Name: A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Oligï¿½ero (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprenda um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 de alta pureza, capazes de formar oligômeros para pesquisa da doença de Alzheimer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer à Agilent por sua assistência técnica. Kate Markham e Rafael Palomino são creditados por sua ajuda inicial na síntese e purificação do peptídeo Aβ e o Dr. Hsiau-Wei Lee é agradecido por sua ajuda na preparação da Figura 1 do manuscrito.

1. Purificação por HPLC Preparativa do Peptídeo Aβ40 ou Aβ42
<ol>
	<li>Prepare os seguintes tampões para a purificação por CLAE.
	<ol>
		<li>Prepare o tampão A (20 mM NH4OH) adicionando 1,3 mL de NH4OH (solução a 28%) a 1.000 mL de água ultrapura.</li>
		<li>Prepare o tampão B (80% de acetonitrila com 20 mM NH4OH) adicionando 1,3 mL de NH4OH (solução a 28%) a uma solução contendo 800 mL de acetonitrila grau CLAE e 200 mL de água ultrapura.</li>
		<li>Prepare o tampão de dissolução da amostra (0,1% de NH4OH) adicionando 100 µL de NH4OH (solução a 28%) a 100 mL de água ultrapura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configure o instrumento de CLAE conforme mostrado na Figura 1.
	<ol>
		<li>Conecte os frascos de solvente contendo o tampão A e o tampão B às entradas da bomba de CLAE utilizando tubos de polímero. Fixe os tubos de polímero à bomba de CLAE com uma conexão de peça única. Certifique-se de que os tubos de polímero de cada tampão estejam conectados à válvula de entrada correta do instrumento. Instale um desgaseificador na bomba de CLAE.</li>
		<li>Conecte a bomba de CLAE à entrada da coluna preparativa de 300 Å, 8 µm, 25 mm х 300 mm (Figura 1B, coluna mais à esquerda, veja a Lista de Materiais) utilizando tubos de polímero.
		<ol>
			<li>Fixe o tubo de polímero à coluna preparativa com uma conexão de peça única apertada com os dedos. Certifique-se de que o tubo de polímero esteja orientado corretamente. 
			NOTA: A fase estacionária da coluna preparativa é composta por partículas de poli(estireno-divinilbenzeno). A orientação correta do tubo de polímero é indicada na carcaça externa com uma única seta direcional.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Conecte a saída da coluna ao detector de duplo comprimento de onda utilizando tubos de polímero e configure o detector para 214 nm e 280 nm.
		<ol>
			<li>Altere o comprimento de onda ajustando os parâmetros de comprimento de onda de detecção na opção de método de configuração do instrumento no software interno da CLAE.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Conecte o tubo de polímero à entrada do detector de comprimento de onda com uma conexão de peça única apertada com os dedos. Conecte um tubo de polímero à válvula de saída do detector de comprimento de onda. Conecte o tubo de polímero à válvula de saída do detector de CLAE com uma conexão de peça única apertada com os dedos. Este será o tubo de coleta da amostra. 
		NOTA: A ausência de um cromóforo forte no peptídeo Aβ determina que 214 nm seja utilizado como comprimento de onda ultravioleta (UV) principal para a coleta dos picos.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Configuração do sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para separação e análise de compostos." src="/files/ftp_upload/55482/55482fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Configuração experimental do instrumento de CLAE utilizado para a purificação dos peptídeos beta-amiloides. (A) A bomba quaternária de CLAE equipada com desgaseificador e detector de comprimento de onda variável ajustado em 214 nm e 280 nm; (B) Colunas de CLAE utilizadas para a purificação dos peptídeos beta-amiloides, da esquerda para a direita, coluna preparativa de 25 x 300 mm2, coluna semipreparativa de 7,5 x 300 mm2 e coluna analítica de 4,6 x 250 mm2; (C) Injetor manual com alça de injeção de aço inoxidável de 20 µL utilizada para CLAE analítica; (D) Injetor manual com alça de injeção de aço inoxidável de 10 mL utilizada para purificação preparativa e semipreparativa. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55482/55482fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="3">
	<li>Configure o software da CLAE para executar o método de purificação conforme mostrado na Tabela 1. Insira o método de purificação alterando o parâmetro de cronograma do solvente (na opção de configuração do método do instrumento incorporada ao software da CLAE). Ligue a bomba da CLAE clicando no botão "on" no software da CLAE. 
	NOTA: A bomba começará a fornecer a proporção inicial dos tampões A e B através da coluna preparativa e do instrumento de CLAE.
	<ol>
		<li>Deixe o sistema por 30 min para completar a equilibração.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tempo / min</td>
			<td>% do Tampão Aa</td>
			<td>% do Tampão Bb</td>
			<td>Taxa de Fluxod / mL min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>80</td>
			<td>20</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>75,5</td>
			<td>24,5</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45,01</td>
			<td>80</td>
			<td>20</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52,01</td>
			<td>80</td>
			<td>20</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52,02</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92</td>
			<td>5</td>
			<td>95c</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Cronograma para a purificação dos peptídeos Aβ42 e Aβ40 utilizando a coluna polimérica de 25 × 300 mm. aTampão A - H2O com 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O com 20 mM NH4OH; cExecutado por 15 min para lavar a coluna antes da próxima injeção da amostra; dPara operar uma vazão de 6 mL/min no equipamento de CLAE, o limite de pressão precisa ser reduzido para 200 bar.
<ol start="4">
	<li>Purificação da amostra do peptídeo Aβ 
	Observação: O peptídeo bruto foi obtido por meio de síntese automatizada de peptídeos em fase sólida.10
	<ol>
		<li>Dissolva 3 mg do peptídeo Aβ bruto em 4 mL do tampão de dissolução da amostra. Sonique a amostra por 30-60 s à temperatura ambiente e com frequência de 40 kHz para auxiliar na dissolução.</li>
		<li>Introduza toda a amostra na coluna de CLAE usando uma seringa plástica de 5 mL acoplada a uma agulha de aço inoxidável de 16 polegadas. Execute o método de purificação conforme descrito na subetapa 1.3. 
		OBSERVAÇÃO: O sistema permite a injeção da amostra por meio de um injetor manual equipado com um loop de injeção de 10 mL feito de aço inoxidável (Figura 1D). O peptídeo Aβ desejado será eluído entre 72 e 74 min como um pico nítido e bem resolvido (Figura 2C).</li>
		<li>Recolha a amostra em um tubo cônico de centrífuga de 50 mL. Confirme a identidade do pico de Aβ por espectrometria de massas com injeção direta do eluente coletado.11 Armazene o eluente por até 12 h a -20 °C. 
		OBSERVAÇÃO: Não é recomendado armazenar a solução por períodos superiores a 12 h devido ao risco de oxidação do peptídeo.</li>
		<li>Isole o peptídeo purificado congelando rapidamente a(s) alíquota(s) coletada(s) do peptídeo Aβ em nitrogênio líquido e liofilize. Realize a liofilização secando a amostra por congelamento a uma temperatura de -60 °C e pressão de 20 mTorr por um período de 24 h.</li>
		<li>Execute o protocolo analítico de CLAE conforme descrito abaixo para determinar a pureza do peptídeo Aβ. Armazene os peptídeos na forma liofilizada a -20 °C por até 6 meses.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Análise por HPLC Analítica da Proteína Aβ Purificada
