Rato pulmão Slices para Visualize células vivas pulmonar dendríticas precisão de corte

O objetivo geral deste método é utilizar fatias pulmonares cortadas com precisão, ou PCLS, para visualizar a localização e o tráfego de diversos tipos de células imunes no pulmão. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como os padrões de localização e migração das células imunes no pulmão. A principal vantagem desta técnica é que diversas interações podem ser visualizadas em tecido vivo ex vivo que mantém a arquitetura tridimensional do pulmão.

Embora este método possa fornecer informações sobre a localização e o tráfego de células imunes durante a inflamação, ele também pode ser usado para visualizar a contração do tecido das vias aéreas e do músculo liso. Para coletar o tecido pulmonar, use primeiro uma tesoura para abrir a pele e o peritônio desde o meio do abdômen até a mandíbula de um camundongo com seis a doze semanas de idade, e desloque os intestinos para o lado da cavidade abdominal. Corte a veia cava inferior para drenar o sangue dos pulmões e use a ponta afiada da tesoura para perfurar o diafragma, permitindo a expansão da caixa torácica.

Em seguida, use pinças para puxar manualmente as glândulas salivares e outros tecidos para longe da traqueia e use pinças finas para fazer uma incisão na traqueia no lado anterior da faixa mais espessa de cartilagem, apenas grande o suficiente para permitir a penetração de uma agulha de calibre 20. Agora deslize uma agulha de calibre 20 com 1,5 polegada para um segmento de tubo de polietileno e corte o tubo em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Fixe a agulha a uma seringa de um mililitro e aspire 0,8 mililitros de ágarose de ponto de fusão baixo a 2% a 40 graus Celsius para dentro da seringa.

Quando todo o agarose tiver sido carregado, insira a extremidade biselada do tubo na incisão e injete lentamente o agarose nos pulmões. Sem mover a agulha ou a seringa, fixe a seringa com fita adesiva à base de poliestireno para manter a agulha posicionada dentro da traqueia e coloque o animal em armazenamento a 4 graus Celsius por pelo menos 10 minutos. Após a solidificação do agarose, use uma tesoura para ressecar cuidadosamente os pulmões e coloque-os em uma placa de três centímetros contendo PBS gelado.

Em seguida, vire o lobo para o corte do tecido de modo que a seção interna do pulmão que se conecta à traqueia fique voltada para baixo. Para cortar o tecido pulmonar, primeiro coloque uma pequena gota de cola superforte All Purpose No Run em um êmbolo de seringa metálico, espalhando a cola em movimento circular. Quando toda a cola tiver sido aplicada, use uma pinça para segurar imediatamente, mas com cuidado, o lobo excisado com o lado da traqueia para baixo e toque levemente o lobo em um papel absorvente para remover o excesso de líquido.

Coloque cuidadosamente o lobo seco sobre o êmbolo e corte qualquer tecido adicional que ultrapasse a borda do êmbolo. Empurre o êmbolo para baixo, de modo que os lados da seringa metálica subam e envolvam o tecido, formando um compartimento com o pulmão no fundo do corpo da seringa, com profundidade de não mais que alguns centímetros. Fixe com fita adesiva ao redor da base da seringa para manter o êmbolo no lugar.

Em seguida, despeje cuidadosamente 40 graus Celsius de agarose de baixo ponto de fusão a 2% dentro da seringa, de modo que cubra apenas o topo do lobo, e envolva a seringa metálica com um bloco refrigerante gelado. Após um a dois minutos, coloque a seringa com a amostra no fatiador automático e alinhe a lâmina nova. Em seguida, encha o tanque de buffer com PBS gelado.

Alinhe a unidade de acionamento do motor de passo com a seringa do espécime e remova a fita. Gire o interruptor para a posição de avanço rápido, até que a unidade de acionamento do motor de passo toque levemente a parte traseira do êmbolo. Ajuste a espessura do tecido, fatiamento contínuo único, oscilação e as configurações de velocidade no fatiador.

