Name: Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a determinar a seletividade de íons cloreto em channelrhodopsins usando gravações de patch-clamp de célula inteira em células HEK293. Este método fornece leitura direta da atividade do canal.

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Agradecemos a Maila Reh, Tharsana Tharmalingam e especialmente a Altina Klein pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) e o Cluster of Excellence Unifying Concepts em Catálise, UniCat, BIG-NSE (JV) e E4 (PH).

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Os autores não têm nada a divulgar.

A determinação de potenciais de reversão em condições iónicas e elétricas definidas fornece informações sobre a espécie de íons transportada após a ativação leve de ChRs. Se exclusivamente uma espécie de iões é variada num meio fisiológico complexo e o potencial de reversão obtido se desloque de acordo com o potencial teórico de Nernst, esta espécie de iões é a única transportada. No entanto, para ChRs, reversão potenciais turnos são geralmente menos pronunciada do que o esperado a partir da...

Channelrhodopsins (ChR) são luz-gated canais iônicos que ocorrem na mancha do olho de algas verdes motile, e servem como fotossensores primários para phototaxis e respostas fóbicas [ 1] . Desde sua primeira descrição em 2002 2 , os CHRs abriram o caminho para o campo emergente da optogenética e podem ser aplicados em uma variedade de células excitáveis, por exemplo, dentro dos músculos esqueléticos, do coração ou do cérebro 3 , 4 , 5 . A expressão de ChRs em células alvo resulta na permeabilidade iónica controlável pela luz da respectiva célula. Num contexto neuronal, isto permite a activação 6 , 7 , 8 ou inibição 9 , 10 de potencial de acção (AP) disparando - dependendo do ião conduzido - com o espaço e temporalPrecisão da luz enfatizando como a seletividade iónica de uma variante ChR determina sua aplicação optogenética. Os primeiros ChRs descobertos de Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri são permeáveis ​​aos prótons, mas também aos catiões monovalentes como o sódio, o potássio e, em menor grau, os catiões divalentes como o cálcio eo magnésio 11 , 12 , 13 . Actualmente, mais do que 70 canais de canal condutores naturais (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 e várias variantes de engenharia 18 , 19 , 20 com propriedades diferentes tais como Tamanho da fotocorriente, sensibilidade espectral, cinética e selectividade catiónica. Considerando que em neurociência, CCRs aRe usado para ativar as células e disparar APs, bombas microbianas conduzidas pela luz foram os únicos antagonistas disponíveis para silenciar neurônios por anos. Em 2014, dois grupos demonstraram simultaneamente que os CCRs podem ser convertidos em canalrhodopsins condutores de aniões (ACRs) por alteração da polaridade ao longo do suposto poro de condução iónica através da engenharia molecular 9 , 21 . Subseqüentemente, os ACRs naturais foram identificados em várias algas criptofitas 22 , 23 , 24 . Mais importante ainda, a ativação de luz de ACRs medeia as correntes de cloreto em neurônios adultos permitindo a inibição da atividade neuronal em intensidades de luz muito menores do que as bombas microbianas que apenas transportam cargas únicas por fóton absorvido. A actividade de ChR pode ser direccionada directamente por gravações electrofisiológicas de &quot;patch-clamp&quot; de correntes induzidas pela luz em células HEK293. O grampo de fixaçãoTécnica foi originalmente desenvolvida no final da década de 1970 25 e melhorada por Hamill et al. , Permitindo a gravação da entidade de correntes de uma célula pequena (modo célula inteira) com alta resolução de corrente e controle direto da tensão da membrana 26 . Aplicada em cultura de células, esta técnica proporciona um controlo preciso das condições de gravação iónicas e eléctricas e permite estudar a selectividade dos iões juntamente com a contribuição relativa dos iões para a corrente total. Aqui, exemplificamos o exame da seletividade iónica para a canalrhodopsina condutora de ânions de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 através do registro das relações tensão-corrente em várias concentrações de cloreto extracelular para provar alta condutância ao cloreto.