<ol>
	<li>Prepare os tampões de CLAE conforme descrito na subseção 1.1 do protocolo acima.</li>
	<li>Monte a CLAE analítica conforme o passo 1.2.1 e conforme ilustrado na Figura 1, com a coluna analítica de 4,6 × 250 mm (Figura 1B, coluna mais à direita) e o injetor manual com alça de injeção de aço inoxidável de 20 µL (Figura 1C) acoplado ao instrumento.</li>
	<li>Configure o software da CLAE para executar o método analítico conforme mostrado na Tabela 2, seguindo instruções semelhantes às do passo 1.3.</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tempo / min</td>
			<td>% do Tampão Aa</td>
			<td>% do Tampão Bb</td>
			<td>Taxa de Fluxo / mL min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>95</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Cronograma para a análise de pureza por CLAE do peptídeo Aβ. aTampão A - H2O com 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O com 20 mM NH4OH.
<ol start="4">
	<li>Análise de pureza do peptídeo Aβ
	<ol>
		<li>Prepare uma solução de 1 mg/mL do peptídeo purificado pela dissolução do peptídeo na solução tampão amostral. 
		NOTA: A receita do tampão pode ser encontrada na subseção 1.1. A concentração proteica é determinada pela medição da absorção da proteína a 280 nm (A280nm).12 O coeficiente de extinção molar (ε) utilizado para determinar a concentração é ε = 1.490 dm3 mol-1 cm-1.13</li>
		<li>Injete 20 µL da solução de 1 mg/mL (222 µM) na coluna de CLAE e execute o método analítico configurado na etapa 2.3. 
		NOTA: A solução remanescente não utilizada para análise pode ser congelada rapidamente em nitrogênio líquido e liofilizada para recuperar o peptídeo Aβ. Os detalhes da liofilização podem ser encontrados na subseção 1.4.4. O peptídeo Aβ será eluído da coluna analítica entre 16 e 18 min (Figura 2D). Utilize o software de análise de integração embutido que acompanha o instrumento de CLAE para determinar a pureza do peptídeo Aβ. A pureza é determinada pela integração de cada pico individual no espectro e pelo cálculo da porcentagem da área do pico do peptídeo. Normalmente, deve-se obter uma pureza de &gt;95%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Resultados da cromatografia, gráfico de absorbância versus tempo, análise de separação de proteínas, picos marcados." src="/files/ftp_upload/55482/55482fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Traçados representativos de CLAE de Aβ42. (A) Purificação tradicional em sílica C4, condições: Tampão A: H2O com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), tampão B: MeCN (acrilonitrila) com 0,1% de TFA, gradiente: 20 a 27% do tampão B em 40 min, seguido por 27% isocrático do tampão B; (B) Purificação preparativa utilizando coluna polimérica de 25 x 300 mm2, condições: Tampão A: H2O com 20 mM de NH4OH, tampão B: 80% MeCN / 20% H2O com 20 mM de NH4OH, gradiente: 20 a 27% do tampão B em 70 min, seguido por 27% isocrático do tampão B; (C) Purificação preparativa otimizada utilizando coluna polimérica de 25 x 300 mm2, condições descritas na Tabela 1 localizada na subseção 1.3 do texto descritivo do protocolo; (D) CLAE analítica utilizando coluna polimérica de 4,6 x 250 mm2, condições: Tampão A: H2O com 20 mM de NH4OH, tampão B: 80% MeCN / 20% H2O com 20 mM de NH4OH, gradiente: 5 a 50% do tampão B em 30 min. Nas partes A, B e C, o pico correspondente ao Aβ42 é marcado por um asterisco. A coleta do pico de Aβ42 marcado na parte C revela uma pureza de &gt;95%, conforme mostrado na parte D. A espectrometria de massas foi utilizada para determinar a identidade do pico de Aβ42. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55482/55482fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>McGowan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A%CE%B242+Is+Essential+for+Parenchymal+and+Vascular+Amyloid+Deposition+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice.</a> Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/100/18/10417.abstract">Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Oligomers+of+the+Amyloid+%CE%B2-Protein+Impair+Synaptic+Plasticity+and+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior.</a> Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).</li>
<li>Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+and+Chemical+Factors+Affecting+Amyloid+%CE%B2+Peptide+Amyloidogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity.</a> Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).</li>
<li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2346586/">Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide.</a> J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).</li>
<li>Fezoui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+preparing+the+amyloid+beta-protein+for+fibrillogenesis+and+neurotoxicity+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments.</a> Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).</li>
<li>Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+on+polystyrene-divinylbenzene+columns+for+the+rapid+separation+and+purification+of+acid-soluble+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins.</a> J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).</li>
<li>Thess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-engineered+mRNA+Without+Chemical+Nucleoside+Modifications+Enables+an+Effective+Protein+Therapy+in+Large+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals.</a> Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).</li>
<li>Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+D-glutamate+at+a+critical+residue+of+A%CE%B242+stabilizes+a+pre-fibrillary+aggregate+with+enhanced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eur+J%22%5BJournal%5D)">Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity.</a> Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).</li>
<li>Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+High-performance+Liquid+Chromatography%2FMass+Spectrometric+Investigation+of+Amyloid-%CE%B2+Peptide+Variants+Found+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).</li>
<li>Layne, E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279960568_Spectrophotometric_and_Turbidimetric_Methods_for_Measuring_Proteins">Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins.</a> Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).</li>
<li>Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268005X1400469X">Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer.</a> Food Hydro. 46, 216-225 (2015).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-Induced+Cross-Linking+of+Unmodified+Proteins+%28PICUP%29+Applied+to+Amyloidogenic+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides.</a> J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12506200">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A purificação por HPLC do peptídeo Aβ é altamente dependente da escolha da fase estacionária empregada na purificação e da fase móvel escolhida para eluir o peptídeo. O baixo ponto isoelétrico do peptídeo e a alta propensão à agregação tornam desafiadoras as condições cromatográficas tradicionais para a separação de proteínas hidrofóbicas (fase estacionária C4 ou C8 acoplada a um eluente móvel ácido), com o peptídeo Aβ eluindo como um pico amplo e não resolvido prolongado (Figura 2A).
<p class="jove_...

