Gravação de EEG em Ratos Neonatais de Movimentação Livre Usando um Novo Método
29 de maio de 2017
Aqui, nós introduzimos uma técnica nova projetada registrar o electroencephalography (EEG) em filhotes epileptic neonatal movendo-se livremente e descrever seus procedimentos, caraterísticas, e aplicações. Este método permite gravar EEG por mais de uma semana.
O objetivo geral deste método é registrar EEGs de filhotes de ratos neonatais em movimento livre, utilizando uma nova configuração de eletrodos que permanece estável por uma semana ou mais. Este método responderá perguntas fundamentais na área de neurociência e será benéfico para o estudo da epilepsia neonatal. Ao utilizar esta técnica, é possível registrar sinais de EEG de alta qualidade e estáveis por períodos mais longos.
O que ajudará no diagnóstico de diversas desordens neuropatológicas. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque ratos neonatais no período de p8 a p15 são muito difíceis de manipular e exigem grande cuidado. O eletrodo requer um contato com pontas para funcionar como interface de sinal com os dispositivos de comunicação.
Um pino lo sai de computador desempenha essa função. Separe cuidadosamente os pinos macho e fêmea de um pino lo sai de computador utilizando um alicate. Em seguida, conecte os pinos macho e fêmea para formar um eletrodo e fixe a conexão com cianoacrilato.
Prepare vários desses eletrodos. Depois que as ligações endurecerem, coloque os eletrodos em um béquer contendo água destilada por dez minutos. Em seguida, coloque-os em um limpador ultrassônico para limpar os eletrodos.
Em seguida, transfira o béquer para uma estufa regulada em 45 graus Celsius e aqueça por meia hora. Por fim, esterilize os eletrodos com exposição à luz UV por 30 minutos. Em uma câmara de segurança biológica, monte primeiro os instrumentos cirúrgicos esterilizados e um aparelho estereotáxico esterilizado para a cirurgia.
Em seguida, anestesie a ratazana neonata usando isoflurano a dois vírgula cinco por cento. Quando o filhote estiver profundamente anestesiado, reduza o isoflurano para um por cento. Antes de prosseguir, utilize um aperto no dedo do pé para garantir que o camundongo esteja suficientemente anestesiado.
Em seguida, fixe a cabeça da ninhada no aparelho estereotáxico. Posicione as barras auriculares nos canais auditivos e aperte-as suavemente. Tenha cuidado: o crânio neonatal é muito mole.
Agora, faça uma incisão mediana de quinze milímetros no crânio. Em seguida, com pinça, separe suavemente o couro cabeludo para alargar a incisão. Para manter a incisão aberta, use um pedaço de algodão embebido em soro fisiológico.
Agora, localize o bregma e o lambda e marque-os com um lápis. Os próximos passos de implante de eletrodo são críticos e devem ser executados com precisão. Primeiro, utilizando uma agulha de calibre 26, faça um furo de trepanação na córtex pré-frontal, dois milímetros à frente do bregma e a até 0,5 milímetro da linha média.
Em seguida, faça um furo no hipocampo em um ponto oito milímetros posterior à bregma e zero vírgula cinco milímetros lateral à linha média. A agulha não deve penetrar mais do que dois milímetros abaixo da superfície cortical para minimizar danos cerebrais. Agora, utilizando pinças, insira o eletrodo de referência no furo no córtex e insira os eletrodos de gravação no furo do hipocampo.
Em seguida, aplique pomada de eritromicina ao redor dos eletrodos e fixe os eletrodos no lugar com cianoacrilato. Enquanto a cola adere, prepare o cimento dental com consistência pegajosa e viscosa. A viscosidade do cimento dental é crítica.
Se o cimento dental for muito fino, pode resultar na formação de uma camada isolante indesejada sob o eletrodo. Se o cimento for muito denso, os eletrodos serão mais facilmente destacados devido à massa em excesso. Antes de aplicar o cimento, seque completamente o crânio e os eletrodos.
Em seguida, fixe os eletrodos ao crânio com cimento dental. Após isso, aplique um pouco de ácido pícrico sobre os eletrodos para adicionar uma camada adicional de proteção. Agora, remova o animal do estereotáxico e injete 300 microlitros de solução de glicose a dez por cento por via subcutânea.
Em seguida, transfira o animal para uma manta aquecida para mantê-lo a 37 graus Celsius até que esteja em condições de se locomover. Uma vez em condições de se locomover, administre buprenorfina para aliviar a dor pós-cirúrgica e transfira o filhote para sua gaiola de origem com a mãe. Antes de utilizar o implante, aguarde pelo menos dois dias para que o filhote se recupere.
Após o período de recuperação, acomode o filhote sozinho para realizar gravações por cerca de dez minutos, para que ele possa se familiarizar com o ambiente. Conecte os eletrodos a um amplificador e conecte o amplificador a um conversor AD ligado a um computador. Tenha cuidado para não embaraçar essas conexões.
Em seguida, na unidade de aquisição de dados, selecione uma taxa de amostragem de pelo menos 10.000 hertz para gravação e verifique a transmissão adequada dos dados. Realize uma gravação de linha de base. Após obter a gravação de linha de base, injete o filhote por via intraperitoneal com ácido caínico para induzir convulsões epilépticas.
Quinze minutos após a injeção, observe e registre as descargas epilépticas. Salve os dados digitalizados e analise-os utilizando um software de processamento de sinais. Revele o nível de potência de diferentes componentes de frequência nos EEGs neonatais por meio da análise do espectro de potência.
