Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse
3 de julho de 2017
A imagem em células vivas das células sanguíneas marcadas na circulação ocular pode fornecer informações sobre inflamação e isquemia na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. É descrito um protocolo para rotular as células do sangue e imagem das células rotuladas na circulação da retina.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar a circulação retiniana de células sanguíneas no camundongo usando um oftalmoscópio a laser de varredura. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre doenças da retina, como qual é a dinâmica do assoalho da retina de leucócitos e hemácias e como sua dinâmica de fluxo pode contribuir para a patogênese da doença. As principais vantagens desta técnica é que ela pode refletir em diferentes fenótipos de doenças e também é muito fácil de executar.
Este procedimento será demonstrado pelos membros de nossa equipe, Praveen, Bo Bo e Neha. Para isolar as células sanguíneas de camundongos, coloque sangue total recém-coletado em cima de uma solução de polissacarose 1:1 e diatrizoatem de sódio em um tubo de dois mililitros. Em seguida, centrifugue o tubo por 30 minutos.
Em seguida, aspirar e descartar o sobrenadante plasmático. Em seguida, colete cuidadosamente a camada de revestimento leucocitário composta de leucócitos e a camada subjacente de eritrócitos em tubos separados. Em seguida, lave os eritrócitos com 1XPBS para remover quaisquer contaminantes e ressuspendê-los em um volume de PBS.
Em seguida, transfira alíquotas de meio mililitro da suspensão para tubos de microcentrífuga. Gire as alíquotas, descarte o sobrenadante e adicione cerca de 200 microlitros de 40%1XPBS aos eritrócitos peletizados. Misture-os bem.
E incube-os em temperatura ambiente por cinco minutos. Após cinco minutos, adicione 100 microlitros de ICG a cada suspensão. Misture os tubos usando inversões e incube-os em temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, adicione 300 microlitros de 1XPBS e incube por uma hora com agitação suave a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugue as suspensões, guarde as células peletizadas e ressuspenda-as em um mililitro de 1XPBS. Continue lavando as células com 1XPBS até que o sobrenadante esteja limpo.
Após a decantação, o sobrenadante adiciona de volta um volume de 1% BSA e PBS para atingir 50% de hematócrito de eritrócitos marcados com ICG. Em seguida, processe a coleção de casacos buffy. Primeiro lave as células uma vez com 10 mililitros de 1XPBS para remover quaisquer contaminantes.
Centrifugue as amostras novamente e, em seguida, ressuspenda o pellet em 900 microlitros de 1XPBS. Em seguida, adicione 100 microlitros de fluoresceína a 10% de sódio e incube as células em temperatura ambiente por dois minutos. Por fim, lave os linfócitos marcados três vezes com 10 mililitros de 1XPBS.
Centrifugue e ressuspenda-os em 100 microlitros de 1XPBS. Para preparar os eritrócitos marcados com ICG para injeção, primeiro dilua uma alíquota para injeção até um hematócrito de 5% ou 1%. Anestesie o rato e dilate suas pupilas.
Em seguida, aplique pomada oftálmica em ambos os olhos. E coloque uma lente de contato sobre um dos olhos. Agora imagine o mouse usando uma câmera SLO confocal com uma lente positiva de 25 dioptrias para compensar a refração do olho.
Fresco direcione perfeitamente a córnea para a cabeça óptica da máquina SLO. Em seguida, ligue o módulo de imagem e manobre-o até que o nervo óptico esteja no centro da tela de imagem. Em seguida, em um ângulo de 30 graus, tire as imagens infravermelhas do fundo de olho.
Em seguida, faça um vídeo de fundo de olho infravermelho. Ligue o filtro ICG de 790 nanômetros, defina o modo da câmera para adição de alta velocidade, mantenha o ângulo de visão em 15 a 30 graus. Em seguida, defina a intensidade do ICG para 85 para todas as leituras.
No painel de controle, clique no botão adquirir para gravar um vídeo de linha de base de 8,8 a 15 quadros por segundo por um minuto. Em seguida, carregue 100 microlitros de eritrócitos marcados com ICG em uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 30 e injete as células na veia da cauda ou injete-as retroorbitalmente. Imediatamente após a injeção, tire uma nova imagem de fundo infravermelho e um novo vídeo de filtro ICG.
Depois de adquirir os vídeos, exporte-os em formato TIFF para análise de imagens. Processe as imagens usando o pacote de software de imagem disponível gratuitamente, MHJ. Depois de abrir o arquivo, defina o intervalo de quadros do vídeo da imagem para medições de velocidade.
Em seguida, abra o plug-in MtrackJ. No menu, selecione rastreamento e alterne a opção para mover para o próximo índice de período de tempo após adicionar um ponto. Agora localize uma célula de interesse e acompanhe cada quadro.
No menu, clique em adicionar para adicionar uma nova faixa e, em seguida, clique na célula escolhida. Em seguida, continue clicando na posição atual da célula à medida que as imagens avançam de quadro a quadro. Uma vez rastreado, altere a opção de exibição da trajetória das opções de exibição e opte por exibir apenas os pontos de rastreamento no momento atual.
