Name: In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a rastrear progenitores retinianos em embriões de zebrafish para estudar sinalização não-autônoma durante a neurogênese. Esta técnica permite observar células individuais em tempo real em ambientes geneticamente distintos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma ARC DECRA para PRJ (DE120101311) e por uma bolsa de pesquisa Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) para LP (PO 1440 / 1-1). O australiano Regenerative Medicine Institute é suportado por fundos do Governo do Estado de Victoria e do Governo Federal australiano. Nós reconhecemos o Dr. Jeremy Ng Chi Kei, que conduziu experimentos descritos aqui como publicado em Kei et al. De 2016. Somos gratos por disposições de peixes transgénicos de Prof. Higashijima e agradecer Profs. Turner e Rupp para a prestação do pCS2 + plasmídeo e Dr. Wilkinson para gerar H2B-RFP e H2A-GFP construções. Agradecemos FishCore pessoal da instituição (Universidade Monash) para cuidar de nossos animais.

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish%3A+EMBO+practical+course%2C+KIT%2C+Sept.+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23(2013).</li>
<li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li>
<li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li>
<li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vsx2+in+the+zebrafish+retina%3A+restricted+lineages+through+derepression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14(2009).</li>
<li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li>
<li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li>
<li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+neural+cell-fate+determination%3A+lessons+from+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2(2006).</li>
<li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alx%2C+a+zebrafish+homolog+of+Chx10%2C+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li>
<li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li>
<li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep04898">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898(2014).</li>
<li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li>
<li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish%2C+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li>
<li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1894769">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li>
<li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li>
<li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+goldfish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li>
<li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Compreender a medida em que as células vizinhas influenciar timing da expressão de factores que determinam o destino celular crucial é essencial quando se aponta para instruir de forma eficiente as células estaminais multipotentes embrionárias ou induzidas a se diferenciar em um tipo de célula pós-mitótico específica ou mesmo tecidos estampados. Além disso, examinar estes eventos moleculares nas células em desenvolvimento do animal vivo, adicionalmente, fornece dinâmica relevante informação (temporal e espacial) nos con...

