Name: Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprenda a purificar a enzima G4 Resolvase1 de culturas bacterianas usando uma etapa de purificação dependente de ATP. Este método isola enzima cataliticamente ativa e quase pura para ensaios bioquímicos in vitro.

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Gostaríamos de agradecer aos nossos fontes de financiamento, incluindo uma oferta generosa da Fundação Ware (a JPV), Os Institutos Nacionais de HealthGrant T32-CA079448 (a PJS), e os fundos de arranque Ball State University (para PJS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
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<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
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<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
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<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
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<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo representa uma expressão, purificação e quantificação regime altamente eficiente para o isolamento do produto do gene DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, também chamado RHAU e DHX36) (Figura 1). Este protocolo utiliza dois passos de purificação: His-tag de purificação por afinidade em esferas de afinidade de cobalto e purificação enzimática em grânulos-G4-ADN conjugado. O último passo é o único que aproveita a afinidade apertado, alta especificidade e atividade catalítica desenrolamento que rG4R1...

estruturas G4 são estruturas secundárias de ácido nucleico altamente estáveis ​​que se formam dentro de regiões ricas em guanina de ADN e ARN. Estruturas G4 são estabilizadas através de interacções de ligação de Hoogsteen-e coordenadas de ligação dentro da cavidade central com catiões monovalentes (isto é. De K + e Na +), que contribuem de forma significativa para a estabilidade térmica notável de estruturas G4 1, 2. Bioinformática estudos anteriores sugeriram que o genoma humano contém&gt; 375.000 &quot;potencial de formação de motivos G4&quot; 3, 4. Estimativas mais recentes sugerem que o número de motivos G4 é maior por um factor de 2-5 5, enquanto outro estudo prevê 716,310 potenciais sequências formando-G4 distintos no genoma humano 6. G4-forming sequências são evolutivamente conservados e não disperso aleatoriamente emdo genoma. Motivos G4 são enriquecidos em regiões codificantes dos genes, e para cima de 40% de todos os promotores de genes contêm G4 motivos 7. Interessantemente, o grau de enriquecimento de motivos G4 em um gene tem sido demonstrada para sugerir a função do gene. Por exemplo, os proto-oncogenes e genes envolvidos no desenvolvimento têm significativamente maior enriquecimento de estruturas G4 do que os genes supressores de tumor 8, 9. Com altas estabilidades térmicas, uma presença quase onipresente em todo o genoma, e o potencial de afetar significativamente principais processos celulares, não é surpreendente descobrir que a célula evoluiu enzimas para gerir essas estruturas. Uma tal enzima é G4 Resolvase1 (G4R1; também chamado RHAU e DHX36), o que foi caracterizado como a fonte da maioria da actividade resolver G4-ADN em tetramolecular (HeLa) 10 células humanas. Desde então, tem sido demonstrado THAt G4R1 liga firmemente e cataliticamente desenrola G4-DNA tetramolecular e unimolecular e G4-RNA com as mais apertadas KDs relatada para uma proteína de ligação G4 11, 12, 13. Além disso, a actividade de resolução de G4 do G4R1 tem sido implicada numa ampla gama de processos bioquímicos e celulares, incluindo a dos telómeros / telomerase Biology 11, 14, 15, 16, transcrição e de emenda 17, 18, 19, 20, de desenvolvimento 21, hematopoiese 21 e imune regulação 22, 23. Com uma preponderância de sequências G4 especificamente situado ao longo do genoma e a diversidade p celularrocesses que G4R1 recentemente foi implicado por estar envolvido com, a capacidade de expressar e eficiente purificar altamente ativa rG4R1 será da maior importância para a elucidação dos mecanismos bioquímicos e comportamentos desta proteína. Aqui, nós demonstramos uma expressão nova e esquema de purificação (Figura 1) que tira proveito da, atividade de resolução de G4 dependente de ATP rG4R1 para isolar eficiente enzima ativa. Este esquema pode ser adaptado para purificar outras enzimas de ácidos nucleicos dependentes de ATP para o qual o produto da reacção enzimática não é mais um substrato para a ligação, como é o caso para G4R1.

