Name: Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a monitorar o tráfego de proteínas de membrana em células neuroblastoma de camundongo usando microscopia TIRF e pHluorina. Este método permite imagens em tempo real de alta resolução para estudar dinâmica subcelular.

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo Instituto Nacional de Abuso de Drogas T32 DA 016176, Instituto Nacional de Abuso de Drogas DA 038817 e Instituto Nacional de Abuso de Drogas DA 040047.

1. Cultura de Células e Transfecção <ol><li> Manter as células do rato neuroblastoma 2a (N2a) em meio de crescimento. <ol><li> Adicione 500 ml N2a meio de crescimento a partir de 200 ml de meio de Eagle da Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose, 250 ml de meio de soro reduzido, 50 ml de soro fetal de bovino (FBS), e 5 mL de penicilina / estreptomicina (100x). </li><li> Manter as células num frasco de T75 a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> células divididas 1:15, quando necessário, ou em cerca de 80-90% de confluência. Isto é tipicamente 2-3 vezes por semana. </li></ol></li><li> Brasão 35 milímetros prato de vidro de fundo com poli-D-lisina. <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica de fluxo laminar, adicionar 200 ul de 0,1 ug / ml de poli-D-lisina sobre vidro região inferior do prato estéril de 35 mm. </li><li> Coloque um prato em 37 ° C incubadora durante 1 h. </li><li> Cuidadosamente lavar prato com ddH2O 3-4 vezes. </li><li> Permitir pratos para secar completamente durante mais de 1 h. </li><li> Sterilize pratos com luz UV na cabine de segurança biológica, se necessário. </li></ol></li><li> Placa célula N2A para imagens TIRFM. <ol><li> Remover o meio de crescimento a partir de células aderentes. </li><li> Separe as células a partir do balão por incubação com 1 ml de 1x tripsina (+ EDTA) durante 5 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Inactivar a tripsina por adição de 9 ml de meio de crescimento. Misture meios, tripsina e as células descoladas utilizando uma pipeta. </li><li> Visualmente contagem de células usando um hemocitômetro e calcular o volume correto para adicionar 90.000 células a cada vidro revestido prato inferior poli-D lisina. Esta densidade é necessário para a transfecção eficiente e imagiologia TIRF célula única. </li><li> Adicione 2 ml meio de crescimento a cada prato com fundo de vidro contendo 90.000 células. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 16-24 horas. </li></ol></li><li> N2a transfecção <ol><li> Obter uma construção de plasmídeo contendo um fluoróforo setembro incorporadapara a região extracelular da proteína de interesse. Técnicas de clonagem convencionais, tais como amplificação por PCR 5 pode ser usado para gerar a construção. NOTA: setembro deve ser incorporado na região extracelular da proteína de membrana de modo a que reside no interior do lúmen do retículo endoplasmático ou tráfico de vesículas e é exposto à solução extracelular, quando na membrana plasmática. Setembro é semelhante em tamanho a GFP e estratégias de clonagem semelhantes pode ser utilizado. </li><li> Substituir o meio de crescimento em células plaqueadas com 1,5 ml de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM), aproximadamente 30 minutos antes da adição do reagente de transfecção. NOTA: Para estudar mudanças induzidas droga em receptores, uma concentração adequada da droga pode ser adicionado no momento da transfecção. </li><li> Adicionar 500 ng de cada plasmídeo desejado construir a 250 ul de meio de soro reduzido (tubo 1). </li><li> Adicionar 2 mL de reagente de transfecção para um tubo separado containing 250 ul de meio de soro reduzido. Incubar tubo 2 à temperatura ambiente durante 5 min. A proporção de reagente de transfecção de plasmídeo de ADN devem ser optimizados para expressar cada proteína de interesse. </li><li> Combine tubos 1 e 2 para fazer uma solução contendo 500 mL de reagente de transfecção e mix de plasmídeo. Incubar à temperatura ambiente durante 25 min. </li><li> Adicionar 500 ul da mistura de transfecção para células pré-revestida para um volume total de 2 ml por placa. </li><li> Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 24 h. </li><li> Após 24 horas, retire a mistura de transfecção e lavar as células com meio de crescimento e, em