Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

O objetivo geral desta técnica é gerar tecido cardíaco tridimensional projetado que pode ser usado como uma plataforma de análise de contração in vitro para triagem de drogas e modelagem de doenças. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo cardíaco sobre modelagem de doenças, farmacologia de segurança e os efeitos de variantes genéticas ou drogas na força contrátil. A principal vantagem dessa técnica é que a força contrátil pode ser medida em tecidos cardíacos projetados de diferentes espécies sob condições estéreis, por longos períodos de tempo.

Os cientistas novos neste método podem lutar com a falta de qualidade celular. Ou falta de um no meio. É importante otimizar a auto-preparação e evitar ciclos do Demonstrando este procedimento estarão Anika Benzin e Umber Saleem.

Antes de iniciar o procedimento, adicione 1,6 mililitros de agarose morna a dois por cento nos poços de primeiros socorros de uma placa de 24 poços. E coloque imediatamente o politetrafluoretileno em espaçadores na agarose. Após cerca de 10 minutos em temperatura ambiente, a agarose ficará opaca, significando sua solidificação.

Remova os espaçadores e coloque os racks PDMS nas peças fundidas de modo que os pares de postes de rack alcancem cada molde de agarose. Quando todos os racks foram colocados, suspendemos os cardiomiócitos em meio a uma concentração mínima de 1,5 vezes 10 a sete células por mililitro e mistura de reconstituição recém-preparada com fibrinogênio 10 a 15 vezes com a pipeta sorológica até que o coágulo de fibrinogênio seja dissolvido. Verifique a homogeneidade da mistura de reconstituição na pipeta.

Em seguida, para cada tecido cardíaco projetado, ou EHT, misture 100 microlitros de mistura de reconstituição com três microlitros de trombina em um tubo de 200 microlitros. E imediatamente alíquota 100 microlitros desta mistura de trombina EHT nas ranhuras de agarose. Use uma nova ponta de filtro para cada EHT.

Depois que todos os slots forem preenchidos com a mistura de reconstituição, feche a tampa da placa de cultura de células e incube as preparações por duas horas a 37 graus Celsius e sete por cento de dióxido de carbono. No final da incubação, coloque a placa em uma capa estéril e cubra cada poço com 200 a 500 microlitros de meio. Agite a placa suavemente e devolva os EHTs à incubadora.

Após 10 minutos, transfira cuidadosamente os racks para uma nova placa de 24 poços contendo 1,5 mililitros de meio EHT por poço e coloque a placa em uma incubadora de cultura de células sob as condições de cultura apropriadas. Alimentando os EHTs todas as segundas, quartas e sextas-feiras, transferindo os racks PDMS para uma segunda placa com meio fresco. Sete a 10 dias após a fundição, os EHTs devem demonstrar contrações espontâneas desviando os postes dos racks do PDMS.

Para analisar as contrações do EHT, no dia do experimento, ligue o dispositivo de aquecimento no instrumento de análise EHT duas horas antes da medição. Imediatamente antes da análise, ligue as fontes de gás e eletrônicas do sistema de eixos. Para uma gravação de linha de base, coloque a placa EHT no instrumento de análise EHT e inicie o software de análise de contração de acordo com as instruções do fabricante.

Usando as instruções do manual do software para iniciar uma nova execução, clique na guia do protocolo para inserir as informações relevantes do estudo. Abra a guia de configuração e escolha os poços para análise. Devido a restrições de tempo, isso é demonstrado apenas para dois EHTs neste vídeo.

Em seguida, clique na guia de visualização da câmera e inicie o modo ao vivo da câmera com o modo de detecção automática de figuras. Ajuste a posição da câmera com as coordenadas xyz para cada poço selecionado no prato de 24 poços, tomando cuidado para que cada EHT esteja no centro da janela e em foco. Certifique-se de que as cruzes azuis estejam nas extremidades superior e inferior dos EHTs e se movendo para corresponder às contrações dos EHTs.