<html> A capacidade de visualizar os processos de desenvolvimento importantes em um vertebrado in vivo tem contribuído para tornar o peixe-zebra um modelo fundamental para o estudo de condições normais e de doenças (revisto em 1, 2). Em particular, a retina neural é uma parte acessível do sistema nervoso central. A retina presta-se facilmente realizar estudos de neurogênese, devido à sua, ainda estrutura relativamente simples altamente organizado, e seus tipos de neurônios altamente conservadas entre espécies de vertebrados 3. A dinâmica de comportamentos celulares tais como a proliferação, a saída do ciclo celular, divisão celular assimétrica, especificação de destino, a diferenciação e a formação de circuitos neurais pode ser seguido ao longo de todo o processo de retinogenesis, que é completado na retina central do peixe-zebra por 3 d pós-fertilização ( DPF) 4, 5,ref &quot;&gt; 6, 7. Além disso, os requisitos funcionais de genes diferentes em cada uma das etapas acima mencionadas podem ser concomitantemente avaliada na retina de peixe-zebra, proporcionando uma vantagem sobre os outros modelos de vertebrado em que os fenótipos resultantes da aplicação de técnicas de knockout de genes só pode ser avaliado mediante o exame post mortem de tecidos fixados. Em particular, o uso de linhagens transgênicas em que podemos visualizar e monitorar a expressão de proteínas fluorescentes como transgenes repórter na retina, nos permite obter a resolução temporal da expressão do gene subjacente à génese de um tipo de célula neuronal particular. Devido ao rápido desenvolvimento do peixe-zebra, estes eventos pode ser visualizado durante todo o período de desenvolvimento, proporcionando assim uma percepção mais profunda sobre a importância temporal da expressão do gene em relação à aquisição identidade da célula neuronal e o comportamento das células. Finalmente, estas abordagens podem ser combinadas de forma eficiente no peixe-zebra com a geração de quimera através de transplantes, resultando em percepções em dois aspectos chave da função do gene. Em primeiro lugar, as células transplantadas de um embrião doador, em que um gene particular foi derrubado enquanto elas se desenvolvem em um ambiente sem rótulo tipo selvagem examinando, nos permite obter informação relevante sobre a função do gene de uma forma de células-autônoma. Isto conduz a informações importantes sobre a função de factores destino determinantes da retina dentro das células progenitoras que são normalmente expressas em. Isto é exemplificado pela análise do resultado destino de desenvolvimento de células progenitoras que não podem gerar a proteína funcional a partir destes genes de 4, 6, 8, 9. Utilizando esta abordagem, temos mostrado que fatores determinantes muitos Fate (por exemplo, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) agir celular-autonomously para conduzir destinos neuronais específicos da retina; a falta de expressão do gene leva principalmente a um comutador de destino, de tal modo que as células com o gene knockdown permanecem viáveis através da adopção de um destino alternativo célula 4, 6, 7, 10. Em segundo lugar, tais experiências quiméricas podem ser utilizadas para avaliar o tipo selvagem progenitores comportar quando elas se desenvolvem em diferentes ambientes genéticos. Por exemplo, através da comparação do desenvolvimento de células WT que normalmente expressam um gene de interesse (e transgene repórter) numa WT contra ambiente hospedeira manipulada (por exemplo, gene knockout / knockdown), os efeitos resultantes sobre a expressão do gene e o destino da célula pode ser avaliada . A falta de certos tipos de neurónios no ambiente hospedeiro, por exemplo, tem sido mostrado para influenciar o comportamento de células progenitoras de tipo selvagem de uma maneira célula não autónomo, para polarizar os para se diferenciarem em o O sub-representadosr neurônio tipos 4, 7, 11, 12 desaparecidos. Dado que os neurônios da retina nascem em uma ordem histológico conservada pela expressão sequencialmente de genes específicos destino determinantes neuronais (destino expressão gênica) (revisto em 13), utilizou estes métodos para demonstrar como o momento da expressão do gene destino em progenitores tipo selvagem é afetado quando essas células progenitoras desenvolvem em ambientes de host da retina com composições celulares aberrantes induzidos. Aqui, descrevemos essas abordagens como evidência de como a combinação de técnicas relativamente padrão e utilizado permite o exame do sincronismo da expressão do gene destino no desenvolvimento de células progenitoras da retina 8, 9. Este protocolo descreve uma abordagem experimental combinar imagiologia com lapso de tempo a facilidade de performando transplante na ex vivo desenvolvimento do embrião de peixe-zebra para seguir mosaically indivíduo células marcadas ao longo de todo o período de retinogenesis desenvolvimento. Ao executar manipulações de genes funcionais quer no embrião hospedeiro, embrião dador, ambos ou nenhum, pode-se avaliar a autonomia célula da função do gene. Esta abordagem pode ser adaptada para questões de investigação amplamente semelhantes em qualquer outro sistema para o qual os componentes individuais aqui descritas são adequados.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Os pratos revestidos de agarose podem ser preparados alguns dias antes, selados com parafilme para evitar o ressecamento e armazenados a 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Agarose de baixa fusão</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td>Pode ser preparado em volume maior, micro-ondas para liquefazer e depois mantido fundido em um 40 &#176; C banho-maria. Alíquotas de 1 mL podem ser preparadas (uma para cada grupo de embriões montados).</td></tr><tr><td>tubo capilar de vidro borossilicato sem filamento</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0035</td><td>alternativas com diâmetro semelhante podem ser usadas&nbsp;</td></tr>tubo <tr><td>capilar de vidro borosilado com filamento</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td><td>alternativas com diâmetro semelhante podem ser usadas&nbsp;</td></tr><tr><td>placas de Petri de vidro (60 mm de diâmetro)</td><td>Science Supply</td><td>1070506</td><td>qualquer alternativa de vidro de qualquer tamanho</td></tr><tr><td>Tubo de injeção (2 m)</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>Isso conecta o porta-agulha à seringa durante o transplante</td></tr><tr><td>Molde de microinjeção (molde de plástico com saliências em forma de cunha)</td><td>Ferramentas científicas adaptáveis</td><td>Alternativas PT-1</td><td>com formato semelhante podem ser usadas</td></tr><tr><td>microagulha suporte</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>qualquer alternativa que se ajuste ao diâmetro externo das agulhas de injeção pode ser usada</td></tr><tr><td>microinjetor</td><td>Narishige ou Eppendorf Femtojet</td><td></td><td>Injetor pneumático usando micromanipulador de pressão de gás</td></tr><tr><td></td><td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>alternativas semelhantes podem ser usadas</td></tr><tr><td>ponta de microcarregador</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>extrator de agulhas</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modelo P-2000</td><td>As configurações usadas para este extrator são: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Qualquer extrator de agulha pode ser usado se resultar em dimensão de ponta apropriada</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Interpath</td><td>PM996</td><td>qualquer filme de parafina</td></tr><tr><td>Pasteur pipeta de plástico</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeta de vidro</td><td>Hirschmann Laborgeraete</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG</td><td>&nbsp; A PTU Protease Tipo XIV</td></tr><tr><td>N-fenil tioureia</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>é tóxica e pode ser preparada como uma solução de estoque para evitar a exposição frequente ao pó, consulte a MSDS antes da compra/uso.</td></tr><tr><td>Extração de gel Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>quaisquer alternativas para purificar o DNA podem ser usadas</td></tr><tr><td>Rneasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>quaisquer alternativas para purificar o RNA podem ser usadas</td></tr><tr><td>SP6 mMessage kit</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>quaisquer alternativas para transcrever DNA usando SP6</td></tr></tbody></table>