seguida, adicionar 2 ml de meio de crescimento para cada prato. NOTA: Se uma droga foi adicionada no momento da transfecção, que pode ser reposta novamente neste passo. </li><li> Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 24 h. </li><li> células de imagem 48 h após a transfecção. </li></ol></li></ol> 2. Imagens de células vivas pela Total EmReflexão terna microscopia de fluorescência (TIRFM) <ol><li> Imagiologia configurado <ol><li> Realizar imagem com um microscópio de fluorescência invertido set-up com uma plataforma de varrimento como se mostra na Figura 1. Isto requer o alinhamento de uma fonte de laser de DPSS 488 nm, um motor passo a passo para ajustar a posição do feixe de 488 nm e uma abertura numérica elevada (1.49 NA) ou 60X 100X objectiva de imersão em óleo. </li><li> Passar o feixe de laser através do filtro de excitação apropriada (488/10 nm passa-banda). Alinhar o feixe de laser polarizada por meio de uma fibra de modo único ligado a um lançador montado um motor de passo. No modo de epifluorescência, o feixe de excitação é centrado no meio da abertura traseira do objectivo. </li><li> Para atingir TIRF, utilizar o motor de passo para converter o feixe de laser focado através da abertura da parte de trás da lente objectiva até que o ângulo crítico é atingido e o feixe não é transmitida através da amostra e em vez disso é totalmente reflectida do vidro-cell interface. </li><li> Capturar imagens usando um EMCCD (512 x 512 pixels) controlada com software de imagem (por exemplo, Metamorph) com o filtro de emissão apropriado montado na via emissão (525/50 nm). </li></ol></li><li> Preparar a solução de imagem <ol><li> Preparar 200 ml solução extracelular (ECS) por mistura de NaCl 150 mM, KCl a 4 mM, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES e 10 mM de glucose em ddH 2 O. As soluções stock de NaCl, KCl, MgCl2, e CaCl2 pode ser preparado antecipadamente e combinado com HEPES fresco e de glucose no dia da imagiologia. </li><li> Ajustar o pH de uma solução contendo 100 ml de ECS para pH 7,4. Ajustar os restantes 100 ml de ECS para um pH de 5,4. Lavar as células transfectadas com 2 ml de ECS (pH 7,4). </li><li> Adicionar 2 ml de ECS (pH 7,4) para as células transfectadas antes de imagem. </li></ol></li><li> Imagens de células vivas em TIRF <ol><li> Ligue todo o sistema, incluindg 488 a laser nm, câmera, fase de tradução e programa de imagem. Focar o feixe de epifluorescência e ajustar a potência para aproximadamente 1 mW ao objetivo 60X. </li><li> Adicione o óleo para o objectivo e coloque uma placa de células transfectadas na fase de tradução. Fixar o prato no lugar utilizando montagens de palco para garantir que ele não se move em relação à fase de modo que as células podem ser trabalhada várias vezes. </li><li> No modo de epifluorescência, focar o microscópio e localizar as células fluorescentes, transfectadas. Células continuará focada em vários planos focais. Localize células individuais, isolados para prosseguir com TIRF. </li><li> No programa de imagem, definir o tempo de exposição a 200 ms e otimizar a intensidade de fluorescência, definindo o ganho de EM. </li><li> Transição do feixe de laser em TIRF ao traduzir o feixe através do objectivo de uma forma passo a passo utilizando o motor passo a passo. Como as abordagens ângulo crítico, visivelmente o feixe vai traduzir em toda a borda do prato até que converge no the ponto de reflexão interna total sobre o plano da amostra. </li><li> Verifique se as células estão em modo de TIRF, ajustando o botão de foco. Em TIRF, apenas um plano de células pode ser focado (isto é, aproximadamente a 150 nm, a partir da interface de vidro), a produção de uma imagem bem definida com alta resolução da membrana plasmática. </li></ol></li><li> Imagiologia setembro para determinar a localização subcelular <ol><li> Localize as células saudáveis, transfectadas, único no plano de imagem. </li><li> Adquirir uma imagem focalizada de celular em pH 7,4. Setembro marcado receptores na membrana plasmática e do retículo endoplasmático deve ser visível. </li><li> bloquear rapidamente o feixe de laser de atingir a amostra para evitar a fotodegradação. </li><li> Memorizar as posições de palco correspondentes a cada célula usando software de imagem de microscópio capaz de gravar vários locais