<table><tbody><tr><td>Células HEK293</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>Células renais embrionárias humanas</td></tr><tr><td></td><td>Retinal Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>totalmente trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrome</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Pontes de ágar</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td></td><td>Biomol 2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrome</td><td>S0615</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-Glicose</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Roth 3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-Metil-D-glucamina</td></tr><tr><td>Na-Aspartato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6683</td><td>Sal de sódio do ácido L-aspártico monohidratado</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>Quimioterapia competente E. coli</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de lisogenia médio</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Ágar-Ágar</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>Placas de ágar</td></tr><tr><td>Kit de purificação de plasmídeo</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Biocromo</td><td>A 2213</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-D-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Revestimento de lamínula</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Pipetas serológicas de</td><td>polimento de fogo</td>feitas <td></td> à medida</tr><tr><td></td><td>TPP</td><td></td><td>Diferentes tamanhos</td></tr><tr><td>Bancada limpa</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td>IKA</td><td>RCT clássico</td><td></td></tr><tr><td>Fio de prata</td><td>Produtos científicos</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>Eléctrodos, 0,64 mm (banho); 0,25 mm (eléctrodo)</td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Knick</td><td>765 Osmómetro Calimétrico</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Polimento a fogo</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Binder</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm internas Termômetro</td></tr> R&ouml de diâmetro <tr><td></td><td>Roth</td><td>P232</td><td>15 mm de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td> ssel Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10 suporte</td></tr> de <tr><td>pipeta</td> de transmissão <td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Dispositivos Moleculares</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>DigiData1400</td><td>Conversor analógico digital</td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>Ajustado para 540 nm microscópio de intensidade total</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Obturador</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>Driver de obturador</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Vidro capilarries</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>Capilares de borsilicato com extremidades polidas a fogo OD 1.5 mm ID&nbsp; 0.86 mm</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de banho</td><td>Lorenz Messger&auml; Conjunto de filtros de</td> banda tripla <td>MPCU</td><td></td>tebau</tr><tr><td></td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>Filtro de fluorescência&nbsp; ECFP/EYFP/mCherry&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>Optômetro</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>Medir intensidades de luz</td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de gravação</td><td>Fonte de</td> alimentação feita <td></td><td>sob</td>medida</tr><tr><td></td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>Evita o ruído elétrico do microscópio fonte de alimentação embutida</td></tr><tr><td>Mesa isolada por vibração</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>Mesa de Faraday feita sob medida ou qualquer mesa</td><td></td><td></td>comercial correspondente</tr><tr><td>Mangueiras</td><td>Qualquer comercial; por exemplo, Roth</td><td></td><td>Diferentes tamanhos e materiais para manuseio de banho e aplicação de pressão de pipeta; pontes de ágar</td></tr><tr><td>Linear agitador</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>Calculadora de potencial de junção líquida</td><td>Molecular Devices ou diretamente de Peter H. Barry</td><td></td><td>O programa está incluído no software de aquisição Clampex ou pode ser obtido em&nbsp; p.barry@unsw.edu.au</td></tr><tr><td>Software de aquisição de dados</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>Software de avaliação de dados</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank ou Addgene</td><td>KF992074.1 ou Addgene plasmídeo #85465</td><td>Codificação de gene para PsACR1</td></tr><tr><td>Guia do amplificador</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>O guia</td><td></td> do axônio</tr></tbody></table>

full-cell patch-clamp gravações para determinação eletrofisiológica de ion selectivity em channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Ao longo da última década, os channelrhodopsins tornaram-se indispensáveis ​​na pesquisa neurocientífica onde eles são usados ​​como ferramentas para manipular não-invasivamente processos elétricos em células-alvo. Neste contexto, a selectividade iónica de uma canalrhodopsina é de particular importância. Este artigo descreve a investigação da seletividade de cloretos para uma canalrhodopsina de Proteomonas sulcata, condutora de aniões, recentemente identificada, por meio de gravações electrofisiológicas em células HEK293. O procedimento experimental para a medição de fotocorrentes de luz-gated exige uma fonte de luz rápida comutável - idealmente monocromática - acoplada ao microscópio de uma instalação de patch-clamp, de outra forma convencional. Os procedimentos preparativos antes da experiência são descritos envolvendo a preparação de soluções tamponadas, considerações sobre potenciais de junção de líquidos, semeadura e transfecção de células e puxar de pipetas de remendo. A gravação real da relação tensão-correnteS para determinar os potenciais de reversão para diferentes concentrações de cloreto ocorre 24 h a 48 h após a transfecção. Finalmente, os dados eletrofisiológicos são analisados ​​com respeito a considerações teóricas de condução de cloreto.

<html> A Figura 2 mostra resultados representativos obtidos a partir de medições seguindo o protocolo descrito. Durante a iluminação com luz verde, Ps ACR1 apresenta uma corrente transitória rápida que decai rapidamente para um nível de corrente estacionária. Depois que a luz é desligada, as fotocorrentes decaem para zero em milissegundos ( Figura 2A ). A troca da concentração de cloreto extracelular provoca um deslocamento do potencial de invers...