in vivo de imagens de gene transgenic expressão em individual retinal progenitores em embriões zebrafish quimérico para estudar celular influências não-autônomos

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Os pontos fortes genéticos e técnicos fizeram o vertebrado zebrafish um organismo chave modelo no qual as consequências das manipulações genéticas podem ser rastreadas in vivo durante todo o período de desenvolvimento acelerado. Vários processos podem ser pesquisados, incluindo a proliferação celular, a expressão do gene, a migração celular e morfogénese. Importante, a geração de quimeras através de transplantes pode ser facilmente realizada, permitindo mosaico rotulagem e a identificação de células individuais sob a influência do meio ambiente do hospedeiro. Por exemplo, pela combinação de manipulações funcionais de genes do embrião hospedeiro (por exemplo, através de microinjecção morfolino) e imagens ao vivo, os efeitos da não-autônomos extrínseca, sinais celulares (fornecido pelo ambiente geneticamente modificado) em células do dador transplantado individuais podem ser avaliadas. Aqui demonstramos como essa abordagem é usada para comparar o início da expressão do transgene fluorescente como um proxy para o calendário de determin destino celularção em diferentes ambientes genéticos do hospedeiro. Neste artigo, nós fornecemos o protocolo para microinjecting embriões de peixe-zebra para marcar células do doador e para causar silenciamento de genes em embriões de acolhimento, uma descrição da técnica de transplante usado para gerar embriões quiméricos, eo protocolo para a preparação e funcionando in vivo confocal de lapso de tempo imagens de vários embriões. Em particular, a realização de imagem multiposition é crucial quando se comparam cronometragem de eventos, tais como o início da expressão do gene. Isto requer a coleta de dados do controle múltiplo e embriões experimentais processados ​​simultaneamente. Tal abordagem pode ser facilmente estendido para estudos de influências extrínsecos em qualquer órgão ou tecido de escolha acessível para imagens ao vivo, desde que o transplante pode ser alvejado facilmente de acordo com os mapas fate embrionárias estabelecidas.

Este trabalho apresenta um protocolo experimental para avaliar mudanças na expressão gênica cronometragem quando tipo selvagem progenitores da retina desenvolver dentro de um embrião hospedeiro morphant. Os embriões hospedeiras experimentais são morphants Ptf1a, que não possuem os interneurônios horizontais e amácrinas nascidos intermediários da retina 7, 26. Estes foram comparados para controlar embriões de acolhimento, que fora...

acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

O objetivo geral desses procedimentos é estudar como alterações na expressão gênica, seja dentro de células em desenvolvimento ou no ambiente ao seu redor, influenciam processos temporais durante o desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais, como se o momento da especificação do destino celular é controlado por genes expressos de maneira autônoma dentro de uma célula ou de maneira não autônoma em células vizinhas. A principal vantagem dessa técnica reside na capacidade de acompanhar células progenitoras individuais em um vertebrado in vivo enquanto as células se desenvolvem em ambientes geneticamente distintos.Quem demonstrará o procedimento será Stefanie Dudczig, assistente de pesquisa do meu laboratório. Após preparar embriões de peixe-zebra, bem como agulhas de microinjeção com Morpholinos ou mRNA, de acordo com o protocolo descrito, mergulhe a ponta da agulha em uma gota de óleo mineral em uma placa. Meça o volume de injeção pressionando o pedal do pé e ajuste a pressão do gás e/ou o tempo de duração até que o volume de injeção seja equivalente a um nanolitro, medido com uma lâmina milimetrada ou, alternativamente, com uma retícula ocular.Coloque uma lâmina de microscópio em uma placa de Petri e, com uma pipeta de transferência, deposite embriões em estágio de célula única ao longo da borda da lâmina. Em seguida, com uma pipeta de transferência fina, remova o máximo de líquido possível para evitar movimentos durante as injeções. Depois, utilizando uma ponteira de pipeta Microloader com metade da ponta fina cortada, alinhe os embriões em uma única coluna.Em seguida, abaixe a agulha em direção a um embrião em estágio de célula única e penetre o corion e a gema em um único movimento contínuo. Uma vez que a ponta da agulha esteja centralizada na gema, pressione o pedal do pé uma vez e microinjete um nanolitro de mRNA de H2AGFP ou H2BRFP na gema do embrião em estágio único. Remova a agulha de injeção, mova o recipiente contendo os embriões para posicionar o próximo embrião e continue injetando até que toda a coluna de embriões tenha sido injetada.Após injetar todos os embriões, incline a placa em um ângulo de 30 a 45 graus e use um fluxo suave de meio E3 em uma garrafa de pressão para transferir os embriões injetados para uma nova placa de Petri limpa. Três horas após a fertilização, sob um microscópio fluorescente com ampliação de 2X a 5X, utilize um filtro RFP para verificar o sinal de marcação nos embriões doadores. Selecione embriões bem desenvolvidos com um sinal fluorescente forte.Após preparar as placas de injeção e as placas de Petri de acordo com o protocolo descrito, corte a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro com ponta fina e alongada até um comprimento que permita manuseio confortável, usando uma lâmina de diamante para riscar a agulha enquanto a gira até que a ponta se desprenda. Certifique-se de que o corte seja reto. Em seguida, para não danificar embriões descorionados, polita a pipeta de transferência de vidro aquecendo-a levemente na chama de um bico de Bunsen enquanto gira a superfície cortada, de modo a obter extremidades lisas.Para descorionar embriões, coloque embriões hospedeiros e doadores bem desenvolvidos em dois erlenmeyers de vidro separados de 10 mililitros e remova o máximo de líquido possível. Adicione 5 mililitros da solução de protease 0,5 miligrama por mililitro previamente preparada a cada erlenmeyer e gire suavemente os embriões enquanto os observa ao microscópio estereoscópico. Enquanto continua a girar, assim que o primeiro embrião sair do córion, use o meio E3 para realizar três lavagens rápidas a fim de remover a solução de protease, despejando a maior parte do líquido e reenchendo o erlenmeyer com o meio E3 despejado suavemente ao longo da lateral.Interrompa a descorionação enzimática com uma lavagem rápida, mas suave, assim que os primeiros embriões descórionados puderem ser observados. Para os transplantes, escolha apenas embriões descórionados que apresentem massa celular simétrica e sem deformações evidentes ou danos ao vitelo. Para realizar o transplante na fase de blástula, monte a agulha no suporte de agulha e conecte-a à tubulação do equipamento de transplante.Teste o selo operando manualmente a seringa para aspirar e expelir líquido pela agulha. Em seguida, com uma pipeta de vidro, transfira os embriões doadores para a primeira coluna do molde de agarose. Depois, transfira os embriões hospedeiros para as colunas dois a seis do molde de agarose.Coloque suavemente a agulha de transplante sobre as células blastoméricas de um embrião doador e aspire lentamente cerca de 20 a 50 células para dentro da agulha de transplante. Evite aspirar a gema. Utilizando o micromanipulador, levante a agulha de transplante do embrião doador.Mova o recipiente de injeção para a esquerda e insira a ponta da agulha de transplante através do lado da massa celular, até o polo animal do primeiro embrião hospedeiro. Deposite de cinco a 10 células próximas à superfície, de acordo com um mapa de destino celular que mostra que esta região dá origem ao campo ocular do prosencéfalo. Para montar os embriões para imagem, aspire no máximo cinco embriões para dentro de uma pipeta plástica de transferência e deixe os embriões acumularem-se na ponta por ação da gravidade.Toque a pipeta de transferência na superfície de um tubo plástico previamente preparado contendo agarose de baixo ponto de fusão a 1%, permitindo que os embriões afundem no tubo, limitando ao mesmo tempo a quantidade de E3 transferida. Em seguida, transfira os cinco embriões do tubo plástico com agarose para uma placa de Petri com 0,5 a um mililitro de agarose e, usando a mesma pipeta de transferência, remova o excesso de agarose, deixando apenas uma pequena gota. Utilize uma pipeta micro-ajustável com a ponteira quebrada para alinhar os embriões lateralmente até que a agarose solidifique.Em seguida, continue montando até cinco embriões de cada vez, em gotas individuais de agarose. Se for realizar a imagem com um microscópio ereto, evite posicionar os embriões a menos de um centímetro da circunferência da placa de Petri. Utilize agarose fundida a 1% adicional para unir as gotas de agarose umas às outras na lateral da placa, a fim de evitar deslocamento ou movimento lateral durante a aquisição de imagens.Escolha embriões com o ângulo de montagem correto e batimento cardíaco forte, além de algumas células doadoras transplantadas principalmente no quadrante ventral anterior da retina em desenvolvimento, onde começa a onda de expressão gênica. Realize a aquisição de imagens conforme descrito no protocolo. Como mostrado nesta figura, a microinjeção de um nanolitro de mRNA no vitelo de embriões em estágio de uma única célula resulta na expressão da proteína repórter fluorescente três horas após a fertilização, momento em que as doadoras mais brilhantes são selecionadas.Após 24 horas da fertilização, embriões com células doadoras transplantadas nas regiões retinianas relevantes foram submetidos à imagem de lapso de tempo por 16 a 24 horas. Esta imagem confocal de uma única seção óptica em Z mostra a sobreposição do campo claro nos canais vermelhos no olho em desenvolvimento, com algumas células doadoras marcadas em vermelho dentro de um ambiente hospedeiro não marcado. Estes micrografias são provenientes de imagens de lapso de tempo de células doadoras selvagens em desenvolvimento de embriões transgênicos atoh7:gapGFP transplantados em um hospedeiro selvagem não marcado.O início da expressão do transgene é indicado em algumas poucas células, conforme visto aqui. Uma vez dominadas, as microinjeções podem ser realizadas em duas horas, e a seleção, preparação e transplante de embriões podem ser concluídos em três horas no mesmo dia. Após ou em paralelo a esses procedimentos, também podemos fixar embriões em idades específicas para análise post mortem.Por exemplo, podemos quantificar quais proporções de células doadoras estão expressando um determinado gene ou proteína, possuem uma morfologia específica ou migraram para um local determinado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular geneticamente embriões de peixe-zebra e gerar quimeras entre doadores e hospedeiros geneticamente distintos. Você também deverá ser capaz de montar os embriões para imagens sequenciais in vivo a fim de responder perguntas que não podem ser respondidas em tecidos fixados.

