Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

O objetivo geral deste método é isolar a proteína G-quadruplex helicase G4 Resolvase1 de um sistema de expressão bacteriana usando uma etapa de purificação dependente de ATP exclusiva para isolar enzimas quase puras e cataliticamente ativas. Este método pode ajudar os pesquisadores a obter a proteína G4 Resolvase1 recombinante quase pura e cataliticamente ativa para nós em uma ampla gama de ensaios bioquímicos in vitro. A principal vantagem dessa técnica é que ela exclui a enzima mal dobrada ou cataliticamente inativa da preparação da proteína.

A ideia de usar ATP para eluir a helicase G-quadruplex surgiu após a incapacidade de eluir a enzima cataliticamente ativa dos grânulos G4, mesmo em concentrações de sal excepcionalmente altas. Preparar e cultivar grandes culturas bacterianas que expressam G-quadruplex Resolvase1 ou G4R1 conforme descrito no protocolo de texto. Descongele o pellet bacteriano em três mililitros de tampão TN à temperatura ambiente.

Segure as garrafas na mão e gire para descongelar e ressuspender o pellet bacteriano. Depois de descongelado e suspenso de maneira relativamente uniforme, aumente o volume para cinco mililitros com tampão TN. Em seguida, dissolva 20 miligramas de lisozima em 250 microlitros de água por cultura e adicione às bactérias ressuspensas.

Deixe a lisozima digerir as bactérias por aproximadamente cinco a 10 minutos enquanto gira as garrafas na mão. A cor da suspensão começará a clarear ligeiramente à medida que a digestão prossegue, e a suspensão será relativamente não viscosa. Adicione 250 microlitros de coquetel inibidor de protease abreviado PIC.

Em seguida, adicione uma alíquota de 10 microlitros de leupeptina e misture bem. Coloque a suspensão no gelo e adicione 10 mililitros de tampão TN frio e 22 microlitros de beta mercaptoetanol ou BME. Transfira a suspensão para um tubo de 50 mililitros.

Sonicar as bactérias no gelo com um sonicador digital ajustado para 30% de amplitude. Pulsar a dois segundos ligado e dois segundos desligado por um minuto. Repita a sonicação três vezes, permitindo que as amostras esfriem no gelo por pelo menos dois minutos entre as etapas de sonicação.

Em seguida, adicione um volume igual de citrato de sódio sadio quatro X salino frio ou SSC mais BME, PIC e leupeptina e misture a suspensão. Em uma centrífuga de mesa pré-resfriada a quatro graus Celsius, centrifugue os lisados a 2.300 vezes G por 20 minutos. Em seguida, transferir o sobrenadante para tubos de 50 mililitros pré-arrefecidos.

Pegue um mililitro de esferas paramagnéticas de estreptavidina, ou suspensão SPB por cultura, e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Pellet o SPB com um ímã. Em seguida, lave o SPB duas vezes com dois X SSC mais cinco EDTA PH8 milimolares.

Em seguida, ressuspenda o SPB lavado em 200 microlitros da mesma solução. Adicionar uma alíquota de três OD de ADN G4 à suspensão SPB. Misture rapidamente pipetando para cima e para baixo várias vezes.

Em seguida, coloque os tubos em um rotador e gire em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Após este período de rotação, bloqueie o SPB ligado ao G4 adicionando um mililitro de 0,4% de lactalbumina e mantenha no gelo até que seja necessário. Para ligar a histidina G4R1 recombinante marcada com histidina a grânulos de cobalto, adicione um mililitro de pasta de grânulos de cobalto a cada tubo de 50 mililitros contendo o lisado bacteriano clarificado.

Incube a mistura por 20 minutos em temperatura ambiente em um rotador. Após a incubação, gire as esferas de cobalto a 110 vezes G por cinco minutos em uma centrífuga de mesa de quatro graus Celsius. Aspire o líquido com cuidado e deixe alguns mililitros de líquido para não perturbar as esferas de cobalto peletizadas.

Em seguida, lave as contas com 10 a 15 mililitros de quatro X SSC mais BME frios e peletize as contas como antes. Despeje o próximo lisado clarificado nas esferas de cobalto peletizadas. Incube por mais 20 minutos em temperatura ambiente no rotador e lave as contas com 10 a 15 mililitros de quatro X SSC mais BME.

Em seguida, jogue as contas a 100 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após uma segunda lavagem, aspire o líquido e deixe cerca de dois mililitros de contas e líquido no fundo do tubo. Transfira as esferas de cobalto ligadas à proteína para um tubo pré-resfriado de dois mililitros usando uma ponta de pipeta de um mililitro de largura.