Continue clicando até que a trajetória da célula seja exibida e salve a trilha. Agora prossiga com o rastreamento da próxima célula, começando com o comando add e prosseguindo como com a primeira célula. Depois de rastrear todas as células de interesse, abra a exibição de todas as medições da trilha usando a opção de medição.
Em seguida, salve a saída para análise posterior. Os eritrócitos marcados com 1,5% ICG foram visualizados na circulação retiniana de camundongos C57 pretos 6J usando 1% ou 5% de hematócrito, as células foram distinguíveis, mas no hematócrito de 1% as células marcadas foram mais facilmente visualizadas. Com qualquer concentração injetada, alguma eritmostasia foi observada na região parapapilar e foi mais visível com o hematócrito de 5%.
Os leucócitos foram marcados com fluoresceína de sódio a 1% e visualizados como células marcadas em verde usando microscopia de fluorescência. Alguma aglomeração foi observada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis horas se executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante dilatar os olhos para adquirir imagens e vídeos retinianos de qualidade.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para a imagem de células vivas de células sanguíneas na circulação ocular, focando em doenças retinianas como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. O protocolo permite que os pesquisadores visualizem a dinâmica das células sanguíneas na circulação retiniana, fornecendo insights sobre os mecanismos da doença.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oftalmologia
- Técnicas de Imagem
Fundo
- Entender a circulação retiniana é crucial para estudar doenças retinianas.
- A imagem de células vivas pode revelar a dinâmica dos glóbulos brancos (GVs) e glóbulos vermelhos (GVer).
- Inflamaçã o e isquemia são fatores-chave na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade.
- Este método é direto e pode refletir diferentes fenótipos da doença.
Propósito do Estudo
- Visualizar a dinâmica das células sanguíneas na circulação retiniana.
- Investigar a contribuição da dinâmica do fluxo de células sanguíneas para a patogênese da doença.
- Fornecer um protocolo que possa ser facilmente replicado por outros pesquisadores.
Métodos Usados
- Uso de um oftalmoscópio a laser de varredura para a imagem.
- Isolamento de células sanguíneas de camundongo usando uma solução de polissacarídeo e diatrizoato de sódio.
- Centrifugaçã o de amostras de sangue para separar os componentes.
- Imagem de células vivas para observar a dinâmica das células sanguíneas em tempo real.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida da dinâmica das células sanguíneas na circulação retiniana.
- Insights sobre a dinâmica do fluxo de GVs e GVer.
- Demonstração de como essas dinâmicas se relacionam com a patogênese da doença retiniana.
- Estabelecimento de um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- O método fornece insights valiosos sobre a circulação retiniana e os mecanismos da doença.
- A imagem de células vivas é uma ferramenta eficaz para estudar doenças retinianas.
- Este protocolo pode facilitar mais pesquisas em saúde ocular.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of blood cell flow dynamics in the retinal circulation, providing mechanistic insights into vascular contributions to ocular disease pathogenesis. By labeling erythrocytes and leukocytes with distinct fluorescent dyes, researchers can quantitatively assess cellular trafficking, adhesion, and stasis in vivo. This supports target validation and phenotypic screening in preclinical models of diabetic retinopathy, glaucoma, and inflammatory eye diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of leukocyte-endothelial interactions and erythrocyte flow abnormalities as potential therapeutic targets in retinal inflammation and ischemia.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo assay to de-risk hypotheses about blood cell contributions to vascular leakage or occlusion.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cell velocity, flux, and stasis in retinal capillaries for compound screening.
- Operational Value: Standardized labeling protocol ensures assay consistency across studies and supports high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links cellular hemodynamic changes to disease phenotypes in murine models, supporting translational biomarker discovery.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of therapeutic intervention effects on retinal blood flow dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical efficacy assessment, offering a functional readout of vascular integrity and inflammation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing how genetic or pharmacological perturbations alter leukocyte rolling or erythrocyte flux in retinal vasculature.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (e.g., cell velocity, stasis frequency) suitable for automated image analysis and hit validation.
- Analytics: Enables statistical comparison of flow parameters across experimental groups using tracked trajectory data.
- Translational Research: Connects cellular imaging findings to pathophysiological processes relevant to human retinal diseases.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating vascular-targeted therapeutics across multiple ocular disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in retinal disease models by providing direct evidence of blood cell-mediated vascular dysfunction.
- Operational Value: Standardized cell labeling and imaging procedures enhance reproducibility and cross-laboratory comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying early vascular safety signals or target engagement in vivo.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on retinal hemodynamics and inflammatory cell trafficking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse handling, blood cell isolation, and fluorescent dye handling.
- Dependent on access to a scanning laser ophthalmoscope with appropriate filter sets for ICG and fluorescein detection.
- Necessitates standardization of hematocrit levels and dye concentrations to ensure consistent signal-to-noise ratios.
- Adaptation to disease models may require optimization for altered blood viscosity or cell adhesion properties.
- Practical limitations include potential cell clumping during leukocyte labeling and photobleaching during prolonged imaging sessions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Isolation and Labeling of Erythrocytes (ICG) and Leukocytes (Sodium Fluorescein)
7:38
Conclusion
6:56
Results: Visualizaing the Labeled Erythrocytes and Leukocytes
3:25
Live-cell Imaging of Labeled Erythrocytes
5:26
Image Analysis Using MtrackJ Software