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que os efeitos de mais de 35 milhões de pessoas em todo o mundo. 1 Implicado fortemente no início e desenvolvimento da doença, é altamente propensos a agregação, peptídeo hidrofóbico beta-amilóide (Ap). Ap 2 varia de 36 a 43 aminoácidos de comprimento, no entanto, pensa-se que o 42-amino ácido variante, beta amilóide 42 (Aβ42), é a forma mais tóxica da proteína. 3 Isto é devido em grande parte à capacidade de Aβ42 para formar prontamente difusï¿½eis, espécies oligoméricas que se acredita ser entidades particularmente neurotóxicos. 4 A fim de promover nossa compreensão do peptídeo Aâ, é essencial para obter rotineiramente material de alta pureza. A presença de vestígios de impurezas foi mostrado para alterar drasticamente as propriedades de agregação propensão do péptido. 5 Traditionally, a cromatografia líquida (HPLC) de separação dos péptidos hidrofóbicos, tais como Ap alto desempenho tem sido feito através da utilização de uma combinação de C 4 ou C 8 fases estacionárias à base de sílica e uma fase móvel de ácido. 6 No entanto, tais condições podem apresentar um desafio para a purificação do péptido. O ponto isoeléctrico baixo do péptido Ap (pi de aproximadamente 5,5) 7 significa que, sob condições ácidas, a agregação peptídica é aumentada e, como resultado grandes picos de HPLC, não resolvidas que são muitas vezes difíceis de isolar são produzidas (Figura 2A). Além disso, esses picos largos contêm frequentemente impurezas que podem ter impacto no perfil de agregação do peptídeo, e geralmente requerem ciclos subsequentes de purificação, que podem ter impacto dramaticamente a quantidade de péptido produzida. O poli (estireno / divinilbenzeno) de fase estacionária, PLRP-S, representa um meio alternativo de PurifYing péptidos hidrofóbicos. A fase estacionária foi utilizado na purificação de um número de diferentes proteínas e ácidos ribonucleicos mensageiro (mRNA). 8, 9 A fase estacionária PLRP-S requer nenhum ligando de alquilo adicional para a separação de fase reversa, e o mais importante é quimicamente estável a um pH elevado, que leva a desagregação do péptido. 7 Relata-se um protocolo de purificação HPLC adaptado que produz alta pureza amyloid beta 42 (Aβ42) e beta 40 peptídeos amilóides (Aβ40).