XY. </li><li> Repetir passos 20-30 2.4.1-2.4.4 para células por prato, enquanto utilizando o software para gravar a posição de cada célula. </li><li> AfTer todas as imagens de células a pH 7,4 são recolhidos, remover manualmente a solução de pH 7,4 ECS utilizando uma pipeta. Não toque o prato, pois isso pode mover as posições de palco memorizadas. </li><li> Adiciona-se cuidadosamente 2 ml de pH 5,4 ECS para o prato e esperar 10 min. Durante este tempo, salvar imagens adquiridas anteriormente. </li><li> Sob um conjunto idêntico de condições utilizadas para recolher imagens a pH 7,4, mover o palco para cada posição guardada e adquirir uma imagem da mesma célula a um pH de 5,4. As células devem olhar menos definida uma vez que todos fluorescência detectada é proveniente de retículo endoplasmático confinados setembro marcado receptores. Salve as imagens de células pH 5.4. </li></ol></li><li> Eventos de inserção vesícula individuais de imagem em células vivas <ol><li> Substituir o meio de crescimento de células transfectadas com 2 ml pH 7,4 a ECS, ou com meio L-15 de Leibovitz. O pH dos meios de L-15 de Leibovitz é CO 2 independente, permitindo que a imagem ter lugar ao longo de um longo período de tempo, se necessário. </li><li> PlacPT A placa de células transfectadas no palco de microscópio. Seguros e focar uma única célula na TIRF seguinte Passo 2.3 acima. </li><li> Se equipado, ajustar o foco automático para que o foco não deriva ao longo do período de geração de imagens. </li><li> Gravar uma série de 1.000 quadros, capturando continuamente imagens em um frame rate de 200 ms. Rajadas de fluorescência será visível durante este tempo, correspondendo a vesículas de baixo pH de tráfico de fusão com a membrana plasmática, expondo o SEP para o pH extracelular 7,4. </li><li> Localizar outro única célula e repita o passo acima. Repor a focagem automática, se necessário. </li></ol></li></ol> Análise 3. Imagem e Processamento de Dados <ol><li> Analisando setembro de fluorescência para determinar a localização subcelular <ol><li> Abra as imagens de células usando um software de análise de imagem, tais como Metamorph ou ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Subtrair o fundo de ambos os pH 5,4 e pH 7,4 imagens usando a configuração de bola rolando.</li><li> Usar um limiar baseado intensidade de fluorescência de quantificar a partir de uma única célula. selecionar manualmente uma região de interesse em torno da célula na imagem do pH 7,4. </li><li> Medir a área da célula, intensidade média, e densidade integrada usando um plugin no ImageJ ou usando o construído em função de &quot;Medida&quot; sob a guia Analisar. </li><li> Repetir passos 3.1.1-3.1.3 para a mesma célula, a pH 5,4, ajustando cuidadosamente o limiar de intensidade e baseadas região de interesse da mesma maneira. </li><li> Depois de a densidade integrada é obtido para as imagens das células, tanto a pH 7,4 e 5,4, calcular a membrana plasmática densidade integrada subtraindo-se o valor de pH de 5,4 a 7,4 do valor do pH. A diferença corresponde aos receptores número relativo sobre a membrana de plasma no interior da região de excitação TIRF. </li><li> Como uma medida de tráfico, calcular a percentagem relativa de setembro marcado receptores localizados na membrana do plasma em comparação com os restantes receptores visíveis nas excitati TIRFem volume de dividindo a membrana plasmática densidade integrada por a densidade total integrada a pH 7,4, multiplicado por 100. </li></ol></li><li> Analisando os eventos de inserção única vesícula <ol><li> Abrir a série de 1.000 imagens TIFF usando o software de análise de imagem. Subtrair o fundo de todos os quadros usando a configuração de bola rolando. </li><li> Ajustar o equilíbrio de cores da gravação para maximizar regiões intensas correspondentes a vesícula eventos de inserção. contar manualmente as rajadas de fluorescência com duração superior a 3 quadros (&gt; 600 ms). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A sensibilidade de setembro pH permite receptores que residem na membrana plasmática de ser distinguido de receptores intracelulares no retículo endoplasmático, e pode ser usado para resolver eventos de inserção de vesículas 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 receptor de transporte . Várias técnicas, i...

