Name: Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a reprogramar fibroblastos embrionários de camundongo em cardiomiócitos induzidos usando os fatores de transcrição GHMT. Este método permite gerar e quantificar subtipos cardíacos específicos para estudos de biologia cardíaca e medicina regenerativa.

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A.F.-P. foi apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o Grant No.2015165336. A N.V.M foi apoiada por doações do NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) e March of Dimes (# 5-FY14-203). Agradecemos a Young-Jae Nam, Christina Lubczyk e Minoti Bhakta por suas importantes contribuições para o desenvolvimento de protocolos e análise de dados. Também agradecemos a John Shelton pela valiosa contribuição técnica e aos membros do laboratório Munshi pela discussão científica.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo práticas animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da UT Southwestern Medical Center. 1. Isolamento de Hcn4-GFP E12.5 rato embrionário de fibroblastos (MEFs) <ol><li> Configurar acasalamentos cronometrados entre homozigotos machos Hcn4-GFP e CD-1 fêmeas. </li><li> Sacrificar fêmea grávida em E12.5 por eutanásia dióxido de carbono e subsequente deslocamento cervical. <ol><li> Remover cornos uterinos com uma pinça de dissecação como descrito anteriormente 22, 23, e colocá-los em uma placa de Petri sobre gelo com uma solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) sem Ca2 + ou Mg2 +. </li></ol></li><li> Execute todas as etapas posteriores na capa de cultura de tecido, utilizando uma técnica estéril. <ol><li> Retire os embriões do útero e saco amniótico com uma tesoura e dissecando fórceps. Mantenha a placenta anexado para melhor manuseio. pregnant CD-1 fêmeas geralmente dão à luz entre 10 e 14 filhotes. </li><li> Usando dissecando uma pinça, levar os embriões isolados e rapidamente lavá-los duas vezes em 70% (v / v) EtOH. NOTA: As lavagens deve ser rápido para minimizar a morte celular. </li><li> Retire a cabeça, membros, cauda e órgãos internos, incluindo o coração dos embriões isolados. </li><li> Colocar o tecido restante em um prato de 10 cm com 1 mL de PBS 1x e tritura finamente com uma lâmina de barbear esterilizada para aproximadamente 1 mm 3 de tamanho. </li><li> Transferir tecido moído para um tubo cónico de 50 ml com PBS. </li><li> Girar a 300 xg por 3 min. Aspirar cuidadosamente o excesso de PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de estéril 0,25% de tripsina-EDTA por embrião. Incubar as células em um banho de água a 37 ° C durante 15 min. Misture delicadamente o tubo a cada 4 min. Sobre-digestão do tecido irá diminuir significativamente o rendimento. </li><li> mistura de células Vortex à velocidade máxima (3.200 rpm) durante 4 s. </li><li> Adicione 2 ml de meio de fibroblastos por embrião e misture. filtro ttravés de um filtro celular de 100 um, utilizando uma pipeta para auxiliar as células através do filtro. Consultar a Tabela 1 para a formulação de todos os meios subsequentes. </li><li> Giram a 300 g durante 4 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Adicionar 10 ml de meio de fibroblastos fresca por 3 embriões e triturar 6-10 vezes. </li><li> Placa as células em 1 15 cm prato de cultura de tecidos para cada 3 embriões preparados. Durante a noite em cultura a 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Após a incubação durante a noite, substituir a mídia com frescos 30 mL de mídia por placa. Colocar as células de volta na incubadora durante a noite. NOTA: Verifique se há Hcn4-GFP + contaminação de células sob um microscópio fluorescente. A cultura deve ser GFP - e só se tornam GFP + sobre a reprogramação. </li><li> No dia seguinte, as células de colheita com 3 ml de fresco pré-aquecido 0,25% de tripsina-EDTA. Contagem e congelar células. Tipicamente, congelar as células a 3 x 10 6 culas por ml. O Yie esperadoLD deve ser de 3 x 10 6 células por embrião. </li></ol></li></ol> 2. Retrovirus Produção e Reprogramação Atenção: O protocolo seguinte exige a produção e manipulação de retrovírus infecciosos. Execute as seguintes etapas em um armário de Biossegurança Nível 