testes de eficácia 16. Este modelo de infecção produzida densamente Mtb dentro de grandes estruturas agregadas de macrófagos, que recapitulou as barreiras de penetração celular fisiologicamente relevantes e gerou macrófagos passadas <em&gt; Mtb com um estado fisiológico alterado assemelhando-se latente Mtb. Mtb derivado deste modelo de infecção foi combinado com o ensaio de microplaca com resazurina (REMA) para avaliar a eficácia da droga, o que produziu resultados consistentes com outros modelos de infecção intracelular e bem correlacionado com a capacidade reportada das drogas comuns TB para atingir concentrações elevadas de CSF em relação às concentrações séricas 16. Aqui nós descrevemos em detalhe a geração de Mtb / estruturas de agregação de macrófagos para produzir e macrófagos passadas Mtb apropriado para o teste de sensibilidade às drogas usando REMA. Em particular, mostra-se como este sistema de infecção poderia ser adaptado a um formato de 96 poços para compatibilidade com throughput screening de candidatos de drogas anti-TB.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Siga as recomendações do fabricante</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>Prepare a solução estoque a 20% em H2O; filtre esterilizar</td></tr><tr><td>sal hemicálcico de ácido D-pantotênico</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Prepare a solução estoque de 24 mg/mL em H2O; esterilizar por filtro</td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>Preparar solução estoque de 50 mg/mL em H2O; esterilizar por filtro</td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Preparar solução estoque de 200 mg/mL em H2O</td></tr><tr><td>Frasco de mídia PETG quadrado</td><td>Nalgene Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mídia</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal</td><td>Bovino Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas Cytation 3</td><td>Biotek</td><td></td><td>Intercambiável com qualquer leitor de placas fluorescente e microscópio</td></tr><tr><td>Software Gen5</td><td>Biotek</td><td></td><td>Gravação e análise de rezasurin coversão</td></tr><tr><td>Rifampicina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>Prepare 10 mg / mL de solução estoque em H2O</td></tr><tr><td>Cloridrato de Moxifloxacina</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>Prepare 10 mg / mL de solução estoque em H2O</td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>Prepare 800 &mu; g/mL de solução-mãe em H2O; esterilizar por filtro</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>Preparar solução estoque a 20% em H2O; esterilizar por filtro</td></tr></tbody></table>

um ensaio compatível de alta capacidade para avaliar droga eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

O processo inicial de desenvolvimento de medicamentos antituberculose é dificultado pela tradução ineficiente de compostos com atividade in vitro para eficácia no ambiente clínico. Isso provavelmente se deve à falta de consideração pelas barreiras de penetração celular fisiologicamente relevantes que existem no hospedeiro infectado. Recentemente, estabelecemos um modelo alternativo de infecção que gera grandes estruturas agregadas de macrófagos contendo M. tuberculosis (Mtb) densamente compactado em seu núcleo, o que foi adequado para testes de suscetibilidade a drogas. Este modelo de infecção é barato, rápido e, o mais importante, compatível com BSL-2. Aqui, descrevemos os procedimentos experimentais para gerar estruturas agregadas de Mtb/macrófagos que produziriam Mtb de passagem de macrófagos para testes de suscetibilidade a drogas. Em particular, demonstramos como esse sistema de infecção pode ser adaptado diretamente ao formato de placa de 96 poços, mostrando capacidade de rendimento para a triagem de bibliotecas de compostos contra Mtb. No geral, este ensaio é uma adição valiosa à caixa de ferramentas de descoberta de medicamentos Mtb atualmente disponível devido à sua simplicidade, custo-benefício e escalabilidade.

Para confirmar a robustez de adaptar este modelo de infecção de 96 poços formato de placa, que aqui examinada a susceptibilidade fármaco de M. tuberculosis, derivado da 96-bem adaptado modelo de infecção à rifampicina (RIF) e moxifloxacina (moxi) de acordo com o modelo dado na figura 1A. Nós demonstramos que a geração do M. tuberculosis / macrófagos estruturas agregadas chave para este ensaio podem ser produzidos de forma fiável num formato de placa de ...

