Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

O objetivo geral deste procedimento é gerar e quantificar um conjunto diversificado de subtipos de cardiomiócitos induzidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais importantes sobre a conversão de linhagem específica de subtipos durante a reprogramação cardíaca, como as pistas necessárias que regulam a montagem do sarcômero e a especificação de subtipos. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece o método para efeitos quantificados na especificação de subtipos cardíacos, o que é necessário para realizar estudos mecanicistas.

Para começar, isole fibroblastos embrionários de camundongo a partir de embriões na fase E 12,5. Armazene-os em nitrogênio líquido conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, colete as células plat-E e semeie-as na densidade de um milhão de células por poço em uma placa de seis poços, de modo que as células atinjam de 70 a 80% de confluência em 24 horas.

Cubra as células com o meio de transfeção e incube-as em condições padrão de cultivo. No dia anterior ao experimento, pegue um tubo cônico de poliestireno de 15 mililitros e misture 60 microlitros de meio com soro reduzido com seis microlitros de reagente de transfeção por reação. Incube a mistura por cinco minutos à temperatura ambiente.

Como o reagente de transfeção é sensível, adicione seu reagente diretamente ao meio com soro reduzido para evitar qualquer diminuição na eficiência de transfeção. Em seguida, adicione um total de dois microgramas do coquetel GHMT por reação e bata suavemente no tubo para misturar. Incube a reação por 15 minutos à temperatura ambiente e, então, adicione a mistura às células plat-E em gotas.

Registre a data e a hora da transfeção. Incube as células plat-E transfectadas durante a noite. Uma hora antes de semear os fibroblastos embrionários de camundongo, prepare uma placa de 24 poços para imunocitoquímica adicionando primeiro lamínulas revestidas com fibronectina de 12 milímetros a cada poço.

Em seguida, adicione 300 microlitros de solução de colágeno bovino a cada poço e incube a placa por uma hora. Perto do final da incubação, descongele um frasco congelado de fibroblastos embrionários de camundongo HCN4GFP. Descongele rapidamente as células, lave-as uma vez com meio para fibroblastos pré-aquecido e conte a concentração de células vivas.

Em seguida, aspire a solução de revestimento na placa de 24 poços e plaque imediatamente 30.000 células por poço sobre lamínulas revestidas com colágeno e fibronectina. 24 horas após a transfeção, filtre o meio retroviral através de um filtro de acetato de celulose livre de surfactantes com porosidade de 0,45 mícrons e transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione polibreno para uma concentração final de oito microgramas por mililitro.

Reponha cuidadosamente as células plat-E com dois mililitros de meio de transfeção fresco. Trocar o meio muito rapidamente pode fazer com que as células se despreendam. Células plat-E adequadamente mantidas produzem, em média, dez milhões de unidades infecciosas por mililitro.

Alta expressão e intensidade de GFP em mais de 95% das células geralmente correlaciona-se com a geração bem-sucedida de miócitos semelhantes a cardiomiócitos induzidos por GHNT. Em seguida, aspire o meio dos fibroblastos embrionários cultivados e adicione o meio retroviral recém-coletado. Então, retorne a placa de metionina ao incubador e incube durante a noite.

No dia seguinte, transfira novamente o meio das células plat-E para os fibroblastos embrionários. Descarte as células plat-E após a segunda coleta do vírus. 48 horas após a indução, aspire o meio condicionado e lave as células uma vez com PBS.

Em seguida, adicione 500 microlitros de meio pré-aquecido induzido para cardiomiócitos semelhantes a miócitos por poço da placa de 24 poços. Substitua o meio a cada dois ou três dias durante os próximos 12 dias. Quatorze dias após a indução, aspire cuidadosamente o meio e lave cada poço com 300 microlitros de PBS frio a 4 °C.

Em seguida, remova o PBS e adicione 250 microlitros de uma solução de paraformaldeído a 4% por poço e incube as células por 15 minutos à temperatura ambiente. A seguir, permeabilize as células lavando os poços três vezes, por cinco minutos cada, com 300 microlitros de Triton X-100 a 0,1% em PBS. Aspire a solução excedente de permeabilização após a última lavagem e, então, adicione um tampão bloqueador universal na quantidade de 300 microlitros por poço.

Bloqueie por 10 minutos em temperatura ambiente. Incube um par de lâminas durante a noite com os anticorpos anti-alfa actinina de camundongo, anti-GFP de galinha e anti-NPPA de coelho para identificar miócitos marcapasso induzidos em miócitos atriais induzidos. No dia seguinte, lave os poços e adicione o anticorpo secundário apropriado conforme descrito no protocolo de texto acompanhante.

Após lavagens adicionais, adicione 2,4 microlitros de meio de montagem a uma lâmina de microscópio de vidro. Retire uma lamínula da placa de 24 poços e remova a solução em excesso. Em seguida, transfira-a para a lâmina de vidro com o meio de montagem.

Para cada lâmina, comece a partir de uma borda e inicie a varredura de cima para baixo no canal fluorescente vermelho para identificar células positivas para alfa-actinina e para sarcômeros. As estriações dos sarcômeros são mais fáceis de identificar no comprimento de onda de 555 nanômetros. Após a identificação, mude para o canal verde e registre se as células são positivas.

Em seguida, mude para o computador para avaliar o comprimento de onda no infravermelho distante de 647 nanômetros para detectar a marcação de NPPA ou MYL2. Células que são positivas para alfa-actinina, positivas para sarcômero, negativas para Hnc4-GFP e positivas para Nppa são miócitos induzidos semelhantes aos atriais. A marcação de Nppa aparecerá paranuclear e pontuada.

Primeiro, conte o número de células 24 horas após o semeadura, conforme descrito no protocolo de texto acompanhante. Em seguida, inspecione visualmente cada célula em um lamínula quanto à coloração adequada de alfa-actinina e sarcômero e registre o número de células positivamente coradas para ambos os marcadores. Depois, divida pelo número total real de células semeadas.

Um experimento médio de reprogramação produzirá aproximadamente um por cento de células que são positivas para alfa-actinina e sarcômero. No dia 14, o experimento pode ser interrompido e avaliado quanto à organização dos sarcômeros. Isso é identificado pela marcação positiva para alfa-actinina mostrada aqui em vermelho.

Apenas as células que exibem organização de sarcômeros são capazes de batimento espontâneo, portanto, esta é uma boa verificação inicial. São mostradas aqui cardiomiócitos induzidos semelhantes a marca-passos derivados de camundongos com o gene repórter Hcn4-GFP. Três células nesta imagem exibem organização de sarcômeros.

Três aglomerados celulares positivos para Hcn4-GFP estão presentes no centro da imagem e podem ser identificados como um tipo de célula marcapasso. Uma célula na parte inferior esquerda pode ser observada com marcação de alfa-actinina, mas sem organização de sarcômeros ou marcador de subtipo identificável. Nesta população de cardiomiócitos induzidos semelhantes a ventriculares, a célula central exibe organização de sarcômeros; essa célula também apresenta marcação positiva para o marcador de cadeia leve da miosina MYL-2, que é um marcador para cardiomiócitos ventriculares.

Uma vez dominado, o plaqueamento e a transfeção das células plat-E podem ser realizados em uma hora. A indução dos fibroblastos embrionários de camundongo leva de uma a duas horas, e a quantificação de mitose em uma placa completa de 24 poços leva cerca de oito horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que fibroblastos embrionários de camundongo saudáveis e vírus de alto título são fundamentais para um experimento de reprogramação bem-sucedido.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar e quantificar subtipos individuais de cardiomiócitos induzidos.