<table><tbody><tr><td>Bomba quaternária Agilent 1260 Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G7111B</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II Detector de comprimento de onda variável duplo</td><td>Agilent</td><td>G7114A</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector</td></tr><tr><td>Injetor Manual Agilent 1260 Infinity II equipado com loop de amostra de aço inoxidável de 10 mL</td><td>Agilent</td><td>0101-1232</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td></tr><tr><td>Injetor Manual Agilent 1260 Infinity II equipado com 20 &micro; L laço de amostra de aço inoxidável</td><td>Agilent</td><td>G1328C</td><td>Suporte de montagem de http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td></tr><tr><td>anel</td><td>Agilent</td><td>1400-3166</td><td></td></tr><tr><td>Agilent PLRP-S 300 &nbsp; 5&nbsp; &micro; m 4,6 x 250 mm (Analítico)</td><td>Agilent</td><td>PL1512-5501</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features</td></tr><tr><td>A&beta; 42 ou A&beta; 40 peptídeos</td><td></td><td></td><td>Sintetizado internamente usando um sintetizador de peptídeos automatizado CEM liberty.</td></tr><tr><td>Hidróxido de Amônio (NH4OH, solução a 28%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td></td></tr> Tubo de <tr><td>centrífuga cônico Falcon de 50 mL</td> da Fisher <td>Scientific</td> W5-4 Falcon Conector Supelco PEEK <td>Fisher Scientific 14-954-49A</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Peça única apertada com os dedos, pacote de 5 ea <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z227250</td><td></td></tr><tr><td>Normject 5&nbsp; seringa estéril do CC</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481729</td><td></td></tr><tr><td>16 calibre SS agulha</td><td>Rheodyne</td><td>3725-086</td><td></td></tr></tbody></table>