Este artigo descreve como a seletividade iônica da channelrodopsina é determinada com registros eletrofisiológicos de patch-clamp de células inteiras usando células HEK293. Aqui, o procedimento experimental para investigar a seletividade de cloreto de uma channelrodopsina seletiva de ânions é demonstrado. No entanto, o procedimento é transferível para outras canalrodopsinas de seletividade distinta.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

O objetivo geral deste experimento é determinar a seletividade de cloreto de novos canais iônicos dependentes de luz. Este método pode responder a questões-chave na biofísica das canalrodopsinas, como amplitudes de fotocorrente, cinética e seletividade de íons. A principal vantagem dessa técnica é a leitura direta da atividade do canal biofísico que é rápida e fácil de replicar.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque cada etapa do procedimento experimental, desde a preparação de células HEK até o registro de fotocorrentes, deve ser otimizada. A semeadura e a transecção das células HEK serão demonstradas por Altina Klein. Para iniciar este procedimento, pese os componentes sólidos para 100 mililitros das soluções tamponadas intracelulares e 500 mililitros das soluções tamponadas extracelulares em béqueres separados.Em seguida, adicione a respectiva quantidade das soluções de estoque preparadas. Em seguida, adicione água ultrapura e ajuste cuidadosamente o pH usando ácidos e bases. Em seguida, ajuste a osmolaridade com glicose para 290 miliosmoles e 320 miliosmoles para as soluções intracelular e extracelular, respectivamente.Neste procedimento, coloque até três lamínulas de vidro revestidas de lisina lado a lado em uma placa de Petri de 35 milímetros. Em seguida, semeie 1,5 vezes 10 até a quinta célula HEK em dois mililitros de DMEM padrão suplementado com 10% de FBS e um retinol micromolar em cada placa. Para transfectar as células para cada placa, prepare uma solução de dois microgramas de DNA plasmidial em 250 microlitros de DMEM sem FBS e seis microlitros de reagente de transfecção.Após 15 minutos de incubação, adicione suavemente a solução às células. Antes de medir, puxe algumas pipetas de baixa resistência usando um extrator de micropipeta e poli-las. Armazene as pipetas em um recipiente livre de poeira para o dia da medição.30 minutos antes das gravações, ligue todos os componentes de configuração para aquecer até a temperatura de trabalho. Certifique-se de que os buffers estejam em temperatura ambiente. Para começar, sele a câmara de medição com silicone para evitar vazamento do tampão externo.Em seguida, coloque uma lamínula na câmara e feche-a. Encha a câmara cuidadosamente com tampão extracelular para evitar que as células se desprendam. Armazene a placa de Petri com outras lamínulas em uma incubadora para o próximo conjunto de experimentos.Em seguida, coloque a câmara de medição sob o microscópio usando a objetiva 40X para visualização celular. Em seguida, coloque uma ponte helicoidal sobre o eletrodo do banho e coloque-o na câmara junto com o sensor de nível de fluido e a saída de perfusão do manipulador de banho. Trocar a solução extracelular duas vezes por um mililitro de solução externa fresca para eliminar o meio de cultura residual e as células destacadas.Coloque as células em foco e procure uma célula transfectada que precise ser isolada de outras células. Em seguida, use um conjunto de filtros de banda tripla e luz laranja para excitar e visualizar mCherry. Em seguida, encha uma das pipetas puxadas com a solução intracelular.E remova as bolhas de ar virando a pipeta várias vezes. Em seguida, monte a pipeta no porta-pipetas e aplique um pouco de pressão positiva para evitar o entupimento da ponta. Localize a ponta da pipeta de remendo sob o microscópio e navegue-a perto da célula usando o micromanipulador.Dentro do software de aquisição de dados, inicie o teste de membrana no modo Bath e aplique um voltage passo. Verifique se a resistência da pipeta está na faixa desejada de 1,3 a 3,0 megaohms. Em seguida, zere as correntes de deslocamento e ajuste o potencial da pipeta girando o botão de deslocamento da pipeta no amplificador.Para estabelecer um adesivo na configuração de toda a célula, aproxime-se lentamente da célula com a pipeta de adesivo por cima e libere a pressão positiva antes de tocar na célula. Às vezes, a configuração anexada à célula se forma depois disso. Depois de se aproximar da célula, altere o teste de membrana do modo Banho para o modo Patch.Compense a capacitância da pipeta girando o botão de compensação da capacitância da pipeta para obter uma resposta plana do pulso de teste. Mude o teste de membrana para o modo Célula. Em seguida, rompa o remendo sem destruir a vedação aplicando pulsos curtos de pressão negativa ou pressão negativa com força crescente para obter a confirmação de toda a célula.Inicie a compensação de resistência em série definindo os dois parâmetros de célula inteira, capacitância da célula e resistência em série. No painel de compensação de resistência em série, ative a previsão e correção em até 90%Em seguida, ligue o interruptor de compensação de célula inteira e ajuste os parâmetros de célula inteira de forma iterativa para obter uma resposta de vedação de teste idealmente plana. Depois de estabelecer a configuração de células inteiras, aguarde pelo menos dois minutos antes de registrar para garantir a reposição suficiente da solução intracelular através da pipeta de remendo.Registre correntes induzidas por luz em diferentes potenciais de retenção. Em seguida, troque o tampão extracelular por cloreto baixo na câmara pelo menos cinco vezes sem destruir o remendo e registre outra relação de tensão de corrente na nova concentração de cloreto. Esta figura mostra que durante a iluminação com luz verde, PsACR1 apresenta uma corrente transitória rápida que decai rapidamente para um nível de corrente estacionária.Depois que a luz é desligada, as fotocorrentes decaem para zero em milissegundos. A redução da concentração de cloreto extracelular abole completamente as correntes fotográficas direcionadas para fora. A troca da concentração de cloreto extracelular causa uma mudança do potencial de reversão que pode ser deduzida de um gráfico de tensão de corrente.A avaliação dos potenciais de reversão a partir de múltiplas medições quantifica a mudança dramática do potencial de reversão causada pela variação da concentração externa de cloreto. Surpreendentemente, os potenciais de reversão medidos correspondem diretamente aos potenciais de Nernst calculados para o cloreto, o que confirma a alta seletividade de cloreto de PsACR1. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar registros eletrofisiológicos de fotocorrentes induzidas por luz em células HEK que expressam canalrodopsina.Uma vez dominado, todo o procedimento pode ser feito em quatro dias, enquanto a gravação de fotocorrentes leva várias horas. Complementando este procedimento, mutagênese dirigida ao local e métodos espectroscópicos podem ser realizados para elucidar ainda mais as características estruturais e os mecanismos celulares das canalrodopsinas. A caracterização e a engenharia molecular da channelrhodopsina abriram caminho para pesquisadores em neurociência manipularem a excitabilidade de neurônios selecionados pela luz.