As alterações na expressão do receptor, distribuição e montagem ter sido ligado a uma grande variedade de doenças, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, fibrose cística, e dependência de drogas 1, 2, 3, 4, 5. Por exemplo, a nicotina e outros ligandos nicotínicos influenciar o tráfico de receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChR) que conduzem a mudanças no tráfico, expressão, e regulação positiva 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. A nicotina aumenta o número total de nAChRs montados dentro de uma célula, aumenta tráfico para a membrana plasmática, umad altera a montagem de subunidades para favorecer uma versão de alta sensibilidade de alguns subtipos. Resolvendo alterações distintas no tráfico, montagem e expressão de receptores em um modelo de doença fornece detalhes mecanicistas cruciais que são essenciais para definir alvos de drogas. Uma abordagem ideal seria rapidamente diferenciar entre receptores intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. Isto é particularmente difícil nos casos em que uma maior parte de uma proteína particular reside intracelularmente, tais como com os nAChRs. Uma vez que a maioria dos nAChRs são localizados no retículo endoplasmático, as medidas tradicionais não têm a resolução espaço-temporal necessário para identificar alterações de localização e de tráfico ao longo da via secretora. Tráfico receptor e estudos de expressão de nAChRs foram essencialmente realizados utilizando radioligandos de ligação 11, 12 Os ensaios de biotinilação, Western blotting 13, ou imunoprecipitação Techniq<html> ues 12. Estes dependem da especificidade de ligação de uma molécula repórter ou a fixação das células e não têm a capacidade de distinguir entre simultaneamente membrana plasmática residente e receptores intracelulares. Portanto, estudos de montagem canal iônico e vesículas dinâmica em grande parte contou com baixo rendimento técnicas eletrofisiológicas 14. resolução espacial e temporal superior é possível com os avanços na microscopia de fluorescência. Moléculas repórter codificados geneticamente, tais como a proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes, eliminar os problemas de ligação não específicos e aumentar a sensibilidade 15. Uma variante sensível ao pH da GFP, conhecido como pHluorin superecliptic (SEP), pode ser utilizada para explorar as diferenças inerentes entre os compartimentos de pH dentro de uma célula para determinar a localização 5, 7, 8,Ref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. setembro fluoresce quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado, a pH baixo. Assim, os receptores marcados com setembro do seu lado luminal são detectados quando presente no retículo endoplasmático ( ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico. a manipulação do pH extracelular em contacto com receptores na membrana plasmática, por conseguinte, altera a fluorescência e, portanto, a detecção destes receptores. Se a mesma célula é fotografada sequencialmente a ambos um pH extracelular neutra e, em seguida, um pH inferior a 6, a diferença entre as imagens é atribuída a receptores localizados na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de intracelular (ER periférica) e receptores de membrana residentes de plasma 5, 7, 8 </sup&gt;, 9. eventos de inserção de vesículas standard também pode ser resolvido quando o pH extracelular é neutro. Uma vez que um baixo pH tráfico de vesículas funde com a membrana plasmática, o lado luminal da vesícula é exposto à solução extracelular neutro, fazendo com que uma transição detectado como uma explosão de fluorescência 7, 18, 19, 20. Setembro permite a medição dos receptores localizados na membrana plasmática e do retículo endoplasmático periférica, e proporciona um meio para medir o tráfico de receptores entre estas regiões subcelulares 5, 7, 18. Para alcançar maior resolução na membrana plasmática, um receptor com a SEP geneticamente codificado é fotografada por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). Este método é particularmenteútil se a maioria dos receptores são localizada em regiões intracelulares, uma vez que TIRFM aumenta a visibilidade da membrana do plasma. TIRFM também permite a resolução da dinâmica do tráfico de vesículas simples que transportem receptores SEP-marcados mediante inserção no PM. A reflexão interna total ocorre na interface entre materiais com diferentes índices de refracção, tal como entre uma célula e uma lamela de vidro 21, 22. Setembro fluoresce quando irradiado com 488 nm de excitação, que é orientada para alcançar reflexão interna total na interface da solução de vidro e de células. Isto produz uma onda evanescente que penetra cerca de 150 nm para a amostra, apenas fluoróforos excitantes no interior deste volume. Apenas setembro contendo receptores num ambiente de pH neutro dentro desta gama de excitação são detectados, correspondentes àqueles que residem na membrana plasmática ou retículo endoplasmático periférica. Uma vez que a detecção é limitado tO excitação por onda evanescente, a fluorescência de fundo da região intracelular é reduzida e a relação sinal-ruído é aumentada 21, 22. Além disso, uma vez que a radiação não penetra na massa da célula, fotodano é minimizado o que permite imagens de células vivas ao longo do tempo. Como resultado, acoplado com TIRFM geneticamente codificado setembro fornece a alta resolução e sensibilidade requerida para medir a localização subcelular e tráfico dinâmica de receptores da membrana ao longo da via secretora.

