Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

O objetivo geral deste método de imagem de fluorescência é monitorar as mudanças no tráfego de proteínas da membrana e na distribuição intracelular. Este método fornece informações sobre mudanças no tráfego de proteínas, como o efeito de mutações genéticas ou agentes farmacológicos na taxa de entrega de vesículas e expressão de proteínas na superfície celular. A principal vantagem dessa técnica é que as medições podem ser realizadas rapidamente, em alta resolução, em tempo real, sem destruir a amostra.

48 horas antes da imagem, as células 2A do neuroblastoma de camundongo são transfectadas com uma construção de plasmídeo contendo SEP, um fluoróforo sensível ao pH incorporado à região extracelular da proteína de interesse. Quando as células transfectadas estiverem prontas para a imagem, com fluorescência de reflexão interna total ou microscopia TIRF, adicione dois mililitros de solução extracelular de pH 7,4 ou ECS às células. Coloque um prato de células no estágio de tradução e use suportes de palco para prender o prato no lugar.