Em seguida, pressione iniciar e use uma espátula fina para coletar cada SCLP conforme ele cai no tanque de tampão, colocando as fatias em poços individuais de uma placa de 24 poços contendo PBS gelado. Para a imagem estática de SCLP, transfira as amostras de pulmão que contêm a área anatômica de interesse para placas individuais de três centímetros contendo um mililitro do coquetel de anticorpos apropriado de interesse. Após 30 a 60 minutos no gelo com agitação e protegido da luz, lave as fatias duas vezes com um mililitro de PBS gelado.

Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS em um novo recipiente redondo de vidro com fundo de vidro de três centímetros por amostra e transfira rapidamente as fatias para cada gota, manipulando suavemente os fragmentos de tecido para que fiquem dispostos planos. Em seguida, aspire o PBS com uma pipeta e coloque uma gota de meio de montagem à temperatura ambiente sobre a lâmina, seguida por uma lamínula de vidro. Para imagens do tecido, coloque o recipiente sobre a platina de um microscópio confocal sob uma objetiva de 20x e use a ferramenta de mosaico para localizar e marcar as bordas do tecido na configuração de envoltória convexa, reduzindo assim o tempo da varredura em mosaico.

Em seguida, defina o intervalo do z-stack, tomando cuidado para que os intervalos definidos sejam apropriados em várias áreas da fatia, particularmente ao longo das bordas. Para o imageamento de células vivas, após 30 minutos de incubação no coquetel de anticorpos de interesse, lave as fatias duas vezes com um mililitro de Leibovitz 10 frio. A seguir, adicione 50 microlitros de Leibovitz 10 fresco em um compartimento de uma lâmina de vidro com câmara por amostra, seguido pela transferência imediata de cada PCLS para o meio, manipulando suavemente os tecidos até que fiquem completamente achatados.

Em seguida, use uma pipeta para aspirar o meio de cada câmara e fixar cada PCLS com um peso de platina. Adicione cuidadosamente matriz extracelular recém-preparada e gelada gota a gota sobre cada PCLS, tomando cuidado para que o gel seja colocado sobre as fatias de pulmão e para que as fatias não flutuem sobre o gel. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, transfira a lâmina para uma câmara de microscopia confocal pré-aquecida, ajustada a 37 graus Celsius, sob uma objetiva de 20x.

Em seguida, defina as faixas de z-stack e de ladrilhos com base no intervalo desejado entre os quadros, utilizando a ferramenta de ladrilhos para delimitar a área de interesse no tecido e a configuração de grade centralizada para centralizar a amostra no campo de visão. As células dendríticas convencionais CD11b altas localizam-se no parênquima pulmonar, enquanto as células dendríticas convencionais CD103 positivas residem principalmente ao redor das vias aéreas e na região subpleural. A dupla marcação para CD88 e CD172a permite distinguir macrófagos alveolares CD172a negativos e CD88 positivos de macrófagos intersticiais CD172a positivos e CD88 positivos, sendo estes últimos preferencialmente localizados no parênquima, e não na área subepitelial.

A dupla marcação para CD90.2, um marcador bem conhecido de linfócitos T, e para a proteína fluorescente TdTomato, um transgene sob controle transcricional de um fator de transcrição mestre necessário para a linfangiogênese, facilita a identificação de estruturas linfáticas no pulmão. Células dendríticas convencionais positivas para CD103 são encontradas em diversas áreas anatômicas, incluindo o epitélio das vias aéreas que expressa CD324, os vasos linfáticos e a região subpleural. O movimento celular e as interações entre células podem ser registrados por meio de imagem celular em tempo real, como acabou de ser demonstrado.

Por exemplo, no experimento representativo, 16 horas após a instilação oral de ova-LPS, células dendríticas positivas para CD103 podem ser claramente observadas interagindo com linfócitos T específicos para ova transferidos adotivamente ao longo de um período de quatro horas. Uma vez dominadas, as técnicas de preparação do tecido e de corte podem ser concluídas em duas horas e meia, se realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de obter uma boa inflação pulmonar com agarose e, posteriormente, manter os cortes pulmonares delicados o mais planos possível para a aquisição de imagens.

Após este procedimento, outros métodos, como tratar fatias pulmonares cortadas com precisão com acetilcolina ou metacolina, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre sinalização de cálcio e contratilidade das vias aéreas em diversas condições de doença. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar fatias pulmonares cortadas com precisão para visualizar a localização, o tráfego e as interações de células imunes no pulmão.