<table><tbody><tr><td>Reagent/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Frascos com tampa de filtro, estéreis, Greiner Bio One, 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri com fundo de vidro de 35 mm, estéril</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium&lrm; (DMEM), Alta Glicose</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-965-084&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido</td><td>Médio Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, Certificado, Origem nos EUA, Padrão (Filtrado Estéril)&nbsp;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x), sem vermelho de fenol</td> Solução de penicilina-estreptomicina <td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Meio L-15 de Leibovitz, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina</td> Opcional <td>Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td>Misture delicadamente; Não vórtice</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td> Óleo de imersão <td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Objective&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Tipo F</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Câmera Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>60X, 1,49 NA objetiva de imersão em óleo</td><td>Olympus</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Estágio motorizado</td><td>Atuador motorizado IXPROXY</td><td></td><td></td>anterior</tr><tr><td>(motor de passo)</td> <td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph (ou outro programa de imagem)</td> <td>Laser Metamorfo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm</td><td>Tecnologia de mercado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibra</td> <td>monomodoThorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>Espelhos</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>Dicróico 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda, 488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda, 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando receptores phluorin-tag para monitorar subcelular localização e tráfico

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Entendimento tráfico de membrana proteína, reunião e expressão requer uma abordagem que diferencia entre aqueles que residem em organelas intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. medidas tradicionais baseados em fluorescência não têm a capacidade de distinguir as proteínas da membrana que residem em diferentes organelos. metodologias de ponta transcender os métodos tradicionais por acoplamento fluoróforos sensíveis ao pH com microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). TIRF iluminação excita a amostra até cerca de 150 nm a partir da interface de amostra de vidro, diminuindo, assim, o fundo, aumentando a relação sinal-ruído, e aumentando resolução. O volume de excitação em TIRFM abrange a membrana plasmática e organelas nas proximidades, tal como o ER periférica. Superecliptic pHluorin (SEP) é uma versão sensível ao pH da GFP. Geneticamente que codifica setembro para o domínio extracelular de uma proteína de membrana de interesse posiciona o fluoróforo sobreo lado luminal do RE e na região extracelular da célula. Setembro é fluorescente quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado a valores de pH mais baixos. Portanto, os receptores marcados com fluorescência quando setembro residente no retículo endoplasmático (ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico ou outros organelos tais como Golgi. O pH extracelular pode ser ajustado para ditar a fluorescência de receptores na membrana plasmática. A diferença na fluorescência entre as imagens TIRF a pH extracelular neutros e ácidos para a mesma célula corresponde a um número relativo de receptores na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de receptores residentes intracelulares e de membrana de plasma. eventos de inserção de vesículas standard também pode ser medida quando o pH extracelular é neutra, correspondendo a uma vesícula de baixo pH o tráfico de fusão com a membrana plasmática e a transição para um estado fluorescente. este versatile técnica pode ser explorada para estudar a localização, a expressão, e o tráfico de proteínas de membrana.