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar de forma reprodutível estruturas de agregados de macrófagos infectados por Mycobacterium tuberculosis em formato de placa de 96 poços para testes de suscetibilidade a fármacos utilizando um corante de viabilidade. Este método pode aprimorar o processo inicial de desenvolvimento de fármacos para compostos anti-tuberculose, o qual é prejudicado pela tradução ineficaz de compostos candidatos para o ambiente clínico. A principal vantagem deste modelo de infecção simples, econômico e compatível com nível de biossegurança 2 (BSL-2) é que ele recapitula barreiras fisiologicamente relevantes à penetração celular, semelhantes aos granulomas da tuberculose.Isso produz resultados de suscetibilidade a medicamentos mais preditivos da eficácia in vivo. Inicie este procedimento preparando a Mycobacterium tuberculosis expressando proteína verde fluorescente MC² 6206, doravante referida como MTBGFP, para infecção. Tenha em mente que esta é uma cepa avirulenta, portanto todo o trabalho no protocolo descrito aqui pode ser realizado em uma instalação de nível de biossegurança dois.Para cada placa de 96 poços a ser preparada, centrifugue 2,8 vezes 10 à oitava potência de MTBGFP a 3.200 × g por cinco minutos em uma centrífuga com rotor de balde oscilante. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e adicione cinco mililitros de RPMIC para lavar as bactérias. Pipete para cima e para baixo para ressuspender as células.Em seguida, centrifugue novamente. Após a segunda centrifugação, despreze o sobrenadante e re-suspenda as células bacterianas em sete mililitros de RPMIC, depois vortex por 10 segundos. A seguir, para cada placa de 96 poços a ser preparada, centrifugue sete vezes 10 elevado à sexta potência de células monocíticas humanas THP1 a 250 × g por cinco minutos.Após a centrifugação, despreze o sobrenadante e ressuspenda as células THP1 em sete mililitros de RPMIC. Em seguida, prepare uma placa de 96 poços para infecção, adicionando 200 microlitros de água estéril aos poços das linhas A e H e das colunas 1 e 12. Esta borda de água evitará a evaporação do meio de cultura.Adicione 200 microlitros de RPMIC à coluna dois, B dois a G dois, para o controle de fundo ou branco. Para infectar o monócito THP1, use uma pipeta para transferir toda a suspensão bacteriana MTBGFP preparada para a suspensão de células THP1 e misture pipetando para cima e para baixo. A densidade final de células THP1 é de cinco vezes 10 à quinta por mililitro e a razão de multiplicidade de infecção correspondente é 40.Em seguida, despeje a suspensão de THP1 MTBGFP em um reservatório de 25 mililitros e, usando uma pipeta multicanal, adicione 200 microlitros da suspensão de THP1 MTBGFP a todas as 96 poças restantes, de E3 a G11. Incube a placa a 37 graus Celsius, com 5% de CO2, por sete a 10 dias. A cada dois dias durante a incubação, use uma pipeta multicanal para trocar o meio, removendo lentamente 100 microlitros do meio gasto do topo de cada poça e adicionando suavemente 100 microlitros de RPMIC pré-aquecido.Ao trocar o meio, é importante ter cuidado para não perturbar os agregados de macrófagos com M. tuberculosis no fundo das poças. Examine visualmente as poças diariamente utilizando um microscópio de fluorescência, equipado com conjuntos de filtros de campo claro e GFP, com objetiva de 4 a 10 X. Observe o tamanho dos agregados de macrófagos com M. tuberculosis e capture imagens, se desejado.Entre o sétimo e o décimo dia, os agregados de macrófagos MTB devem ser suficientemente grandes para prosseguir com o teste de eficácia de fármacos, conforme descrito posteriormente no vídeo. Para o teste de fármacos, prepare dois fármacos antituberculose em triplicata em uma nova placa de 96 poços da seguinte maneira. Primeiro, adicione 125 microlitros de meio 7H9C aos poços B2 até G10.Em seguida, prepare os dois fármacos na concentração final desejada mais alta duplicada em um mililitro de 7H9C. Usando uma pipeta, adicione 250 microlitros de cada fármaco aos poços B, C e D 11 e, respectivamente, E, F e G 11 para tratamentos em triplicata. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, dilua serialmente os fármacos em duas vezes, transferindo 125 microlitros de B 11 a G 11 para B 10 a G 10.Agite pipetando cinco vezes em cada etapa. Continue transferindo 125 microlitros de coluna a coluna da direita para a esquerda ao longo da placa e pare após a coluna quatro. Após misturar a coluna quatro, descarte 125 microlitros em um recipiente de resíduos.As colunas dois e três não devem conter nenhuma droga. Isso permitirá que sejam usadas como fundo e como controles positivos de crescimento. Em seguida, retire a placa de 96 poços contendo macrófagos infectados com MTB do incubador.Sem inclinar a placa, utilize uma pipeta multicanal para remover 150 microlitros de meio dos poços B dois até G 11. Em seguida, incline a placa conforme mostrado aqui e insira as ponteiras da pipeta na borda inferior dos poços, removendo o meio restante, cerca de 50 microlitros. Como os agregados de MTB e macrófagos aderem ao fundo do poço, nenhum material deve ser perdido.No entanto, a remoção do meio deve ser a mais suave possível e deve-se ter cuidado para evitar a ressuspensão durante este processo. Adicione cuidadosamente 100 microlitros de meio 7H9C aos poços B de dois a G 11 da placa, que contêm os agregados de macrófagos MTB. Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microlitros do fármaco contido na placa de 96 poços para os poços correspondentes da placa de infecção.Em seguida, coloque a placa em um saco fechado e incube-a por três dias a 37 graus Celsius. O ensaio com resazurina baseia-se nas espécies oxidadas produzidas pelo MTB metabolicamente ativo para converter a resazurina azul em resorufina fluorescente rosa. A mudança de cor e fluorescência pode ser usada como marcador indireto para determinar a quantidade de crescimento bacteriano.Prepare uma solução estoque de resazurina numa concentração final de 8 miligramas por mililitro em água. Filtre através de uma membrana de PVDF com poro de 22 micrômetros para esterilização. Prepare uma solução de trabalho em resazurina misturando a solução estoque, água e Tween-80 numa proporção de dois para um para um.As concentrações finais são 4 miligramas por mililitro de resazurina e 5% de Tween-80. Usando um leitor de placas, configure um programa para ler a fluorescência com excitação de 530 nanômetros e emissão de 590 nanômetros durante 24 horas a cada 30 minutos a 37 graus Celsius. Pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius.Usando uma pipeta multicanal, adicione 20 microlitros da solução de trabalho de resazurina aos poços B dois até G 11 da placa tratada com fármaco. Coloque a placa no leitor e inicie o programa. Para confirmar a robustez da adaptação deste modelo de infecção ao formato de placa de 96 poços, a suscetibilidade do MTB à rifampicina RIF na moxifloxacina moxy foi avaliada conforme descrito neste vídeo.Como mostrado aqui, estruturas agregadas de macrófagos com MTB foram geradas com sucesso em formato de placa de 96 poços, permitindo assim compatibilidade com alto rendimento. Para medir quantitativamente a conversão da resazurina como indicador do crescimento bacteriano, a fluorescência de poços individuais foi monitorada cineticamente por 24 horas. A presença de células viáveis de MTB é determinada pela conversão do corante resazurina azul em sua forma reduzida rosa, o que é quantitativamente refletido pelos valores relativos de fluorescência no ponto de tempo de saturação.Esses gráficos representativos em miniatura mostram as unidades de fluorescência resultantes exibidas no eixo Y versus o tempo exibido no eixo X. Para gerar as curvas de morte por suscetibilidade a fármacos, os poços tratados com rifampicina e moxifloxacino foram normalizados em relação ao controle sem fármaco, considerando o crescimento máximo de MTB como 100% de sobrevivência. Os sinais de fundo dos controles em branco foram subtraídos de todos os poços de amostra.A porcentagem de sobrevivência foi plotada para cada concentração individual do tratamento com fármaco para gerar uma curva de morte. Esses dados mostram que a concentração inibitória mínima define a menor concentração do antibiótico na qual é observada inibição de 90% do crescimento, sendo maior que dois microgramas por mililitro, tanto para rifampicina quanto para moxifloxacina contra MTB derivada do nosso modelo de infecção. Assim, a concentração inibitória mínima dessas duas drogas contra MTB, utilizando nosso modelo de infecção e ensaio, reflete melhor a atividade dessas drogas in vivo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar de forma confiável e reprodutível estruturas de agregados de macrófagos infectados por MTB para testes de suscetibilidade a medicamentos utilizando o ensaio com resazurina. Após este procedimento, modificar o modelo de medicamento de dois fármacos, conforme mostrado, para um painel de biblioteca com 58 medicamentos pode ser facilmente realizado para permitir triagem de alta produtividade de fármacos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar a eficácia de medicamentos contra a infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  É gerado um modelo de infecção in vitro contendo agregados de Mtb/macrófagos que mimetiza a infecção in vivo. Após a introdução de antibióticos adequados, sua eficácia é testada por meio do ensaio de resuzarina para monitorar a sobrevivência das bactérias com o aumento das concentrações de drogas.