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 plasmídeo</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS células competentes</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Fantástico</td><td>Difco Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 &micro; g/mL em placas bacterianas/grandes culturas</td></tr><tr><td>Carpenicilina (cultura de células vegetais testada)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &micro; g/mL em placas bacterianas/grandes culturas</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima (de clara de ovo de galinha)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1963-B</td><td>ou de fonte padrão</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1966</td><td>ou de fonte padrão</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCl, pH 8,8</td><td></td><td></td><td>Para fundição de gel de resolução (para gel de quantificação de proteínas); Da fonte padrão</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6,8</td><td></td><td></td><td>Para fundição de gel de empilhamento (para gel de quantificação de proteínas); De fonte padrão</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetato, pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1981</td><td>ou de fonte padrão</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td>De fonte padrão</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (1&nbsp; Solução M)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1665</td><td>ou de fonte padrão</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Hemissulfato de leupeptina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos paramagnéticos de estreptavidina</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8&nbsp;</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>0718</td><td>ou de fonte padrão</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td></td><td>Da fonte padrão; ajuste inicialmente o pH com NaOH, depois ajuste o pH de volta para baixo com HCl.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>A-lactalbumina (Tipo 1 de leite bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Contas de afinidade de metal cobalto</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (de fonte bacteriana)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Solução de 40% de acrilamida/Bis (37.5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>para fazer gel de proteína funcionando tampão (192 mM de glicina, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)</td></tr><tr><td>10% de dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1667</td><td>para fazer tampão de corrida de gel de proteína (192 mM de glicina, 25 mM de Tris Base, 0,1% SDS); ou de fonte padrão</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>ou de fonte padrão</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>para fazer gel de proteína executando tampão (192 mM glicina, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); Da fonte padrão</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr> Marcadores MW de <tr><td>proteína de ampla faixa</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Z33 biotinilado ("Z33-Bio")</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5 ' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotina 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")</td> <td>Oligos Etc</td><td></td><td>5 ' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>Placa TLC revestida com flúor</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% em H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada</td><td></td><td></td> UV multibanda <td>Capaz de emitir luz UV a 365 nm</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa (com rotor de caçamba oscilante)</td><td></td><td></td><td>Capaz de ser resfriado a 4 graus; C</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td>Capaz de ser resfriada a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>Ou equivalente capaz de fornecer pulsos de sonicação (amplitude de 30%, 2 s ON/2 s OFF)</td></tr><tr><td>50 &deg; C banho-maria</td><td></td><td></td><td>Para a formação de Z33 em quadruplex</td></tr><tr><td>37 &deg; C incubadora para bactérias</td><td></td><td></td><td>Para transformações bacterianas e crescimento inicial durante a noite de grandes culturas de Rosetta2 E. coli transformadas com TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &deg; C/14&nbsp; &deg; Incubadora de agitação C para bactérias</td><td></td><td></td><td>Para crescimento e indução de proteínas de grandes culturas de Rosetta2 E. coli transformadas com TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td></td><td></td><td>capaz de ler OD600; capaz de ler concentrações de oligômeros com base na sequência de bases (como Biorad SmartSpec 3000)</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 e 50 mL (polipropileno)</td><td></td><td></td><td>Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (2,0 mL)</td><td></td><td></td><td>Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga de 500 mL (polipropileno)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Matriz padrão de pontas de pipeta e pipetas</td><td></td><td></td> sorológicas <td>Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Pontas</td><td></td><td></td><td>de carregamento de gel De fonte padrão</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td> de repetição automática <td>Para alíquota rápida de rG4R1; De fonte padrão</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td>De fonte padrão</td></tr><tr><td>Nitrogênio Líquido</td><td></td><td></td><td>De fonte padrão</td></tr><tr><td>Gelo</td><td></td><td></td> seco <td>De fonte padrão</td></tr><tr><td>Tampão de amostra Laemlli&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho para executar géis de placas grandes</td><td>Biorad</td><td></td><td>Usamos o aparelho de células xi Protean II da Biorad</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>Usamos um ímã da One Lambda (agora uma marca Thermo Fisher Scientific); e a Life também é uma subsidiária da Thermo e, portanto, o ímã listado aqui deve ser uma substituição adequada</td></tr><tr><td>Lâminas</td><td></td><td></td> <td>de barbearDa fonte padrão</td></tr><tr><td>Papel de filtro e funil</td><td></td><td></td><td>Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Caçarola</td><td></td><td></td><td>de vidro Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td> orbital <td>Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Protetores</td><td></td><td></td> de folha transparente <td>Da fonte padrão</td></tr><tr><td>Scanner e associado Software</td><td></td><td></td> TWAIN <td>De fonte padrão</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> de análise de imagem <td>como Fuji Multiguage, ou equivalente</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Ou equivalente&nbsp;</td></tr></tbody></table>