in-vivo-imaging-transgenic-gene-expression-individual-retinal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Zebrafish transplante de células permite a combinação de genética e da embriologia para gerar quimeras tecidos específicos. Este vídeo demonstra gástrula encenado transplantes de células que têm permitido o nosso laboratório para investigar o papel das populações astroglial e pistas de orientação específica durante a formação da comissura no prosencéfalo.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Neste vídeo, técnicas de imagem multicolor de lapso de tempo confocal e ablação de células alvo são fornecidos. Lapso de tempo de imagem é usado para monitorar o comportamento de vários tipos de células de...

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Combinando transplante de células, marcação do citoesqueleto e abordagens de perda/ganho de função, este protocolo descreve como a placa pré-cordal prospectiva de peixe-zebra migratória pode ser usada para analisar a função de um gene candidato na migração celular in vivo.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Imagem tecido retinal pode fornecer informações de célula única que não podem ser obtidas por métodos bioquímicos tradicionais. Este protocolo descreve a preparação de fatias da retina de zebrafish para a imagem latente confocal. Indicador de corantes permitem a visualização de numerosos processos biológicos em tipos distintos de células da retina ou fluorescente geneticamente codificado sensores.

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

Aprenda a rastrear progenitores retinianos em embriões de zebrafish para estudar sinalização não-autônoma durante a neurogênese. Esta técnica permite observar células individuais em tempo real em ambientes geneticamente distintos.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos (Vídeo) | JoVE Journal

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Explorar mais vídeos