Investigações por microscopia de força atômica para o reconhecimento de lesões de DNA no reparo por excisão de nucleotídeos

O objetivo geral deste experimento de microscopia de força atômica é resolver as interações das proteínas de reparo do DNA com locais de dano no DNA e distinguir entre diferentes interações de DNA por vários complexos de proteínas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de reparo do DNA, como como um determinado sistema de reparo do DNA alcança o reconhecimento de suas lesões-alvo no DNA. A principal vantagem dessa técnica é que podemos ver e analisar diretamente os diferentes tipos de complexos envolvidos no processo de reconhecimento de lesões de DNA.

Demonstrando o procedimento estará Nicolas Wirth, que usou essa abordagem durante sua pesquisa de bacharelado. Para começar, prepare um substrato de DNA adequado gerando uma lacuna de DNA de fita simples em um plasmídeo. Preencha a lacuna com oligonucleotídeos de DNA de fita simples modificados e, finalmente, linearize o DNA plasmático usando enzimas de restrição apropriadas.

Para esses experimentos, os substratos de DNA de fita dupla têm cerca de 1.000 pares de bases de comprimento e contêm uma lesão de DNA, bem como uma região não emparelhada chamada bolha de DNA para carregamento de proteínas no DNA. Em seguida, prepare uma amostra de DNA de proteína para análise de AFM, pipetando primeiro o tampão de reação 10x e a água em um tubo de microrreação. Em seguida, adicione o DNA e as proteínas sob investigação.

Por exemplo, aqui, 100 nanomolares da amostra de DNA e um micromolar ou cada uma das proteínas de reparo de excisão de nucleotídeos eucarióticos XPD e p44. Em seguida, incube a reação por 30 minutos a 37 graus Celsius em um bloco de calor. Após a incubação, gire brevemente a amostra.

Em seguida, prepare um substrato de mica para colocar a amostra. Use um bisturi para cortar um pedaço de mica de um centímetro por um centímetro de uma tira maior. Em seguida, use um pedaço de fita adesiva para remover as camadas superiores da mica para revelar uma superfície de substrato limpa, plana e anatomicamente lisa.

Dilate a amostra de DNA de proteína cinquenta a cem vezes em tampão de deposição AFM e deposite imediatamente 20 microlitros da amostra diluída na superfície da mica. O fator de diluição depende da concentração da amostra. Imediatamente após depositar a amostra na superfície da mica, enxágue a amostra três a quatro vezes com alguns mililitros de água filtrada e deionizada e seque o excesso de líquido.

Use um jato suave de nitrogênio para secar a amostra. Por fim, use fita adesiva para fixar a amostra em suas bordas em uma lâmina de microscópio. Coloque a amostra no meio da platina do AFM e use almofadas magnéticas para fixar a lâmina do microscópio na platina.

Em seguida, insira a ponta do AFM no suporte da ponta. Fixe a ponta no suporte sob um grampo apertando o parafuso para que fique apertado com os dedos. Uma vez fixado, insira o suporte da ponta no cabeçote de medição do AFM.

Use os parafusos de posicionamento para mover a amostra em uma posição central. Coloque a cabeça de medição AFM em cima da amostra, certificando-se de que a cabeça esteja estável com as pernas dentro das reentrâncias do palco. Em seguida, alinhe o laser AFM na parte de trás do cantilever para obter a força do sinal ideal.

Observe o sinal de reflexão na janela de vídeo do AFM para posicionar grosseiramente o laser. Para este modelo do AFM, gire as rodas do lado direito e da parte traseira da cabeça da medida do AFM para ajustar as posições de X e de Y do laser do AFM a fim dirigi-lo centralmente na extremidade do cantilever. Em seguida, otimize o sinal de soma do detector ajustando a posição do laser com as duas rodas.

Direcione a reflexão do laser do AFM no centro do detector zerando o sinal diferente dos diodos da parte superior e da parte inferior da disposição do detector. Para esta etapa, gire o parafuso no lado esquerdo da cabeça de medição para este modelo AFM. Em seguida, determine a frequência de residência do cantilever acessando a janela de sintonia do painel mestre no software.

Escolha uma amplitude correspondente a uma entrada de um volt para o Piezo que aciona a oscilação do cantilever e, em seguida, defina a frequência de oscilação para 5% negativos, ligeiramente abaixo da frequência de residência. Agora execute um ajuste automático de frequência e zere a fase da oscilação. Deixe o sistema atingir o equilíbrio térmico por cerca de uma hora antes de iniciar a geração de imagens, a fim de evitar desvios.