2, sob BSL-2 orientações e técnica estéril. Use 10% de alvejante de dispor de todos os materiais expostos ao retrovírus. <ol><li> Produção de retrovírus e preparação MEFs NOTA: O protocolo seguinte é para a produção retroviral em placas de 6 poços e MEF infecção em placas de 24 poços. Para outros formatos, consulte a Tabela 2. MEFs são banhados no dia -1, então o tempo terá de ser coordenado de forma adequada para cada experimento (Consulte a seção 2.3 e Figura 2). <ol><li> Manter as células como as recomendações do fabricante Plat-E (PE). Resumidamente, as células de cultura de PE em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1 ug / mL puromyCIN, 10 ug / ml de blasticidina, penicilina e estreptomicina. células de passagem 1: 4 a cada dois dias quando a cultura atinge 70-90% de confluência. </li><li> Dia -2: No dia antes da transfecção, as células semente Plat-E a 1 x 10 6 células / poço numa placa de 6 poços em meio de transfecção. As células devem ser de 70-80% confluentes no momento da transfecção. </li></ol></li><li> A transfecção utilizando um agente de transfecção comercial. NOTA: Os reagentes comerciais devem estar à temperatura ambiente (TA) antes da transfecção. Para a transfecção de ADN, adicionar cada ADN plasmídico retroviral individualmente (G, H, H, e T), para formar um cocktail GHMT 9. <ol><li> Dia -1: Em um tubo de poliestireno de 15 mL cónico, misturar 60 mL de meio de soro reduzido com 6 mL de reagente de transfecção por reacção de um formato de placa de 6 poços. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. Observação: Uma vez que o reagente de transfecção utilizado aqui se liga aos plásticos, umadd directamente para o meio de soro reduzido para evitar qualquer diminuição da eficiência de transfecção. </li><li> Adicionar um total de 2 mg de GHMT cocktail por reação e bata suavemente para misturar. não vortex. Incubar a reacção durante 15 min à TA. </li><li> Adicionar a mistura do passo 2.2.3 às células PE de forma sensata gota. </li><li> Incubar as células Plat-E transfectadas durante a noite num banho a 37 ° C, 5% de CO2. Anote o tempo de transfecção. </li></ol></li><li> Semeadura de rato Hcn4-GFP fibroblastos embrionárias. <ol><li> 1 h antes do plaqueamento MEFs, preparar uma placa de 24 poços para imunocitoquímica. <ol><li> Adicionar uma lamela fibronectina 12 mm por bem. </li><li> Poços revestimento com 300 uL de solução de colagénio bovino (por exemplo, surecoat) e incuba-se num banho a 37 ° C incubadora durante 1 h. </li><li> solução de revestimento aspirado imediatamente antes do plaqueamento MEF. </li></ol></li><li> Descongelar uma ampola congelada de Hcn4-GFP MEFs e lavar com x1 fibrobl pré-aquecidomeios AST a 500 xg durante 5 min. </li><li> Determinar a viabilidade celular utilizando a exclusão de azul de tripano ou corantes semelhantes. Calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura, utilizando a seguinte fórmula: % de células viáveis ​​= [1,00 - (número de células azuis / número total de células)] x 100 <ol><li> Calcular o número total de células viáveis ​​utilizando a seguinte fórmula: As células viáveis ​​=% de células viáveis ​​x factor de diluição x 10.000 x volume total de suspensão de células </li></ol></li><li> Seed 3 x 10 4 culas por po para uma placa de 24 poços com colagénio bovino lamela solução de fibronectina previamente preparada. </li></ol></li><li> Transdução e reprogramação de MEFs NOTA: De acordo com as notas do fabricante, devidamente mantido células Plat-E produzir um título médio de 1 x 10 7 unidades de infecção / mL. Embora a título não é directamente medido para cada experiência, um controlo de GFP é sempre incluído como um substituto para a eficiência de infecção.Expressão GFP e alta intensidade (GFP +&gt; 95%) está correlacionado com geração tipicamente mediada por GHMT bem sucedida de iCLMs. <ol><li> Dia 0: 24 h pós-transfecção, filtrar a forma retroviral PE através de um tamanho de poro uM-filtro de acetato de celulose sem agente tensioactivo 0,45 e transferir para um tubo cónico de 15 mL. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL. Cuidadosamente repor as células com 2 ml de meio de transfecção fresco. NOTA: As células facilmente separar da placa se a mídia é alterado muito rapidamente. </li><li> Aspirar o meio dos MEFs cultivadas e adicionar o meio retroviral recentemente colhido; deve proporcionar 1,7 mL de meio por poço de uma placa de 6 poços. Adicionar ~ 800 uL por poço de uma placa de 24 poços. Retorno placa MEF para a incubadora e incubar durante a noite. </li><li> Dia 1: Repita os passos 2.4.1 e 2.4.2. Descarte células após a colecção de vírus da 2ª. Voltar MEFs infectados para a incubadora e deixá-los descansar durante a noite. </li><li> Dia 2: 48 h pós-indução, aspirar a célula condicionado mídia e lavagem x1 com 1x PBS. Adicionar 500 ul meios iCLM pré-aquecido por poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Substituir mídia iCLM cada 2 - 3 dias. placa processo de 14 dias após a indução viral para imunocitoquímica análise (ICC) de reprogramação cardíaca. </li></ol></li></ol> 3. A imunocoloração de MEFs reprogramado <ol><li> 14 dias pós-indução, aspirar cuidadosamente a mídia. </li><li> Lavar cada poço com 300 mL de gelo-frio 1x PBS. Aspirar o excesso de solução. </li><li> Fixar as células com 250 uL de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por poço de uma placa de 24 poços. Incubar 15 min a RT. NOTA: Fixa células podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante 1 - 2 semanas antes da coloração. </li><li> permeabilizar células por Wells lavar 3x com 300 uL de 0,1% Triton X-100 de PBS (PBST). Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Aspirar o excesso de solução após a última lavagem. </li><li> Bloco para 10min à temperatura ambiente com tampão de bloqueio universal 1x a 300 uL / ​​poço. </li><li> Prepare tampão de coloração (ICC): Adicione 1: 1 de PBS 1x e 1x Universal tampão de bloqueio. Dilui-se os anticorpos primários em tampão de coloração ICC e incubar anticorpos durante a noite a 4 ° C. Consulte a seção de material para diluições recomendadas. <ol><li> Manchar um par de lâminas com α-actinina rato, αGFP frango e coelho NPPA para IPM e identificação IAM. </li><li> Manchar um par de lâminas com rato α-actinina, αGFP frango, e Myl2 coelho para IPM e IVM identificação. </li></ol></li><li> No dia seguinte, lave poços x3 com 300 mL de 0,1% PBST. Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Aspirar o excesso de solução após a última lavagem. </li><li> Preparar as diluições de anticorpo secundário em tampão de coloração ICC. Consulte a seção de material para diluições recomendadas. Incubar anticorpos secundários 1 h à temperatura ambiente, protegida da luz. <ol><li> Manchar todos os slides com o antibodie secundária seguintes: Rato Alexa-555, frango Alexa-488, e coelho Alexa-647. </li></ol></li><li> Lave poços x3 com 300 mL de 0,1% PBST. Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Proteger da luz. </li><li> Adicionar 2,4 mL de meio de montagem contendo 1,5 ug / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para uma lâmina de microscópio de vidro. Remova cuidadosamente a lamela do poço da placa de 24 poços, remover o excesso de solução e transferir para a lâmina de vidro com meios de montagem. Pressione suavemente a lamela para remover o excesso de volume e ar. </li><li> lâminas de vedação com unha polonês preferencial ou selante plástico. Loja montadas lâminas a 4 ° C protegidos da luz. </li></ol> 4. Identificação do cardíacos subtipos Usando Microscopia Confocal NOTA: Para imagens, um microscópio confocal equipado com pelo menos 2 detectores fluorescentes capazes de detecção espectral a 405, 488, 555, e 639 nm comprimento de onda é necessário, a fim de identificar IPMS, IAM, e iVMS. imagcélulas e usando um plano-Apochromat 20X / 0,75 objetiva ou melhor. Usando o software de análise de imagem do fabricante, a digitalização de imagens de zoom pode conseguir imagens de qualidade de imersão 40X de óleo. <ol><li> biblioteca de imagens: tome imagens de 8 bits com DAPI, Alexa-488, Alexa-555 e Alexa-647 canais (cap.). Pixel tempo de permanência de 6 s, 1024 tamanho do quadro, passo linha no 2, e média de 2 é suficiente para imagens de alta resolução. </li><li> Para cada slide, começar a partir de uma extremidade e começar a digitalizar cima e para baixo no canal fluorescente vermelha (cap.) Para sarcômero + células α-actinina + (Consulte a Figura 3 e Figura 5A para exemplos). estrias sarcômero são mais fáceis de identificar visualmente no comprimento de onda 555 nm. <ol><li> Uma vez que um sarcômero + células α-actinina + foi identificado, mudar para o ch verde. e manter a nota se for positivo (IPM). Mudar para o computador para avaliar a vermelho-distante 647 ch. (IAM ou MIV). NOTA: As células que sãoα-actinina + / + sarcômero / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - são designados como IPMS. Expressão da GFP será visto ao longo da célula (Figura 4A). </li><li> lâminas mancha com α-actinina (mouse-Alexa555), Hcn4-GFP (frango-Alexa488), NPPA (coelho-Alexa647) e DAPI. Células que são α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + NPPA são IAM. NPPA coloração aparece perinuclear e pontuada (Figura 4B). </li><li> lâminas mancha com α-actinina (mouse-Alexa555), Hcn4-GFP (frango-Alexa488), Myl2 (coelho-Alexa647). Células positivas para α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + Myl2 são iVMS. Myl2 coloração irá apresentar uma forma estriado ao longo do filamento sarcômero. Devido a variações na qualidade da coloração e o plano z, estrias podem nem sempre ser facilmente visível (Figura 4C). </li></ol></li></ol> NOTA: De modo a avaliar o número real de MEFs potencialmente reprogramadas, 2 poços de uma placa de 24 cavidades são semeadas em paralelo aos poços experimentais e são colhidas um dia após o plaqueamento. O número total de células plaqueadas é então determinada através da média das duas cavidades. Isto torna-se total de células reais banhados (atotal). <ol><li> sarcômero + <ol><li> Inspecionar visualmente cada célula em uma lamela para o bom α-actinina + / sarcômero + (painéis da direita Figura 3) e registro (Figura 5B-I). </li><li> Tabular o número total de α-actinina + / + sarcômero em cada lamela e dividir pelo número total de células plaqueadas reais (atotal) (Figura 5B-III). Por exemplo, se atotal = 12.500 células, e células 100 foram a-Actinina + / + sarcômero então, 0,8% de as MEFs plaqueadas foram reprogramadas. Uma médiareprogramação experiência renderá 1% de a-actinina + / sarcômero células + (Figura 5C). </li></ol></li><li> subtipo + NOTA: Para os passos seguintes, consulte a Figura 5B / C para um fluxo de trabalho iCLM quantificação representativa. Resumidamente, para cada célula sarcómero +, tabular se que é único para qualquer subtipo (Figura 5B-I). Calcular a% de subtipo (Figura 5B-III), dividindo o número de células ao longo do subtipo + sarcómero média + x 100 células (Figura 5B-I). Para calcular a% de eficiência absoluta subtipo (Figura 5B-IV), dividir o número subtipo + célula a partir da Figura 5B-I pelo número total de células semeadas x 100 (Figura 5B-II). <ol><li> Para cada uma das células α-actinina + / + sarcômero, avaliar se eles são GFP +, + NPPA, ou Myl2 <saté&gt; +. </li><li> Tabular número total de α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, e α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + Myl2 células (Figura 5B-i). </li><li> Para calcular a percentagem de cada subtipo, divida o número de células Subtipo + pelo número total de α-actinina + / sarcômero + células em que bem e multiplicar por 100. GHMT gera IPMS, Iams, e iVMS proporções mais ou menos iguais (Figura 5B-III). </li><li> Para calcular o número absoluto de células subtipo +, dividir o número total de células subtipo + para a condição experimental por atotal e multiplicar por 100 (Figura 5B-II). Em IPMS médios representam 0,3% da população total de células infectadas, IAM 0,3%, eiVMS 0,25% (Figura 5B-IV). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O presente estudo fornece uma estratégia de reprogramação direta para a conversão de MEFs em um conjunto diversificado de subtipos cardíacas via expressão mediada por retrovírus da transcrição cardíaca fatores GATA4, MEF2C, Tbx5 e HAND2 (GHMT). Usando uma abordagem imunocoloração multiplex em combinação com um rato repórter específica do PM, somos capazes de identificar IAM, iVMS e IPMS em resolução de uma única célula. Um tal ensaio permite uma experimental sistema in vitro capaz de isolar as contribuições de ...