Setembro incorporação num receptor permite a detecção directa de que o receptor de uma célula viva. Juntamente com TIRFM, isto permite a avaliação dos níveis de expressão relativa na membrana do plasma e a distribuição de receptores dentro dos locais subcelulares na região de excitação TIRF. eventos individuais tráfego de vesículas pode também ser resolvido. Níveis de expressão relativa de receptores SEP-marcados no Plasma Membra...

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

O objetivo geral deste método de imagem de fluorescência é monitorar alterações no tráfego de proteínas de membrana e na distribuição intracelular. Este método fornece informações sobre mudanças no tráfego de proteínas, como o efeito de mutações genéticas ou agentes farmacológicos na taxa de entrega de vesículas e na expressão proteica na superfície celular. A principal vantagem desta técnica é que as medições podem ser realizadas rapidamente, com alta resolução, em tempo real e sem destruir a amostra.48 horas antes da aquisição de imagens, as células de neuroblastoma murino 2A são transfectadas com um construto de plasmídeo contendo SEP, um fluoróforo sensível ao pH incorporado à região extracelular da proteína de interesse. Quando as células transfectadas estiverem prontas para a aquisição de imagens, por microscopia de fluorescência com reflexão total ou microscopia TIRF, adicione dois mililitros de solução extracelular (ECS) com pH 7,4 às células. Coloque um recipiente com as células sobre a platina de translação e utilize suportes da platina para fixar o recipiente no lugar.No modo de epifluorescência, foque o microscópio e localize as células transfectadas fluorescentes. As c

utilizing-phluorin-tagged-receptors-to-monitor-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este relatório descreve a utilização de imagens de células vivas e técnicas photobleach para determinar a expressão de superfície, as vias de transporte e de cinética de tráfico de exogenamente expressa, GFP sensível ao pH proteínas na membrana plasmática dos neurónios.

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Ao marcar os domínios extracelulares dos receptores de membrana com pHluorin superecliptic, e por imagiologia estes receptores de fusão em neurónios de rato em cultura, pode-se visualizar directamente os eventos de inserção individuais vesiculares dos receptores na membrana plasmática. Esta técnica será útil para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a inserção do receptor para a membrana plasmática.

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

Descrevemos aqui o uso de uma variante de proteína fluorescente verde sensível ao pH, pHluorin, para estudar a dinâmica espátula-temporal dos receptores de orientação de axônio que traficam na superfície celular. O receptor com marca de phluorina é expresso tanto na cultura celular quanto in vivo,usando eletroporação do embrião de filhote.

Uso de pHluorin para avaliar a dinâmica dos receptores de orientação de axônio na cultura celular e no embrião de filhotes

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.

Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

A quantificação precisa dos eventos de tráfego vesicular geralmente fornece informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas e os efeitos das mutações. Este artigo apresenta métodos para o uso da pHluorina supereclíptica, uma variante de GFP sensível ao pH, como ferramenta para quantificação de eventos endocíticos em células vivas usando microscopia de fluorescência quantitativa e citometria de fluxo.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

Aqui, métodos não invasivos são descritos para localização de proteínas de membrana fotorreceptora e avaliação da degeneração da retina no olho composto de Drosophila usando fluorescência eGFP.

Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP

Aprenda a monitorar o tráfego de proteínas de membrana em células neuroblastoma de camundongo usando microscopia TIRF e pHluorina. Este método permite imagens em tempo real de alta resolução para estudar dinâmica subcelular.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

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