E pressione o botão de posição ok para salvar as posições de configuração de cada poço. Agora clique na guia de parâmetros para definir os critérios pelos quais o software identifica um pico de contração, marcando os picos com quadrados verdes. Salve todas as configurações inseridas pressionando o botão usar parâmetros em todos os poços.

Em seguida, clique na guia automática e no botão Iniciar para registrar as contrações basais do EHT e calcular a contratilidade basal espontânea para cada EHT. A análise de contração ao vivo será exibida na guia em tempo real. Certifique-se de que as cruzes azuis estejam se movendo apenas verticalmente para corresponder às contrações dos EHT's.

Para analisar os efeitos de um medicamento específico de interesse nas contrações, primeiro transfira uma placa de 24 poços cheia de solução de tireoide livre de proteínas sob um capuz estéril e coloque eletrodos de carbono nos poços. Transfira os EHTs em seus racks PDMS em cima dos eletrodos e devolva os EHTs à incubadora. Após cerca de meia hora, coloque os EHTs no intertravamento do instrumento de análise EHT e registre a contratilidade basal espontânea por 20 segundos por EHT.

Em seguida, conecte os eletrodos de carbono ao cabo de estimulação e comece a estimular eletricamente os EHTs. Registre a linha de base ritmada por 10 segundos por EHT, cuidando para que todos os EHTs estejam devidamente ritmados. O sinal de estimulação agora é marcado por linhas verticais azuis, incluídas no enxerto de contração antes de cada pico.

Após o registro da linha de base, transfira os eletrodos e os racks PDMS para uma nova placa de 24 poços contendo a primeira concentração do medicamento e retorne imediatamente os EHTs ao intertravamento do instrumento de análise EHT para uma incubação de 20 minutos. Reconecte os cabos de estimulação, ajuste o reconhecimento da figura e registre as contrações do EHT em resposta à primeira concentração do medicamento. Depois que todas as concentrações de drogas forem testadas, salve todas as gravações em PDF resultantes e verifique cada gravação quanto ao reconhecimento de figuras e ao posicionamento correto dos quadrados e artefatos do pico de contração.

Para análise offline, clique em selecionar execução para a respectiva execução no banco de dados de execuções e, na guia parâmetro, altere o parâmetro para a análise de contração. Em seguida, na guia offline, escolha análise offline para reanalisar os vídeos. Para ajustar o reconhecimento da figura e gravar um novo arquivo de vídeo.

Ajuste o reconhecimento da figura na guia em tempo real e selecione a revisão da amostra. O EHT agora será analisado de acordo com as novas posições. A análise de cada EHT é baseada no reconhecimento de figuras nas extremidades superior e inferior do tecido.

As contrações do EHT filmado são então analisadas automaticamente pelo algoritmo do software do instrumento de análise EHT e os picos são determinados de acordo com os critérios predefinidos relevantes. A medição de longo prazo da análise de contração do EHT demonstra que não há alterações aparentes dependentes do tempo na força de contração, frequência de batimento, contração T1 ou tempos de relaxamento T2 por até 20 horas. Indicando um alto nível de estabilidade para os construtos.

De fato, os resultados para cada sinal EHT são reproduzíveis com baixa variabilidade. A exposição a um bloqueador de canais hERG, no entanto, resulta em um prolongamento significativo do tempo de relaxamento do T2, começando na concentração. E um padrão de batimento irregular em concentrações mais altas.

Uma vez dominados, 24 EHTs podem ser gerados em 30 minutos se a preparação for realizada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da modelagem de doenças explorarem o efeito de variantes genéticas in vitro. A versatilidade deste modelo permite que ele seja combinado com células-tronco induzidas por humanos ou com a tecnologia de edição do genoma.

Após este procedimento, métodos adicionais como histologia ou análise de RNA e proteínas podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre transcrição e expressão gênica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como lançar e analisar EHT's. Se você tiver alguma dúvida sobre este procedimento, não hesite e entre em contato conosco diretamente.