O coração é o primeiro órgão funcional para desenvolver no embrião 1, 2. Em conjunto com o sistema circulatório, que fornece o oxigénio, nutrientes, e um mecanismo de eliminação de resíduos durante o desenvolvimento. Três semanas após a fertilização, o coração humano bate pela primeira vez e a sua regulação correcta é mantida por cardiomiócitos (CMS). A perda irreversível destas células especializadas é, por conseguinte, o problema fundamental subjacente a insuficiência cardíaca progressiva. Embora alguns organismos, tais como o peixe-zebra e Xenopus têm o potencial para a regeneração cardíaca, o coração de mamíferos adultos é mais limitada de 3, 5, 6. Assim, tendo em conta a função crítica do coração, não é surpreendente que a doença cardíaca é a causa principal de morte no mundo, sendo responsável por 600.000 mortes nos Estados Unidos sozinho 7. oguinte, terapias baseadas em células para reparar ou substituir o miocárdio lesado de forma eficiente são de grande interesse clínico. O estudo seminal de Yamanaka e seus colegas 8 mostraram que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição é suficiente para converter células de fibroblastos completamente diferenciadas para as células-tronco pluripotentes. No entanto, a capacidade tumorigénica de todas as estratégias de células estaminais pluripotentes tem sido uma preocupação crítica na sua utilização para fins terapêuticos. Isso motivou o campo científico para procurar métodos alternativos para transdiferenciam células, evitando um estágio pluripotente. Recentemente, vários grupos demonstraram a viabilidade desta estratégia, exibindo conversão directa de fibroblastos de rato para células de cardiomiócitos-like induzidas (iCLMs) com a expressão ectópica de fatores de transcrição GATA4, MEF2C, Tbx5, e mais tarde, HAND2 (GMT e GHMT , respectivamente) 9, 10. Furthermore, a mesma estratégia pode ser realizada in vivo e nos tecidos de origem humana-9, 11, 12. Estudos recentes puseram em evidência factores adicionais ou as vias de sinalização que pode ser modulada de modo a melhorar ainda mais a eficiência cardíaca reprogramação 13, 14, 15. Tomados em conjunto, estes estudos demonstram o potencial de transdiferenciação dirigido para terapias regenerativas. No entanto, a baixa eficiência de CM reprogramação, os mecanismos moleculares desconhecidos, reprodutibilidade inconsistente devido a diferenças metodológicas 16, e a heterogeneidade dos iCLMs permanecem sem solução. A fim de avaliar diretamente iCLM heterogeneidade, foi elaborado um ensaio de uma única célula discreta e robusta para a identificação de desenvolvimento sarcomere e Specificatio linhagem cardíacaN-duas características necessárias de cardiomiócitos funcionais. Há pelo menos três tipos principais de CM no coração tal como definido pela sua localização e propriedades elétricas únicas: atrial (AM), ventricular (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. Numa combinação orquestrada, eles permitem que a bombagem de sangue adequado. Durante a lesão cardíaca, um ou todos os subtipos pode ser afectada, e o tipo de terapia com células teriam de ser dirigida numa base de caso-a-caso. Atualmente, a maioria das estratégias de focar a geração global de cardiomiócitos, enquanto pouco trabalho está sendo feito para estudar os mecanismos moleculares que regulam a especificação subtipo. Detalhes do estudo seguinte como quantificar adequadamente sarcômeros bem organizadas e identificar um conjunto diversificado de subtipos de cardiomiócitos. Usando um pacemaker (PM) do mouse repórter -específica, somos capazes de aplicar um iabordagem mmunocytochemical distinguir miócitos atriais induzidas-like (IAM), miócitos ventriculares induzidas-like (MIV), e induzidas miócitos PM-like (IPMS) 21. Com base em nossas observações, apenas as células que exibem organização sarcomere são capazes de batimento espontâneo. Esta plataforma reprogramação exclusivo permite avaliar o papel de determinados parâmetros na organização do sarcômero, especificação subtipo, e a eficiência da reprogramação CM na resolução de uma única célula.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Componente do meio iCLM, meio Plat-E, fibroblastos e meios de transfecção</td></tr><tr><td>199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td>Componente do meio iCLM</td></tr><tr><td>Serrum fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Componente do meio iCLM, meio Plat-E, fibroblastos e meios de transfecção</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td>Componente do meio iCLM Solução de</td></tr><tr><td>vitamina MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>Componente do meio iCLM</td></tr><tr><td>Aminoácidos MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>Componente do meio iCLM</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>Componente do meio iCLM</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicóticos</td><td>Thermo Fisher Componente</td><td>de 15240062</td> Científico <td>do suplemento de mídia iCLM</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Componente de mídia iCLM</td></tr><tr><td>Soro de cavalo inativado por calor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>Componente de mídia iCLM</td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>Componente de mídia iCLM</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1514022</td><td>Componente de mídia Plat-E e mídia de fibroblastos</td></tr><tr><td>Puromycin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>Componente da mídia Plat-E</td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp; &nbsp;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Componente