Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas Mycobacterium tuberculosis

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

O objetivo geral deste procedimento é gerar de forma reprodutível estruturas agregadas de macrófagos infectados por Mycobacterium tuberculosis em formato de placa de 96 poços para testes de suscetibilidade a drogas usando um corante de viabilidade. Este método pode melhorar o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para compostos antituberculose, o que é dificultado pela tradução improdutiva de compostos candidatos para o ambiente clínico. A principal vantagem deste modelo de infecção simples, barato e compatível com BSL dois é que ele recapitula barreiras de penetração celular fisiologicamente relevantes, uma reminiscência de granulomas de tuberculose.

Isso produz resultados de suscetibilidade a medicamentos mais preditivos da eficácia in vivo. Comece este procedimento preparando a proteína fluorescente verde que expressa M.tuberculosis MC ao quadrado 6206, doravante denominada MTBGFP, para infecção. Lembre-se de que esta é uma cepa avirulenta, portanto, todo o trabalho no protocolo descrito aqui pode ser realizado em uma instalação de nível dois de biossegurança.

Para cada placa de 96 poços a ser configurada centrífuga em 2,8 vezes 10 para o oitavo MTBGFP em 3, 200 vezes G por cinco minutos em uma centrífuga de balde oscilante. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e adicione cinco mililitros de RPMIC para lavar as bactérias. Pipete para cima e para baixo para ressuspender a célula.

Em seguida, centrifugue novamente. Após a segunda centrifugação, despeje o sobrenadante e ressuspenda as células bacterianas em sete mililitros de RPMIC e, em seguida, vórtice por 10 segundos. Em seguida, para cada placa de 96 poços a ser montada, centrifugue sete vezes 10 para a sexta célula monocítica humana THP1 a 250 vezes G por cinco minutos.

Após a centrifugação, despeje o sobrenadante e ressuspenda as células THP1 em sete mililitros de RPMIC. Em seguida, prepare uma placa de 96 poços para infecção, adicionando 200 microlitros de água estéril aos poços nas fileiras A e H e nas colunas um e 12. Esta borda de água evitará a evaporação do meio de cultura.

Adicione 200 microlitros de RPMIC à coluna dois, B dois a G dois, para o controle de fundo ou em branco. Para infectar o monócito THP1, use uma pipeta para transferir toda a suspensão bacteriana MTBGFP preparada para a suspensão de células THP1 e misture pipetando para cima e para baixo. A densidade celular final de THP1 é cinco vezes 10 elevado a quinto por mililitro e a duplicidade de infecção correspondente é de 40.

Em seguida, despeje a suspensão THP1 MTBGFP em um reservatório de 25 mililitros e, em seguida, usando uma pipeta multicanal, adicione 200 microlitros de suspensão THP1 MTBGFP em todos os 96 poços restantes, E três a G 11. Incube a placa a 37 graus Celsius, com 5% de CO2 por sete a 10 dias. A cada dois dias durante a incubação, use uma pipeta multicanal para trocar o meio, removendo lentamente 100 microlitros de meio gasto do topo de cada poço e adicionando suavemente 100 microlitros de RPMIC pré-aquecido.

Ao trocar o meio, é importante tomar cuidado para não perturbar os agregados de macrófagos MTB no fundo dos poços. Todos os dias, examine visualmente os poços usando um microscópio de fluorescência, equipado com conjuntos de filtros de campo claro e GFP com uma objetiva de quatro a 10 X. Observe o tamanho dos agregados de macrófagos MTB e capture imagens, se desejar.

No sétimo a 10º dia, os agregados de macrófagos MTB devem ser suficientemente grandes para prosseguir com o teste de eficácia do medicamento, conforme descrito posteriormente no vídeo. Para testes de drogas, prepare dois medicamentos antituberculose em triplicado em uma nova placa de 96 poços da seguinte forma. Primeiro, adicione 125 microlitros de meio 7H9C aos poços B dois a G 10.

Em seguida, prepare os dois medicamentos com o dobro da concentração final desejada mais alta em um mililitro de 7H9C. Usando uma pipeta, adicione 250 microlitros de cada medicamento aos poços B, C e D 11 e, em seguida, E, F e G 11, respectivamente, para tratamentos triplicados. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, dilua em série os medicamentos de teste duas vezes, movendo 125 microlitros de B 11 a G 11 para B 10 a G 10.

Misture pipetando cinco vezes em cada etapa. Continue a mover 125 microlitros de coluna em coluna da direita para a esquerda através da placa e pare após a coluna quatro. Depois de misturar a coluna quatro, descarte 125 microlitros em um recipiente de lixo.