Centrifugue brevemente os grânulos no tubo de dois mililitros em alta velocidade em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius. Remova e descarte suavemente o sobrenadante pipetando, tomando cuidado para não perder as esferas de cobalto ligadas às proteínas. Pipete 0,5 mililitros de tampão de eluição de histidina, ou HEB, nas esferas e ressuspenda-as invertendo o tubo.

Em seguida, incube as esferas de cobalto em HEB em um rotador por cinco minutos em uma câmara fria. Em seguida, centrifugue a suspensão a 18.000 vezes G em uma microcentrífuga de quatro graus Celsius por um minuto. Remova suavemente a proteína contendo sobrenadante pipetando cuidadosamente, deixando uma pequena quantidade de líquido em cima das esferas de cobalto.

Transferir o sobrenadante para um tubo pré-arrefecido de 15 ml. Repita essas etapas para um total de três eluições HEB. Em seguida, eluir uma vez com EDTA 0,2 molar em PH 6,0.

A cor das contas de cobalto mudará de rosa para branco à medida que o EDTA quelata o cobalto. Depois que esta quarta e última eluição for transferida para o tubo de 15 mililitros, pipetar o tampão de eluição residual das esferas de cobalto usando uma ponta de carregamento de gel na extremidade de uma ponta de pipeta de um mililitro. Ao mergulhar a ponta no fundo do tubo, a proteína residual contendo tampão de eluição pode ser coletada.

Pilote o G4 SPB preparado para o lado do tubo com um ímã e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de três res X ao G4 SPB e pipeta para misturar. Pipete o G4 SPB suspenso em tampão de três X res no tubo de 15 mililitros contendo aproximadamente dois mililitros de proteína contendo HEB EDTA.

Incube por 15 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação ocasional para que as contas não assentem. Depois de lavar o G4 SPB ligado à proteína, conforme descrito no protocolo de texto, coloque o G4 SPB com um ímã no gelo e ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão de eluição pré-aquecido. Transfira imediatamente as esferas para um tubo de PCR pré-aquecido e incube por 30 segundos a 37 graus Celsius.

Adicione imediatamente 12 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares e pipete vigorosamente 20 a 30 vezes. A combinação do alto teor de sal e ATP contidos no tampão de eluição serve para eluir G4R1 recombinante dos grânulos G4. Pulverize imediatamente o G4 SPB com um ímã e transfira a proteína contendo eluição para um tubo de PCR fresco no gelo.

Após a repetição da eluição e transferência, o produto final é de aproximadamente 200 microlitros de tampão de eluição contendo G4R1 recombinante purificado. Finalmente, execute o ensaio de atividade enzimática de controle de qualidade para testar se o G4R1 recombinante altamente ativo foi purificado conforme descrito no protocolo de texto. O ensaio G4 fornece uma medida da atividade enzimática G4R1 recombinante.

Dentro da faixa de 0,2 a 0,013 microlitros na enzima, observa-se normalmente que 50% dos 0,2 picomoles de DNA G4 tetramolecular marcado com tetrametilrodamina são convertidos em monômeros. A posição de Coomassie do G4R1 recombinante purificado indica uma única banda com o tamanho esperado de 120 kilodalton com uma banda contaminante menor em aproximadamente 75 kilodaltons. Esta banda pode representar G4R1 recombinante truncado que manteve sua capacidade de ligar grânulos de DNA G4 em eluição de maneira dependente de ATP.

A banda de interesse é quantificada em relação a uma curva padrão de proteína. Este protocolo normalmente obtém 200 microlitros de enzima purificada de 20 a 100 nanomolares por um litro de cultura de bactérias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar a proteína G4 Resolvase1 de um sistema de expressão bacteriana usando uma etapa de purificação dependente de ATP exclusiva para isolar uma enzima quase pura e cataliticamente ativa.

Uma vez dominado, e com a preparação prévia dos pellets de bactérias congeladas, a purificação do G4R1 recombinante pode ser realizada em aproximadamente seis horas. Para manter a atividade catalítica ideal da enzima, é importante manter a preparação no gelo, salvo indicação em contrário. Sempre use inibidores de protease.

Evite a formação de bolhas nos tubos. Congele a enzima purificada rapidamente e evite ciclos desnecessários de congelamento e descongelamento. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área definissem com precisão as afinidades de ligação e as atividades de helicase dessa proteína a uma ampla gama de substratos de DNA e RNA.

Este método também pode ser adaptado para a purificação de outras enzimas de ácido nucleico dependentes de ATP para as quais o produto da reação enzimática não é mais um substrato de ligação para a enzima.