uma abordagem dna afinidade g-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa g4 resolvase1

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

estruturas de ácidos nucleicos de ordem superior chamado G-quadruplexes (G4S, estruturas G4) podem formar em regiões ricas em guanina de ADN e ARN e são altamente termicamente estável. Existem&gt; 375.000 sequências formando-G4 putativos no genoma humano, e são enriquecidos em regiões promotoras, regiões não traduzidas (UTRs), e dentro da repetição telomérica. Devido ao potencial para estas estruturas de afectar os processos celulares, tais como a replicação e transcrição, a célula tem evoluído enzimas para geri-los. Uma tal enzima é uma resolvase G4 (G4R1), que foi co-bioquimicamente caracterizado pelo nosso laboratório e Nagamine et al. e verificou-se ligam-se muito bem para ambas G4-ADN-ARN e G4 (K d no intervalo de baixo pM). G4R1 é a fonte da maioria da actividade de resolução de G4 em lisados ​​de células HeLa, e desde então sido implicada como desempenhando um papel no metabolismo dos telómeros, linfa desenvolvimento, a transcrição do gene, a hematopoiese, e vigilância imunitária. A capacidade de eftemente expressar e purificar cataliticamente activa G4R1 é de importância para os laboratórios interessados ​​em ganhar mais conhecimento sobre a interação cinética das estruturas G4 e enzimas resolver G4. Aqui, nós descrevemos um método detalhado para a purificação de G4R1 recombinante (rG4R1). O procedimento descrito incorpora a purificação baseada em afinidade tradicional de uma enzima de histidina marcada com C-terminal expressa em bactérias com codões optimizados humanos com a utilização da capacidade de se ligar e rG4R1 relaxar G4-ADN para purificar a enzima altamente activo numa ATP etapa de eluição dependente. O protocolo também inclui um passo de controlo de qualidade em que a actividade enzimática da rG4R1 é medida examinando a capacidade da enzima purificada para relaxar G4-ADN. Um método é também descrito que permite a quantificação de rG4R1 purificado. adaptações alternativas deste protocolo são discutidos.

Este protocolo (Figura 1) rotineiramente produz quase puro, rG4R1 cataliticamente ativo. Como uma medida da actividade enzimática, que é tipicamente observado que 50% de 0,2 pmol de G4-ADN tetramolecular TAMRA-marcado é convertido em monómeros dentro do 0,2 - gama uL 0,013 de rG4R1, como ensaiado pelo ensaio de actividade G4 acima referido (Figura 2). Coloração com Coomassie de rG4R1 purificada indica uma única banda no 120 tamanho esperado kDa, com uma banda contaminante menor a ~ 75 k...

G4 Resolvase1 liga-se a (G4) estruturas G-quadruplex com mais apertados afinidade reportada para uma proteína de ligação e G4 representa a maior parte da actividade de desenrolamento-G4 ADN em células HeLa. Nós descrevemos um protocolo romance que aproveita a afinidade e atividade desenrolamento dependente de ATP G4-Resolvase1 para purificar especificamente G4R1 recombinante cataliticamente ativo.

Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

O objetivo geral deste método é isolar a proteína helicase G-quadruplex G4 Resolvase1 a partir de um sistema de expressão bacteriana, utilizando uma etapa única de purificação dependente de ATP para obter uma enzima quase pura e cataliticamente ativa. Este método pode ajudar pesquisadores a obterem a proteína recombinante G4 Resolvase1 quase pura e cataliticamente ativa para uso em uma ampla variedade de ensaios bioquímicos in vitro. A principal vantagem desta técnica é que ela exclui enzimas mal dobradas ou de outra forma cataliticamente inativas da preparação proteica.A ideia de usar ATP para eluir a helicase de quadruplex-G surgiu após a impossibilidade de eluir a enzima cataliticamente ativa das microesferas de G4, mesmo em concentrações excepcionalmente altas de sal. Prepare e cultive grandes culturas bacterianas expressando a resolvasa 1 de quadruplex-G ou G4R1 conforme descrito no protocolo textual. Reconstitua o pellet bacteriano em três mililitros de tampão TN à temperatura ambiente.Segure os tubos na mão e agite suavemente para descongelar e ressuspender o pellet bacteriano. Após descongelamento e quando estiver relativamente homogeneamente suspenso, complete o volume par

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Estrutura cristalina de complexos DNA-proteína pode fornecer informações sobre a função da proteína, mecanismo, assim como, a natureza da interacção específica. Aqui, nós relatamos como otimizar o comprimento, a sequência e as extremidades do DNA duplex para co-cristalização...

Iterativo Otimização de Duplexos de DNA para Cristalização de SEQA-Complexos de DNA

Descrevemos ensaios descontínuos sensíveis baseados em gel para examinar a cinética de iniciação da fita atrasada usando as proteínas de replicação do bacteriófago T7.

Cinética da síntese de ADN de cadeia simples de retardamento<em&gt; In Vitro</em&gt; Pelos Bacteriophage T7 replicação Proteínas

Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

O presente protocolo demonstra o uso de um ensaio rápido de amplificação exponencial baseado em aptâmeros de 3 estágios para detectar alvos. A preparação da amostra, a amplificação do sinal e o desenvolvimento da cor são abordados para implementar este sistema para reconhecer a presença de teofilina sobre a cafeína.

Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios

Bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) são sondas químicas úteis para identificar e caracterizar estruturas G-quadruplex em modelos de DNA in vitro. Este protocolo detalha o procedimento para realizar reações de sondagem com B-CePs e para resolver produtos da reação por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução.

In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

Uma barreira significativa para tecnologias como o CRISPR são os eventos fora do alvo que podem interromper genes vitais. 'Circularização para relatórios in vitro de efeitos de clivagem por sequenciamento' (CIRCLE-seq) é uma técnica projetada para identificar locais de clivagem não intencionais. Este método mapeia a atividade de todo o genoma do CRISPR-Cas9 com alta sensibilidade e sem viés.

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

Este protocolo demonstra a realização de um ensaio de molécula única para visualização ao vivo do desenrolamento do DNA por CMG helicase. Ele descreve (1) a preparação de um substrato de DNA, (2) a purificação de Drosophila melanogaster CMG helicase marcada com fluorescência, (3) a preparação de uma célula de fluxo microfluídico para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) e (4) o ensaio de desenrolamento de DNA de molécula única.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Este protocolo descreve um ensaio de replicação de DNA de molécula única baseado em microscopia de fluorescência, permitindo a visualização em tempo real das interações entre DNA polimerases e obstáculos como estruturas G-quadruplex.

Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes

Um protocolo para a produção, purificação e uso de vesículas de membrana externa (OMV) empacotadas com enzimas, proporcionando maior estabilidade enzimática para implementação em diversas aplicações, é apresentado.

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

Aqui, apresentamos um método para expressar e purificar S100A12 (calgranulina C). Descrevemos um protocolo para medir sua atividade antimicrobiana contra o patógeno humano H. pylori .

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Aprenda a purificar a enzima G4 Resolvase1 de culturas bacterianas usando uma etapa de purificação dependente de ATP. Este método isola enzima cataliticamente ativa e quase pura para ensaios bioquímicos in vitro.

Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

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