As colunas dois e três não devem conter nenhum medicamento. Isso permitirá que eles sejam usados como pano de fundo e para controles positivos de crescimento. Em seguida, recupere a placa de 96 poços contendo os macrófagos infectados com MTB da incubadora.

Sem inclinar a placa, use uma pipeta multicanal para remover 150 microlitros de meio dos poços B dois a G 11. Em seguida, incline a placa como mostrado aqui e insira as pontas da pipeta na borda inferior dos poços e remova o meio restante, cerca de 50 microlitros. Como os agregados de macrófagos MTB aderem ao fundo do poço, nenhum material deve ser perdido.

No entanto, a remoção do meio deve ser o mais suave possível e deve-se tomar cuidado para evitar a ressuspensão durante esse processo. Adicione suavemente 100 microlitros de meio 7H9C aos poços B dois a G 11 da placa, que contêm os agregados de macrófagos MTB. Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microlitros do medicamento contendo a placa de 96 poços para os poços correspondentes da placa de infecção.

Em seguida, coloque a placa em um saco lacrado e incube-a por três dias a 37 graus Celsius. O ensaio de resazurina baseia-se nas espécies oxidativas produzidas pelo MTB metabolicamente ativo para converter a resazurina azul em resorufina rosa fluorescente. A mudança de cor e fluorescência pode ser usada como um marcador substituto para determinar a quantidade de crescimento bacteriano.

Preparar uma solução-mãe de resazurina numa concentração final de 8 miligramas por mililitro em água. Filtre através de uma membrana de PVDF de tamanho de poro de 22 micrômetros para esterilização. Prepare uma solução de trabalho em resazurina misturando a solução padrão, água e Tween-80 em uma proporção de dois para um.

As concentrações finais são de 4 miligramas por mililitro de resazurina e 5% Tween-80. Usando um leitor de placas, configure um programa para ler a fluorescência com excitação de 530 nanômetros e emissão de 590 nanômetros por 24 horas a cada 30 minutos a 37 graus Celsius. Pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius.

Usando uma pipeta multicanal, adicione 20 microlitros de solução de trabalho de resazurina aos poços B dois a G 11 da placa tratada com o medicamento. Coloque a placa no leitor e inicie o programa. Para confirmar a robustez da adaptação deste modelo de infecção ao formato de placa de 96 poços, a suscetibilidade da rifampicina MTB RIF em moxifloxacina moxy foi avaliada conforme descrito neste vídeo.

Como mostrado aqui, as estruturas agregadas de macrófagos MTB foram geradas com sucesso em um formato de placa de 96 poços, permitindo assim a compatibilidade de colocação. Para medir quantitativamente a conversão de resazurina como indicador de crescimento bacteriano, a fluorescência de poços individuais foi monitorada cineticamente por 24 horas. A presença de células MTB viáveis é determinada pela conversão do corante azul resazurina em sua forma rosa reduzida, que é quantitativamente refletida pelas redes z de fluorescência relativa no ponto de tempo de saturação.

Esses minigráficos representativos mostram as unidades de fluorescência resultantes mostradas no eixo Y versus o tempo mostrado no eixo X. Para gerar curvas de morte de suscetibilidade a drogas, os poços tratados com rifampicina e moxifloxacina foram normalizados para o crescimento máximo de MTB sem controle de drogas como 100% de sobrevivência. Os sinais em branco de controle de fundo foram subtraídos de cada poço de amostra.

A porcentagem de sobrevivência foi plotada para cada concentração individual de tratamento medicamentoso para gerar uma curva de matança. Esses dados mostram que a concentração inibitória mínima define que a menor concentração do antibiótico na qual 90% de inibição do crescimento é maior que dois microgramas por mililitro, tanto para rifampicina quanto para moxifloxacina contra MTB derivada de nosso modelo de infecção. Como tal, a concentração inibitória mínima desses dois medicamentos contra MTB usando nosso modelo de infecção e ensaio reflete mais a atividade desses medicamentos in vivo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar de forma confiável e reprodutível estruturas agregadas de macrófagos infectados com MTB para testes de suscetibilidade a medicamentos usando o ensaio de resazurina. Seguindo este procedimento, modificar o modelo de medicamento de dois medicamentos, conforme mostrado para um painel de biblioteca de 58 medicamentos, é facilmente realizado para permitir a triagem de medicamentos de alta qualidade.