Quando estiver pronto para iniciar a geração de imagens, no painel principal do software, defina um ponto de ajuste de proteção e prepare-se para aproximar a ponta da superfície da amostra selecionando engatar. Abaixe a roda dianteira da cabeça do AFM manualmente até que a configuração de proteção, ou ponto de ajuste, seja alcançada. Em seguida, abaixe cuidadosamente a roda dianteira até que o sinal do sensor Z esteja totalmente estendido para a esquerda.

Ative a mesa de oscilação de vibração e feche o invólucro de isolamento acústico. Em seguida, abaixe o ponto de ajuste no software AFM usando a roda de hamster para engatar a ponta do AFM com a amostra. Para realizar imagens no modo de derivação no regime repulsivo, abaixe o ponto de ajuste até que o sinal de fase se torne ligeiramente menor do que a fase de nível livre.

Em seguida, comece a escanear a amostra. Use a velocidade de varredura de 2,5 micrômetros por segundo em áreas de superfície de imagem de quatro micrômetros por quatro micrômetros ou oito micrômetros por oito micrômetros quadrados com resoluções de pixels de 2.048 ou 4.096, respectivamente; e pressione o botão Do Scan. Pré-selecione complexos de DNA de proteína relevantes por inspeção visual direta das imagens no software AFM.

Para amostras XPD, possíveis complexos incluem DNA XPD p44, bem como DNA XPD e DNA p44 com tamanhos distintamente diferentes devido às diferentes massas moleculares de XPD e p44. Meça os volumes de picos de proteínas individuais no DNA usando a ferramenta de seção na janela de análise para medir a altura e o diâmetro das seções de pico de proteína com os cursores da janela de seção. Use esses valores para determinar o volume dos picos usando modelos matemáticos simples para verificar o tipo complexo.

Finalmente, calibre seu sistema do AFM com uma escala das proteínas com pesos moleculares conhecidos para traduzir estes volumes em pesos moleculares aproximados das proteínas e dos complexos da proteína. Para determinar características adicionais, como comprimentos de fragmentos de DNA, as posições dos complexos de proteínas no DNA e suas especificidades do local-alvo ou ângulos de banda de DNA, consulte o protocolo de texto anexo. Mostrada aqui é uma imagem do AFM com os três tipos diferentes de complexos DNA-ligados que podem ser distinguidos baseados em seus tamanhos diferentes.

Os complexos de classe um são consistentes apenas com o cofator ativador de helicase p44, os complexos de classe dois consistem apenas na proteína XPD e os complexos de classe três consistem em XPD e p44, pois o reconhecimento de legião por XPD requer a ativação de sua atividade helicase por p44, e apenas os complexos de classe três mostram reconhecimento de lesão. A fim de identificar diferentes estratégias de reconhecimento de lesões, as localizações das proteínas nos substratos de DNA foram medidas para carga de proteínas em uma bolha de DNA nas cinco ou três direções principais de uma lesão de DNA mostrada em vermelho para NER helicases procarióticas e eucarióticas. Nas distribuições de posição da proteína, o reconhecimento da lesão de DNA pode ser visto como um pico devido ao aumento da ligação na posição da lesão de DNA.

O procariótico NER helicase UVRB e sua contraparte eucariótica, XPD, mostram diferentes estratégias de reconhecimento de lesões de CPD que indicam diferentes preferências de fita de DNA. Especificamente, as lesões de CPD são reconhecidas na fita translocada por UVRB, mas preferencialmente na fita oposta, não translocada por XPD. Uma vez dominado, esse método pode ser feito em algumas horas ou dias, incluindo análise.

É importante trabalhar com amostras altamente puras da proteína e do ADN para poder interpretar as características nas imagens do AFM e projetar com cuidado a carcaça do ADN segundo o sistema biológico e na pergunta que você quer endereçar. Além disso, os métodos de conjunto, como espaço de eletroforese em gel, deslocamento de eletromobilidade ou ensaios de incisão de DNA são, é claro, altamente complementares a esses experimentos de AFM; e esses métodos podem ajudar a resolver questões adicionais, como afinidades de ligação ao DNA ou atividades de excisão de lesões de DNA. Essa técnica é uma abordagem relativamente rápida e simples para visualizar diretamente os complexos de DNA de proteínas, e esses complexos nos dão uma boa imagem dos processos que ocorrem em um sistema biológico.

Claro, isso não é apenas útil para entender os processos de reparo do DNA, mas também pode ser aplicado a outros sistemas de DNA de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como preparar uma amostra em seu sistema de DNA de proteína favorito, como obter imagens por AFM e de como extrair parâmetros úteis para uma interpretação de seus dados.