do meio Plat-E</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Componente do meio de fibroblastos</td></tr><tr><td>Varredura a laser confocal LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Para análise confocal</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção FuGENE 6</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reagente de transfecção&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM Soro Reduzido Médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Reagente de transfecção&nbsp;</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Reagente de indução. Use em uma concentração final de 8 &mu; Linha</td></tr><tr><td>celular retroviral Packagin M / mL Platinium-E (PE), Ecotropic</td><td>CellBiolabs</td><td>RV-101</td><td>Linha celular de embalagem retroviral</td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>para MEFs e dissociação Plat-E</td></tr><tr><td>Anti &alfa;-Actinina de camundongo (Clone EA-53)</td><td>Anticorpo Sigma</td><td>A7811</td><td>para análise confocal. Use a 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP IgY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td>para análise confocal. Use a 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti-NPPA&nbsp;</td><td>Anticorpo AP8534A Abgent</td><td></td><td>para análise confocal. Use a 1:400</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti Myl2 IgG&nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>Anticorpo para análise confocal. Use a 1:200</td></tr><tr><td>Solução Vectashield com DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>Corante para análise confocal</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lâminas de microscópio Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1.0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronectina 12 mm lamínulas</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>Lamínulas para análise confocal</td></tr><tr><td>100 &mu; filtro de células m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m Seringas filtros SFCA 25MM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>Para filtração de vírus</td></tr><tr><td>6 mL Seringas</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>Para filtração de vírus</td></tr><tr><td>Cabra anti-Frango IgY (H & L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho A647 IgG(H+L)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400</td></tr><tr><td>IgG(H+L) anti-camundongo de cabra A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td><td>Para permeabilização celular&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS da Dulbecco sem CaCl2 e MgCl2 (D-PBS)</td>Bloco de Potência <td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>10x Reagente de Bloqueio Universal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>Diluir para 1x em H2O</td></tr><tr><td>16% Solução aquosa de paraformaldeído (PFA)Ciências da</td> <td>Microscopia Eletroscopia&nbsp;</td><td>15710</td><td>Use a 4% diluído em placas de dH2O</td></tr><tr>de<td>6 cm Placas de 6 poços</td><td>Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 10 cm</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 15 cm Placas de cultura de tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano a 0,4%</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Para viabilidade</td></tr><tr><td>Álcool etílico 200 prova</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliando cardiomiócitos subtipos seguindo reprogramação fator de transcrição mediada por embrionárias de camundongos fibroblastos

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

A reprogramação direta de um tipo de célula em outro emergiu recentemente como um poderoso paradigma para medicina regenerativa, modelagem de doenças e especificação de linhagem. Em particular, a conversão de fibroblastos em miócitos induzidos semelhantes a cardiomiócitos (iCLMs) por Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5 (GHMT) representa uma via importante para a geração de miócitos cardíacos de novo in vitro e in vivo. Evidências recentes sugerem que o GHMT gera uma diversidade maior de subtipos cardíacos do que se pensava anteriormente, ressaltando assim a necessidade de uma abordagem sistemática para a realização de estudos adicionais. Antes que a reprogramação direta possa ser usada como estratégia terapêutica, no entanto, os fundamentos mecanicistas da conversão de linhagem devem ser compreendidos em detalhes para gerar subtipos cardíacos específicos. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para gerar iCLMs por reprogramação mediada por GHMT de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs). 
Descrevemos métodos para isolamento de MEF, produção retroviral e infecção por MEF para realizar uma reprogramação eficiente. Para determinar a identidade do subtipo de células reprogramadas, detalhamos uma abordagem passo a passo para realizar imunocitoquímica em iCLMs usando um conjunto definido de anticorpos compatíveis. Métodos para microscopia confocal, identificação e quantificação de iCLMs e subtipos individuais de átrio (IAM), ventricular (iVM) e marcapasso (iPM) também são apresentados. Finalmente, discutimos resultados representativos de experimentos de reprogramação direta prototípica e destacamos aspectos técnicos importantes de nosso protocolo para garantir uma conversão de linhagem eficiente. Em conjunto, nosso protocolo otimizado deve fornecer uma abordagem gradual para os investigadores conduzirem experimentos significativos de reprogramação cardíaca que exijam a identificação de subtipos individuais de CM.

