Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse
3 de julho de 2017
A imagem em células vivas das células sanguíneas marcadas na circulação ocular pode fornecer informações sobre inflamação e isquemia na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. É descrito um protocolo para rotular as células do sangue e imagem das células rotuladas na circulação da retina.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar a circulação de células sanguíneas na retina do camundongo utilizando um oftalmoscópio a laser de varredura. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre doenças retinianas, como, por exemplo, quais são as dinâmicas das células brancas e vermelhas do sangue no assoalho retiniano e como suas dinâmicas de fluxo podem contribuir para a patogênese da doença. As principais vantagens desta técnica são a capacidade de refletir diferentes fenótipos de doenças e a sua grande facilidade de execução.
Este procedimento será demonstrado por nossos membros da equipe, Praveen, Bo Bo e Neha. Para isolar a camada de células sanguíneas de camundongo, colete sangue total fresco e coloque-o sobre uma solução de polissacarídeo e diatrizoato de sódio na proporção 1:1 em um tubo de dois mililitros. Em seguida, centrifugue o tubo por 30 minutos.
Em seguida, aspire e descarte o sobrenadante plasmático. Então, colete cuidadosamente a camada de buffy coat, composta por leucócitos, e a camada subjacente de eritrócitos em tubos separados. A seguir, lave os eritrócitos com PBS 1X para remover quaisquer contaminantes e re-suspenda-os em um volume de PBS.
Em seguida, transfira alíquotas de meio mililitro da suspensão para tubos de microcentrífuga. Centrifugue as alíquotas, descarte o sobrenadante e adicione cerca de 200 microlitros de PBS 40% 1X aos eritrócitos em pellet. Misture bem.
E incube-os à temperatura ambiente por cinco minutos. Após cinco minutos, adicione 100 microlitros de ICG a cada suspensão. Misture os tubos utilizando inversões e, em seguida, incube-os à temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, adicione 300 microlitros de PBS 1X e incube por uma hora com agitação suave a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugue as suspensões, mantenha as células do pellet e re-suspenda-as em um mililitro de PBS 1X. Continue lavando as células com PBS 1X até que o sobrenadante fique límpido.
Após a decantação do sobrenadante, adicione novamente um volume de BSA 1% em PBS para obter um hematócrito de 50% de eritrócitos marcados com ICG. Em seguida, processe a coleta da camada de células mononucleares. Primeiramente, lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS 1X para remover quaisquer contaminantes.
Centrifugue as amostras novamente e, em seguida, ressuspenda o pellet em 900 microlitros de PBS 1X. Em seguida, adicione 100 microlitros de fluoresceína sódica a 10% e incube as células à temperatura ambiente por dois minutos. Por fim, lave os linfócitos marcados três vezes com 10 mililitros de PBS 1X.
Centrifugue e ressuspenda-os em 100 microlitros de PBS 1X. Para preparar os eritrócitos marcados com ICG para injeção, primeiramente dilua uma alíquota para injeção até um hematócrito de 5% ou 1%. Anestesie o camundongo e dilate suas pupilas.
Em seguida, aplique pomada oftálmica em ambos os olhos. Coloque uma lente de contato sobre um dos olhos. Agora, realize a imagem do camundongo usando uma câmera confocal SLO com uma lente positiva de 25 dioptrias para compensar a refração do olho.
Posicione cuidadosamente a córnea diretamente sobre a cabeça óptica da máquina de SLO. Em seguida, ligue o módulo de imagem e movimente-o até que o nervo óptico esteja centralizado na tela de imagem. Depois, sob um ângulo de 30 graus, capture as imagens do fundo do olho em infravermelho.
Em seguida, realize um vídeo de fundo infravermelho. Ligue o filtro ICG de 790 nanômetros, configure o modo da câmera para adição de alta velocidade e mantenha o ângulo de visão entre 15 e 30 graus. Em seguida, ajuste a intensidade de ICG para 85 em todas as leituras.
No painel de controle, clique no botão de aquisição para capturar um vídeo de referência a 8,8 a 15 quadros por segundo durante um minuto. Em seguida, carregue 100 microlitros de eritrócitos marcados com ICG em uma seringa de insulina com agulha de 30 graus e injete as células na veia da cauda ou por via retroorbital. Imediatamente após a injeção, capture uma nova imagem de fundo infravermelho e um novo vídeo com filtro ICG.
Após adquirir os vídeos, exporte-os em formato TIFF para análise de imagem. Processe as imagens utilizando o pacote de software de imagem disponível gratuitamente, MHJ. Após abrir o arquivo, defina o intervalo de quadros do vídeo de imagem para as medições de velocidade.
Em seguida, abra o plugin MtrackJ. No menu, selecione rastreamento e ative a opção para avançar para o próximo índice de quadro após adicionar um ponto. Agora, localize uma célula de interesse e acompanhe-a em cada quadro.
No menu, clique em adicionar para incluir uma nova trilha e, em seguida, clique na célula escolhida. Depois, continue clicando na posição atual da célula conforme as imagens avançam quadro a quadro. Após rastrear, altere a opção de exibição da trajetória nas opções disponíveis e escolha exibir apenas os pontos da trilha no momento atual.
Continue clicando até que a trajetória da célula seja exibida e, em seguida, salve o rastro. Agora prossiga com o rastreamento da próxima célula, iniciando com o comando adicionar e procedendo como com a primeira célula. Após rastrear todas as células de interesse, abra a exibição de todas as medidas dos rastros utilizando a opção medir.