a purificação protocolo tailored hplc que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 peptides, capaz de formação oligï¿½ero

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Peptídeos amiloidogênicos, como o beta amilóide (Aβ) implicado na doença de Alzheimer, podem apresentar um desafio significativo ao tentar obter material de alta pureza. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado para produzir peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza. Descobrimos que a combinação de fase estacionária hidrofóbica de poli(estireno/divinilbenzeno) disponível comercialmente, fase reversa de laboratório de polímeros - estirenodivinilbenzeno (PLRP-S) sob condições de pH alto, permite a obtenção de Aβ42 de alta pureza (>95%) em uma única corrida cromatográfica. A purificação é altamente reprodutível e pode ser alterada para condições semipreparativas e analíticas, dependendo da quantidade de material que se deseja purificar. O protocolo também pode ser aplicado ao peptídeo Aβ40 com idêntico sucesso e sem a necessidade de alterar o método.

A purificação do peptídeo Aβ42 utilizando uma combinação da fase estacionária PLRP-S e uma fase móvel de pH elevado resulta na formação de um pico nítido e bem resolvido para o peptídeo Aβ em um tempo de retenção entre 72 e 74 minFigura 2C). A confirmação da identidade do pico é realizada por espectrometria de massas com injeção direta do eluente coletado. O eluente pode ser armazenado a -20 °C em solução por até 12 h. Períodos mais longos de armazenamento podem resultar ...

Aqui, relatamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza, capazes de formação de oligômeros. A beta-amiloide é um peptídeo hidrofóbico altamente propenso a agregação implicado na doença de Alzheimer. A natureza amiloidogênica do peptídeo torna sua purificação um desafio.