Tomando vantagem do rato repórter específica do PM, que desenvolveu uma estratégia para identificar imunocoloração multiplex diversas miócitos endógenos, como representado na Figura 1. Após os passos de reprogramação mostrados na Figura 2, a indução de MC específicos do subtipo pode ser detectada tão cedo como o dia 4 21, se bem que a uma velocidade baixa. Ao dia 14, o experimento pode ser interrompido e avaliadas para a organizaç...

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar e quantificar um conjunto diversificado de subtipos de cardiomiócitos induzidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais importantes sobre a conversão de linhagem específica de subtipos durante a reprogramação cardíaca, como as pistas necessárias que regulam a montagem do sarcômero e a especificação de subtipos. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece o método para efeitos quantificados na especificação de subtipos cardíacos, o que é necessário para realizar estudos mecanicistas.Para começar, isole fibroblastos embrionários de camundongo a partir de embriões na fase E 12,5. Armazene-os em nitrogênio líquido conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, colete as células plat-E e semeie-as na densidade de um milhão de células por poço em uma placa de seis poços, de modo que as células atinjam de 70 a 80% de confluência em 24 horas.Cubra as células com o meio de transfeção e incube-as em condições padrão de cultivo. No dia anterior ao experimento, pegue um tubo cônico de poliestireno de 15 mililitros e misture 60 microlitros de meio com soro reduzido com seis microlitros de reagente de transfeção por reação. Incube a mistura por cinco minutos à temperatura ambiente.Como o reagente de transfeção é sensível, adicione seu reagente diretamente ao meio com soro reduzido para evitar qualquer diminuição na eficiência de transfeção. Em seguida, adicione um total de dois microgramas do coquetel GHMT por reação e bata suavemente no tubo para misturar. Incube a reação por 15 minutos à temperatura ambiente e, então, adicione a mistura às células plat-E em gotas.Registre a data e a hora da transfeção. Incube as células plat-E transfectadas durante a noite. Uma hora antes de semear os fibroblastos embrionários de camundongo, prepare uma placa de 24 poços para imunocitoquímica adicionando primeiro lamínulas revestidas com fibronectina de 12 milímetros a cada poço.Em seguida, adicione 300 microlitros de solução de colágeno bovino a cada poço e incube a placa por uma hora. Perto do final da incubação, descongele um frasco congelado de fibroblastos embrionários de camundongo HCN4GFP. Descongele rapidamente as células, lave-as uma vez com meio para fibroblastos pré-aquecido e conte a concentração de células vivas.Em seguida, aspire a solução de revestimento na placa de 24 poços e plaque imediatamente 30.000 células por poço sobre lamínulas revestidas com colágeno e fibronectina. 24 horas após a transfeção, filtre o meio retroviral através de um filtro de acetato de celulose livre de surfactantes com porosidade de 0,45 mícrons e transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione polibreno para uma concentração final de oito microgramas por mililitro.Reponha cuidadosamente as células plat-E com dois mililitros de meio de transfeção fresco. Trocar o meio muito rapidamente pode fazer com que as células se despreendam. Células plat-E adequadamente mantidas produzem, em média, dez milhões de unidades infecciosas por mililitro.Alta expressão e intensidade de GFP em mais de 95% das células geralmente correlaciona-se com a geração bem-sucedida de miócitos semelhantes a cardiomiócitos induzidos por GHNT. Em seguida, aspire o meio dos fibroblastos embrionários cultivados e adicione o meio retroviral recém-coletado. Então, retorne a placa de metionina ao incubador e incube durante a noite.No dia seguinte, transfira novamente o meio das células plat-E para os fibroblastos embrionários. Descarte as células plat-E após a segunda coleta do vírus. 48 horas após a indução, aspire o meio condicionado e lave as células uma vez com PBS.Em seguida, adicione 500 microlitros de meio pré-aquecido induzido para cardiomiócitos semelhantes a miócitos por poço da placa de 24 poços. Substitua o meio a cada dois ou três dias durante os próximos 12 dias. Quatorze dias após a indução, aspire cuidadosamente o meio e lave cada poço com 300 microlitros de PBS frio a 4 °C.Em seguida, remova o PBS e adicione 250 microlitros de uma solução de paraformaldeído a 4% por poço e incube as células por 15 minutos à temperatura ambiente. A seguir, permeabilize as células lavando os poços três vezes, por cinco minutos cada, com 300 microlitros de Triton X-100 a 0,1% em PBS. Aspire a solução excedente de permeabilização após a última lavagem e, então, adicione um tampão bloqueador universal na quantidade de 300 microlitros por poço.Bloqueie por 