Um ensaio para avaliar a eficácia do medicamento contra um modelo de infecção por Mycobacterium tuberculosis

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

Este estudo desenvolveu um ensaio para triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus com uma cepa repórter dupla recém-criada, usando fluorescência e luminescência para avaliar a viabilidade bacteriana rapidamente. Este protocolo será relevante para pesquisadores que pretendem rastrear novos medicamentos contra essa bactéria resistente a medicamentos.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Este estudo fornece um protocolo para avaliar a interação do Mycobacterium tuberculosis com o sensor microbiano SLAMF1. Os ensaios foram conduzidos em macrófagos derivados de monócitos humanos usando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. As ferramentas descritas são relevantes para o estudo das interações entre patógenos e imunorreceptores.

Ensaios de fluorescência para o estudo da interação do Mycobacterium tuberculosis com o receptor imunológico SLAMF1

Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Tuberculose e malária são duas das infecções mais prevalentes em seres humanos e as principais causas de morbidade e mortalidade em populações empobrecidas nos trópicos. Nós estabelecemos um sistema de modelo experimental para estudar resultado de malária tuberculose co-infecção em camundongos após o desafio com ambos os patógenos através de sua rota natural de infecção.

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Um microarray amplificação combina assimétrica PCR amplificação e hibridização microarray em uma única câmara, que simplifica significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final. Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de diagnósticos à base de microarray que podem ser rotineiramente usados ​​em ambientes com recursos mais baixos.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Aprenda a gerar agregados de macrófagos infectados por Mycobacterium tuberculosis em placas de 96 poços para testes de suscetibilidade a drogas. Este método simples e compatível com BSL-2 recapitula barreiras de penetração celular fisiológicas, produzindo resultados mais preditivos da eficácia in vivo.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas

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