Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

O objetivo geral deste experimento é determinar a seletividade de cloreto de novos canais iônicos dependentes de luz. Este método pode responder a questões-chave na biofísica das canalrodopsinas, como amplitudes de fotocorrente, cinética e seletividade de íons. A principal vantagem dessa técnica é a leitura direta da atividade do canal biofísico que é rápida e fácil de replicar.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque cada etapa do procedimento experimental, desde a preparação de células HEK até o registro de fotocorrentes, deve ser otimizada. A semeadura e a transecção das células HEK serão demonstradas por Altina Klein. Para iniciar este procedimento, pese os componentes sólidos para 100 mililitros das soluções tamponadas intracelulares e 500 mililitros das soluções tamponadas extracelulares em béqueres separados.

Em seguida, adicione a respectiva quantidade das soluções de estoque preparadas. Em seguida, adicione água ultrapura e ajuste cuidadosamente o pH usando ácidos e bases. Em seguida, ajuste a osmolaridade com glicose para 290 miliosmoles e 320 miliosmoles para as soluções intracelular e extracelular, respectivamente.

Neste procedimento, coloque até três lamínulas de vidro revestidas de lisina lado a lado em uma placa de Petri de 35 milímetros. Em seguida, semeie 1,5 vezes 10 até a quinta célula HEK em dois mililitros de DMEM padrão suplementado com 10% de FBS e um retinol micromolar em cada placa. Para transfectar as células para cada placa, prepare uma solução de dois microgramas de DNA plasmidial em 250 microlitros de DMEM sem FBS e seis microlitros de reagente de transfecção.

Após 15 minutos de incubação, adicione suavemente a solução às células. Antes de medir, puxe algumas pipetas de baixa resistência usando um extrator de micropipeta e poli-las. Armazene as pipetas em um recipiente livre de poeira para o dia da medição.

30 minutos antes das gravações, ligue todos os componentes de configuração para aquecer até a temperatura de trabalho. Certifique-se de que os buffers estejam em temperatura ambiente. Para começar, sele a câmara de medição com silicone para evitar vazamento do tampão externo.

Em seguida, coloque uma lamínula na câmara e feche-a. Encha a câmara cuidadosamente com tampão extracelular para evitar que as células se desprendam. Armazene a placa de Petri com outras lamínulas em uma incubadora para o próximo conjunto de experimentos.

Em seguida, coloque a câmara de medição sob o microscópio usando a objetiva 40X para visualização celular. Em seguida, coloque uma ponte helicoidal sobre o eletrodo do banho e coloque-o na câmara junto com o sensor de nível de fluido e a saída de perfusão do manipulador de banho. Trocar a solução extracelular duas vezes por um mililitro de solução externa fresca para eliminar o meio de cultura residual e as células destacadas.

Coloque as células em foco e procure uma célula transfectada que precise ser isolada de outras células. Em seguida, use um conjunto de filtros de banda tripla e luz laranja para excitar e visualizar mCherry. Em seguida, encha uma das pipetas puxadas com a solução intracelular.

E remova as bolhas de ar virando a pipeta várias vezes. Em seguida, monte a pipeta no porta-pipetas e aplique um pouco de pressão positiva para evitar o entupimento da ponta. Localize a ponta da pipeta de remendo sob o microscópio e navegue-a perto da célula usando o micromanipulador.

Dentro do software de aquisição de dados, inicie o teste de membrana no modo Bath e aplique um voltage passo. Verifique se a resistência da pipeta está na faixa desejada de 1,3 a 3,0 megaohms. Em seguida, zere as correntes de deslocamento e ajuste o potencial da pipeta girando o botão de deslocamento da pipeta no amplificador.

Para estabelecer um adesivo na configuração de toda a célula, aproxime-se lentamente da célula com a pipeta de adesivo por cima e libere a pressão positiva antes de tocar na célula. Às vezes, a configuração anexada à célula se forma depois disso. Depois de se aproximar da célula, altere o teste de membrana do modo Banho para o modo Patch.

Compense a capacitância da pipeta girando o botão de compensação da capacitância da pipeta para obter uma resposta plana do pulso de teste. Mude o teste de membrana para o modo Célula. Em seguida, rompa o remendo sem destruir a vedação aplicando pulsos curtos de pressão negativa ou pressão negativa com força crescente para obter a confirmação de toda a célula.

Inicie a compensação de resistência em série definindo os dois parâmetros de célula inteira, capacitância da célula e resistência em série. No painel de compensação de resistência em série, ative a previsão e correção em até 90%Em seguida, ligue o interruptor de compensação de célula inteira e ajuste os parâmetros de célula inteira de forma iterativa para obter uma resposta de vedação de teste idealmente plana. Depois de estabelecer a configuração de células inteiras, aguarde pelo menos dois minutos antes de registrar para garantir a reposição suficiente da solução intracelular através da pipeta de remendo.

Registre correntes induzidas por luz em diferentes potenciais de retenção. Em seguida, troque o tampão extracelular por cloreto baixo na câmara pelo menos cinco vezes sem destruir o remendo e registre outra relação de tensão de corrente na nova concentração de cloreto. Esta figura mostra que durante a iluminação com luz verde, PsACR1 apresenta uma corrente transitória rápida que decai rapidamente para um nível de corrente estacionária.

Depois que a luz é desligada, as fotocorrentes decaem para zero em milissegundos. A redução da concentração de cloreto extracelular abole completamente as correntes fotográficas direcionadas para fora. A troca da concentração de cloreto extracelular causa uma mudança do potencial de reversão que pode ser deduzida de um gráfico de tensão de corrente.

A avaliação dos potenciais de reversão a partir de múltiplas medições quantifica a mudança dramática do potencial de reversão causada pela variação da concentração externa de cloreto. Surpreendentemente, os potenciais de reversão medidos correspondem diretamente aos potenciais de Nernst calculados para o cloreto, o que confirma a alta seletividade de cloreto de PsACR1. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar registros eletrofisiológicos de fotocorrentes induzidas por luz em células HEK que expressam canalrodopsina.

Uma vez dominado, todo o procedimento pode ser feito em quatro dias, enquanto a gravação de fotocorrentes leva várias horas. Complementando este procedimento, mutagênese dirigida ao local e métodos espectroscópicos podem ser realizados para elucidar ainda mais as características estruturais e os mecanismos celulares das canalrodopsinas. A caracterização e a engenharia molecular da channelrhodopsina abriram caminho para pesquisadores em neurociência manipularem a excitabilidade de neurônios selecionados pela luz.