whole-cell-patch-clamp-recordings-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.

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Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos...

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de patch clamp de célula inteira, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios de Mauthner e outras células reticuloespinhais em embriões de peixe-zebra.

Eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar as propriedades elétricas dos neurônios

O vídeo demonstra o registro da atividade elétrica nos neurônios fotorreceptores do omatídio de Drosophila, estabelecendo uma configuração de célula inteira. Ele destaca a ativação de canais potenciais de receptores transitórios por pulsos de luz, resultando em solavancos quânticos mensuráveis.

Gravações de grampo de voltagem de célula inteira de fotorreceptores de Drosophila

Neste vídeo, culturas de células renais embrionárias que expressam proteínas de canal iônico dependentes de luz fundidas com um repórter fluorescente demonstram o efeito da luz no movimento iônico. O patch clamp de célula inteira é usado para monitorar o movimento de íons.

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Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

As gravações de células inteiras dos fotorreceptores Drosophila melanogaster permitem a medição de solavancos escuros espontâneos, colisões quânticas, respostas macroscópicas à luz e relações tensão-tensão em várias condições. Em combinação com as ferramentas de manipulação genética de D. melanogaster , este método permite o estudo da via de sinalização inositol-lipídico ubíqua e seu alvo, o canal TRP.

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

O objectivo deste vídeo é demonstrar os procedimentos para a obtenção de células ciliadas saudáveis, intactas a partir dos órgãos do ouvido interno de peixes-zebra adultos e, em seguida, utilizando-os para os estudos de patch clamp para caracterização das propriedades biofísicas dos seus canais dependentes da voltagem.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Aprenda a determinar a seletividade de íons cloreto em channelrhodopsins usando gravações de patch-clamp de célula inteira em células HEK293. Este método fornece leitura direta da atividade do canal.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

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