Calcule a potência a partir de intervalos de um minuto determinando a amplitude média quadrática de um a cem hertz, que é a banda de EEG. Dez minutos após a injeção de ácido caínico, foram registrados padrões recorrentes de descarga interictal e ictal no EEG. Os ataques epilépticos mais comuns registrados foram do tipo tônico-clônico.
A duração tônica ictal durou cerca de quinze segundos. Também foi observado que os descargas tônicos foram seguidos por rajadas clônicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implantar eletrodos e obter gravações de EEG de alta qualidade de filhotes de ratos neonatos de p8 a p15.
Uma vez preparado, o implante cervical pode ser realizado em menos de dez minutos, dependendo da complexidade da cirurgia.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica inovadora para registrar eletroencefalografia (EEG) em filhotes epilépticos neonatos livres para se moverem. O método permite gravações estáveis de EEG com duração superior a uma semana, facilitando o estudo da epilepsia neonatal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Epilepsia Neonatal
Antecedentes
- A gravação de EEGs em filhotes de ratos neonatos é desafiadora devido à sua natureza delicada.
- Configurações estáveis de eletrodos são cruciais para obter dados de qualidade.
- Este método aborda questões fundamentais na neurociência.
- Ele auxilia no diagnóstico de distúrbios neuropatológicos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para gravação de EEG em ratos neonatos.
- Aprimorar a compreensão da epilepsia neonatal.
- Fornecer uma ferramenta para o monitoramento de longo prazo da atividade cerebral.
Métodos Utilizados
- Configuração inovadora de eletrodos para gravações estáveis de EEG.
- Gravação em filhotes de ratos neonatos livres para se movimentar, com idade entre p8 e p15.
- Garantir o manuseio cuidadoso dos animais durante o procedimento.
- Utilização de contatos com pontas para interface de sinal com dispositivos de comunicação.
Resultados Principais
- Sinais de EEG de alta qualidade e estáveis foram registrados por mais de uma semana.
- O método demonstrou ser eficaz no estudo da epilepsia neonatal.
- Facilitou o diagnóstico de diversas doenças neuropatológicas.
- Demonstrou a viabilidade do monitoramento de EEG de longo prazo em pacientes neonatais.
Conclusões
- A técnica inovadora representa um avanço significativo no registro de EEG.
- Ela abre novas possibilidades para pesquisas em epilepsia neonatal.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para obter insights mais profundos sobre a atividade cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Registrar EEG em filhotes de ratos neonatais livres para se mover permite o monitoramento longitudinal da atividade cerebral em modelos de doença, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na pesquisa de epilepsia. Este método fornece leituras eletrofisiológicas quantitativas que aumentam a confiança preditiva em estudos pré-clínicos de distúrbios neurológicos. Ao estabilizar as interfaces dos eletrodos por mais de uma semana, reduz a variabilidade técnica e melhora a reprodutibilidade em fluxos de trabalho de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao capturar descargas epilépticas espontâneas e induzidas in vivo.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de sinais de EEG estáveis e de alta fidelidade em sistemas relevantes para a doença.
- Valor Preditivo: Facilita a análise de resposta à dose e a identificação de biomarcadores para decisões de avançar/não avançar no descobrimento de fármacos para epilepsia.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos com saídas quantificáveis de EEG.
- Reprodutibilidade: Padroniza a implantação de eletrodos e a aquisição de sinais para minimizar a variabilidade entre animais.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em modelos de roedores neonatos e adultos para estudos de epilepsia e distúrbios neurológicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela epilepsia neonatal por indução com ácido caínico, permitindo o estudo de padrões EEG ictais e interictais.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao fornecer desfechos eletrofisiológicos consistentes.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia a desmistificação mecanicista por meio do acompanhamento longitudinal da progressão das crises e da recuperação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses na fase inicial de descoberta até a otimização de compostos líderes e a validação pré-clínica, especialmente para alvos relacionados à epilepsia e distúrbios neurológicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos mediante a quantificação da carga de crises eletrográficas e da atividade cortico-hipocampal.
- Triagem: Oferece sistemas prontos para ensaios com gravações estáveis e de longo prazo de EEG, adequadas para avaliação dos efeitos de compostos.
- Análise: Permite a análise do espectro de potência e cálculos da amplitude quadrática média para comparar a atividade cerebral específica por frequência entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos de EEG a biomarcadores clínicos da epilepsia, apoiando o alinhamento e a validação de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável de eletrofisiologia para modelos de roedores neonatais e adultos em diversos programas de descoberta em neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em modelos de epilepsia por meio de monitoramento estável e de longa duração do EEG.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de uma configuração de eletrodos de baixo custo e confiável, utilizando locais de pinos de computador e fixação com cianoacrilato.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir gravações de até uma semana em animais livres para se mover, reduzindo a necessidade de cirurgias repetidas.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao fornecer pontos finais eletrofisiológicos objetivos para decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento de medicamentos para epilepsia.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em manipulação de roedores neonatos, cirurgia estereotáxica e aquisição de sinais eletrofisiológicos.
- Depende de instrumentação, incluindo aparelho estereotáxico, amplificadores, conversores analógico-digitais e software de processamento de sinais.
- Necessita padronização entre equipes na preparação dos eletrodos, profundidade de implante e viscosidade do cimento dental para garantir estabilidade do sinal.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens, idades e alvos cerebrais em roedores, além do hipocampo e córtex pré-frontal.
- É limitado pela habilidade técnica necessária para manter a integridade da interface entre o eletrodo e o tecido durante períodos prolongados de gravação.