A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Oligï¿½ero

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a purificação por CLAE para produzir peptídeos de beta amiloide 42 e beta amiloide 40 de alta pureza, capazes de formar oligômeros. As propriedades bioquímicas do peptídeo beta amiloide frequentemente tornam sua purificação difícil. Portanto, a obtenção de um peptídeo de alta pureza capaz de formar oligômeros pode ser desafiadora. Este procedimento ajuda a mitigar esse desafio. Para este protocolo de CLAE, prepare previamente estoques dos tampões A e B, bem como o tampão para dissolução da amostra. Para montar o sistema de CLAE, conecte primeiro os frascos dos tampões A e B às entradas da bomba. Utilize tubos de polímero e conexões de peça única, sem confundir as válvulas. Conecte o tubo de polímero da saída da bomba à entrada da coluna preparativa. Aperte a conexão de peça única com os dedos e certifique-se de que a coluna esteja na orientação correta. Em seguida, fixe outro tubo de polímero da saída da coluna ao detector de duplo comprimento de onda. Use conexões de peça única apertadas com os dedos e, no software de configuração do CLAE, defina o detector de comprimento de onda para medir picos em 214 e 280 nanômetros. A seguir, conecte a válvula de saída do detector de comprimento de onda à válvula de saída do detector do CLAE usando um tubo de polímero e uma conexão de peça única apertada com os dedos. Isso servirá como o tubo de coleta da amostra. Agora, programe o software do CLAE para executar o método de purificação. Na opção Configurar Método do Instrumento, insira o método de purificação alterando o parâmetro do cronograma do solvente. Por fim, ligue a bomba do CLAE pelo software do CLAE. A bomba iniciará então o fornecimento da proporção inicial dos tampões A e B através da coluna preparativa no instrumento de CLAE. É essencial deixar o sistema em equilíbrio por 30 minutos antes de prosseguir com as amostras. Para iniciar, dissolva três miligramas de A bruto

a-tailored-hplc-purification-protocol-that-yields-high-purity-amyloid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Foto-induzida ligação cruzada de proteínas não modificadas (picup) permite a caracterização da distribuição de tamanho de oligômero em misturas de proteínas metaestável. Demonstramos aplicação de picup a três peptídeos representante amiloidogênicas a 40 - e 42 resíduos de formas de amilóide β-proteína, e calcitonina, peptídeo e um controle do fator de crescimento hormônio liberador.

Foto-Induzida Cross-Linking de Proteínas Unmodified (picup) Aplicada à Peptídeos amiloidogênicas

Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da...

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Aptâmeros são ribo-/deoxyribo-oligonucleotides curtas selecionados...

Seleção de Aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer

Este vídeo demonstra o protocolo para isolar fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral de camundongo usando centrifugação por gradiente de densidade e digestão de proteínas não amilóides.

Isolamento de fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral

Este vídeo demonstra o procedimento de injeção de peptídeos amilóides monoméricos no prosencéfalo de peixes-zebra adultos para gerar toxicidade amilóide, imitando o dano neuronal observado na doença de...

Estabelecendo um modelo de doença de Alzheimer no cérebro de peixe-zebra por meio de injeção de peptídeo amilóide

As proteínas podem adotar uma estrutura nativa ou se dobrar em amilóide insolúvel. As condições que favorecem a via de desdobramento levam à formação de diferentes tipos de fibrilas amilóides. Os métodos descritos aqui permitem a rápida conversão de proteínas nativas em amilóide in vitro.

Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

A síntese do peptídeo poliamina-baseado amphiphiles (CAE) é um desafio significativo devido à presença de múltiplos nitrogênios de amina, que exige o uso criterioso de proteger grupos para mascarar estas funcionalidades reativas. Neste trabalho, descrevemos um método fácil para a preparação destas nova classe de auto-montagem de moléculas.

Facile protocolo para a síntese de auto montagem baseada em poliamina peptídeo Amphiphiles (CAE) e biomateriais relacionados

Rica em cisteína peptídeos dobram em distintas estruturas tridimensionais dependendo sua conectividade de dissulfeto. Síntese alvo de isómeros de bissulfeto individual é necessária quando oxidação de reserva não implica que a conectividade de bissulfeto desejado. O protocolo lida com a síntese seletiva de peptídeos 3-bissulfeto-ligado e sua análise estrutural usando estudos NMR e MS/MS.

Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades

Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

Aprenda um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 de alta pureza, capazes de formar oligômeros para pesquisa da doença de Alzheimer.

A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Oligï¿½ero (Vídeo) | JoVE Journal

A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Oligï¿½ero

Explorar mais vídeos