10 minutos em temperatura ambiente. Incube um par de lâminas durante a noite com os anticorpos anti-alfa actinina de camundongo, anti-GFP de galinha e anti-NPPA de coelho para identificar miócitos marcapasso induzidos em miócitos atriais induzidos. No dia seguinte, lave os poços e adicione o anticorpo secundário apropriado conforme descrito no protocolo de texto acompanhante.Após lavagens adicionais, adicione 2,4 microlitros de meio de montagem a uma lâmina de microscópio de vidro. Retire uma lamínula da placa de 24 poços e remova a solução em excesso. Em seguida, transfira-a para a lâmina de vidro com o meio de montagem.Para cada lâmina, comece a partir de uma borda e inicie a varredura de cima para baixo no canal fluorescente vermelho para identificar células positivas para alfa-actinina e para sarcômeros. As estriações dos sarcômeros são mais fáceis de identificar no comprimento de onda de 555 nanômetros. Após a identificação, mude para o canal verde e registre se as células são positivas.Em seguida, mude para o computador para avaliar o comprimento de onda no infravermelho distante de 647 nanômetros para detectar a marcação de NPPA ou MYL2. Células que são positivas para alfa-actinina, positivas para sarcômero, negativas para Hnc4-GFP e positivas para Nppa são miócitos induzidos semelhantes aos atriais. A marcação de Nppa aparecerá paranuclear e pontuada.Primeiro, conte o número de células 24 horas após o semeadura, conforme descrito no protocolo de texto acompanhante. Em seguida, inspecione visualmente cada célula em um lamínula quanto à coloração adequada de alfa-actinina e sarcômero e registre o número de células positivamente coradas para ambos os marcadores. Depois, divida pelo número total real de células semeadas.Um experimento médio de reprogramação produzirá aproximadamente um por cento de células que são positivas para alfa-actinina e sarcômero. No dia 14, o experimento pode ser interrompido e avaliado quanto à organização dos sarcômeros. Isso é identificado pela marcação positiva para alfa-actinina mostrada aqui em vermelho.Apenas as células que exibem organização de sarcômeros são capazes de batimento espontâneo, portanto, esta é uma boa verificação inicial. São mostradas aqui cardiomiócitos induzidos semelhantes a marca-passos derivados de camundongos com o gene repórter Hcn4-GFP. Três células nesta imagem exibem organização de sarcômeros.Três aglomerados celulares positivos para Hcn4-GFP estão presentes no centro da imagem e podem ser identificados como um tipo de célula marcapasso. Uma célula na parte inferior esquerda pode ser observada com marcação de alfa-actinina, mas sem organização de sarcômeros ou marcador de subtipo identificável. Nesta população de cardiomiócitos induzidos semelhantes a ventriculares, a célula central exibe organização de sarcômeros; essa célula também apresenta marcação positiva para o marcador de cadeia leve da miosina MYL-2, que é um marcador para cardiomiócitos ventriculares.Uma vez dominado, o plaqueamento e a transfeção das células plat-E podem ser realizados em uma hora. A indução dos fibroblastos embrionários de camundongo leva de uma a duas horas, e a quantificação de mitose em uma placa completa de 24 poços leva cerca de oito horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que fibroblastos embrionários de camundongo saudáveis e vírus de alto título são fundamentais para um experimento de reprogramação bem-sucedido.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar e quantificar subtipos individuais de cardiomiócitos induzidos.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.

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O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

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Descrevemos aqui um protocolo para a geração de iCMs usando entrega mediada por retrovírus de Gata4, Tbx5 e Mef2c em uma construção policistrônica. Este protocolo produz uma população relativamente homogênea de células reprogramadas com eficiência e qualidade aprimoradas e é valioso para estudos futuros de reprogramação de iCM.

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Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

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Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

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O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

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Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

Aprenda a reprogramar fibroblastos embrionários de camundongo em cardiomiócitos induzidos usando os fatores de transcrição GHMT. Este método permite gerar e quantificar subtipos cardíacos específicos para estudos de biologia cardíaca e medicina regenerativa.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

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