Em seguida, salve a saída para análises posteriores. Os eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram visualizados na circulação retiniana de camundongos C57 black 6J utilizando hematócrito a 1% ou 5%; as células foram distinguíveis, mas com hematócrito a 1%, as células marcadas foram visualizadas com maior facilidade. Com qualquer concentração injetada, alguma eritrostase foi observável na região parapapilar, sendo mais visível com hematócrito a 5%.
Os leucócitos foram marcados com 1% de fluoresceína sódica e visualizados como células marcadas em verde utilizando microscopia de fluorescência. Algumas aglomerações foram observadas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em seis horas se executada corretamente.
Ao realizar este procedimento, é importante dilatar os olhos para obter imagens e vídeos de qualidade da retina.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para imagem em tempo real de células sanguíneas na circulação ocular, com foco em doenças retinianas como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. O protocolo permite aos pesquisadores visualizar a dinâmica das células sanguíneas na circulação retiniana, fornecendo insights sobre os mecanismos das doenças.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oftalmologia
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- Compreender a circulação retiniana é fundamental para o estudo das doenças retinianas.
- A microscopia de células vivas pode revelar a dinâmica dos glóbulos brancos (WBCs) e dos glóbulos vermelhos (RBCs).
- A inflamação e a isquemia são fatores-chave na retinopatia diabética e na degeneração macular relacionada à idade.
- Este método é simples e pode refletir diferentes fenótipos de doenças.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a dinâmica das células sanguíneas na circulação retiniana.
- Investigar a contribuição da dinâmica do fluxo de células sanguíneas para a patogênese da doença.
- Fornecer um protocolo que possa ser facilmente replicado por outros pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Uso de um oftalmoscópio a laser de varredura para imagem.
- Isolamento de células sanguíneas de camundongo utilizando uma solução de polissacarídeo e diatrizoato de sódio.
- Centrifugação de amostras de sangue para separar os componentes.
- Imagem de células vivas para observar a dinâmica das células sanguíneas em tempo real.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da dinâmica das células sanguíneas na circulação retiniana.
- Compreensão das dinâmicas de fluxo dos glóbulos brancos e glóbulos vermelhos.
- Demonstração de como essas dinâmicas se relacionam com a patogênese de doenças retinianas.
- Estabelecimento de um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- O método fornece informações valiosas sobre a circulação retiniana e os mecanismos das doenças.
- A microscopia de células vivas é uma ferramenta eficaz para o estudo de doenças retinianas.
- Este protocolo pode facilitar pesquisas adicionais na área da saúde ocular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização direta da dinâmica do fluxo de células sanguíneas na circulação retiniana, fornecendo insights mecanicistas sobre as contribuições vasculares para a patogênese de doenças oculares. Ao marcar eritrócitos e leucócitos com corantes fluorescentes distintos, os pesquisadores podem avaliar quantitativamente o tráfego celular, adesão e estase in vivo. Isso apoia a validação de alvos e a triagem fenotípica em modelos pré-clínicos de retinopatia diabética, glaucoma e doenças oculares inflamatórias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as interações entre leucócitos e endotélio e as anormalidades no fluxo de eritrócitos como alvos terapêuticos potenciais na inflamação e isquemia retinianas.
- Valor Operacional: Fornece um ensaio in vivo reprodutível para reduzir os riscos de hipóteses sobre a contribuição das células sanguíneas para vazamento vascular ou oclusão.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas da velocidade celular, fluxo e estase em capilares retinianos para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Um protocolo padronizado de marcação assegura consistência do ensaio entre estudos e apoia fluxos de trabalho de imagemagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona alterações hemodinâmicas celulares a fenótipos de doenças em modelos murinos, apoiando a descoberta de biomarcadores translacionais.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento longitudinal dos efeitos de intervenções terapêuticas sobre a dinâmica do fluxo sanguíneo retiniano.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a avaliação da eficácia pré-clínica, oferecendo uma leitura funcional da integridade vascular e da inflamação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao visualizar como perturbações genéticas ou farmacológicas alteram o rolamento de leucócitos ou o fluxo de eritrócitos na vasculatura retiniana.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas (por exemplo, velocidade celular, frequência de estase) adequadas para análise automatizada de imagens e validação de alvos.
- Análises: Permite a comparação estatística de parâmetros de fluxo entre grupos experimentais utilizando dados de trajetórias rastreadas.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados de imagem celular a processos fisiopatológicos relevantes para doenças retinianas humanas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de terapêuticas direcionadas ao sistema vascular em múltiplos modelos de doenças oculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em modelos de doenças retinianas ao fornecer evidência direta de disfunção vascular mediada por células sanguíneas.
- Valor Operacional: Procedimentos padronizados de marcação celular e de imagem aumentam a reprodutibilidade e a comparabilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao identificar sinais precoces de segurança vascular ou o engajamento do alvo in vivo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seus efeitos na hemodinâmica retiniana e no tráfego de células inflamatórias.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manipulação de camundongos, isolamento de células sanguíneas e manuseio de corantes fluorescentes.
- Depende do acesso a um oftalmoscópio a laser de varredura com conjuntos de filtros apropriados para detecção de ICG e fluoresceína.
- Necessita padronização dos níveis de hematócrito e das concentrações de corante para garantir razões sinal-ruído consistentes.
- A adaptação a modelos de doenças pode exigir otimização para viscosidade sanguínea alterada ou propriedades de adesão celular.
- Limitações práticas incluem possível agregação celular durante a marcação de leucócitos e fotodegradação durante sessões prolongadas de imagem.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:54
Isolation and Labeling of Erythrocytes (ICG) and Leukocytes (Sodium Fluorescein)
7:38
Conclusion
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Results: Visualizaing the Labeled Erythrocytes and Leukocytes
3:25
Live-cell Imaging of Labeled Erythrocytes
5:26
Image Analysis Using MtrackJ Software
