Name: Investigações por microscopia de força atômica para o reconhecimento de lesões de DNA no reparo por excisão de nucleotídeos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a usar microscopia de força atômica para investigar o reconhecimento de lesões de DNA no reparo por excisão de nucleotídeos. Este método permite visualizar interações proteína-DNA em nível molecular.

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PUC19N, oligonucleótidos contendo CPD e p44 foram gentilmente fornecidos por Samuel Wilson, Korbinian Heil e Thomas Carell, e Gudrun Michels e Caroline Kisker, respectivamente. Este trabalho foi apoiado por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 e TE-671/4 para TI.

<ol><li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machines+of+DNA+repair%3A+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li>
<li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li>
<li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li>
<li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li>
<li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li>
<li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li>
<li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li>
<li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li>
<li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625(2015).</li>
<li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).</li>
<li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+UvrB%2C+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li>
<li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+TFIIH%2C+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA%2C+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li>
<li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li>
<li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li>
<li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules%3A+MutS-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li>
<li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product%2C+UvrB%2A+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UvrB+domain+4%2C+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li>
<li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li>
<li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li>
<li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As análises estatísticas de AFM de posições de ligação de proteínas em fragmentos de ADN longos que contêm locais alvo específicos podem revelar detalhes interessantes sobre as estratégias particulares utilizadas pela proteína para reconhecer estes sítios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Para interpretar as distribuições de posição resultantes, as posições dos alvos no DN...

A microscopia de força atômica (AFM) é uma poderosa técnica para a análise das interações proteína-DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Requer apenas baixas quantidades de material de amostra para visualizar diretamente amostras heterogêneas com uma resolução no nível de molécula única. A heterogeneidade pode resultar de diferentes estados conformacionais ou oligoméricos de uma proteína. Em particular, no contexto de amostras de proteína-ADN, os complexos de proteínas podem exibir estequiometrias e / ou conformações diferentes induzidas por ligação ao ADN em geral ou ligação a um local alvo específico dentro do ADN. As amostras heterogéneas também podem conter dois (ou mais) tipos diferentes de proteínas e diferentes complexos de proteínas( Por exemplo , consistindo de apenas um tipo de proteína versus complexos heteroméricos) podem interagir de forma diferente com o DNA. Os estudos aqui discutidos exploram imagens AFM no ar em amostras estáticas e secas de proteínas de reparo de DNA ligadas a fragmentos de DNA longos (~ 900 pares de bases, bp) que contêm uma lesão, o que representa um alvo dessas proteínas. A alta resolução molecular do AFM permite a distinção entre diferentes tipos de complexos protéicos e determinar as posições de ligação das proteínas nos fragmentos de DNA. É importante notar que as lesões são introduzidas nos substratos de ADN em posições bem definidas. Uma vez que a posição do local da lesão no DNA é conhecida, as distribuições de proteínas ligadas ao DNA proporcionam uma visão das propriedades (diferentes) de reconhecimento de lesões dos complexos de proteínas (diferentes), por exemplo , como reconhecem um tipo particular de lesão A ADN não danificado) 2 , 3 , <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 4 , 5 , 6 . Suas posições no DNA também permitem a distinção entre complexos de proteínas ligados especificamente às lesões e complexos ligados inespecificamente em qualquer outra parte do DNA. A caracterização separada destes diferentes tipos complexos (complexos ligados especificamente à lesão versus complexos não específicos) pode revelar alterações conformacionais potenciais nos complexos induzidas na identificação do local alvo. As proteínas de reparo do DNA focadas aqui são helicases que são responsáveis ​​pelo reconhecimento de lesão na via de reparo de excisão de nucleotídeos (NER). Em bactérias, o NER é conseguido pelas proteínas UvrA, UvrB e UvrC. UvrA é responsável pela detecção inicial de lesões num complexo de varrimento de ADN UvaA 2 / UvrB 2 . Após a verificação da lesão por UvrB, este complexo converte-se em UvrB monomérico ligado no local da lesão e este complexo específico pode então recrutar o pEndonuclease NER de rokaryotic UvrC. A UvrC excisa um segmento curto (12-13 nt) de ADN de cadeia simples (ssDNA) contendo a lesão. O estiramento em falta é então reenchido pela ADN polimerase. Finalmente, a ADN ligase sela o estiramento recentemente sintetizado com o DNA original 9 , 10 . Em eucariotas, a maioria das proteínas da cascata NER são parte do grande complexo de transcrição do complexo II H (TFIIH). Após detecção de lesão inicial através do complexo trimérico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH é recrutado para o local alvo de ADN. Quando XPD dentro do complexo verifica a presença de uma lesão alvo NER, as endonucleases EER eucarióticas XPG e XPF são recrutadas para excisar um trecho curto (24-32 nt) de ssDNA contendo a lesão 9,10 . Aqui, especificamente, foram estudadas as helicases UvrB e XPD de NER procariótico e eucariótico, respectivamente. Estas helicases requerem uma região nãoDNA (uma bolha de ADN) para enfiar numa das duas cadeias simples de ADN e subsequentemente translocar ao longo desta cadeia alimentada por hidrólise de ATP. Além das lesões de DNA, foi introduzida uma bolha de ADN nos substratos que funciona como local de carga para as proteínas. O procedimento para a preparação de substratos específicos de DNA de lesão já foi descrito anteriormente 11 . Requer uma construção de ADN circular (plasmídeo) com dois locais de restrição estreitamente espaçados para uma nickase. No contexto deste estudo, utilizou-se o plasmídeo pUC19N (2729 pb) (criado pelo laboratório de S. Wilson, NIEHS). Este plasmï¿½eo contï¿½ trï¿½ locais de restriï¿½o espaï¿½dos para a nickase Nt.BstNBI que enquadram um alongamento de 48 nucleï¿½idos (nt). Após incubação com a nquase, o trecho de ssDNA entre estes locais pode ser removido e substituído por um oligonucleótido contendo qualquer característica alvo. Após cada passo, a digestão enzimática completa é testada através de gel de agaroseEletroforese. O ADN circundado circular pode ser distinguido devido à sua mobilidade electroforética inferior em comparação com o plasmídeo super-enrolado original. A separação do ADN e a substituição do estiramento removido pelo oligonucleótido de substrato específico podem ser avaliadas através de digestão com uma enzima de restrição que incisa o substrato exclusivamente dentro da região entre os entalhes. A linearização do plasmídeo circular pela enzima será assim suprimida para o ADN gapped e restaurada após a inserção do oligonucleótido específico. Finalmente, dois locais de restrição de endonuclease (idealmente cortadores únicos) permitem a geração de um substrato de ADN linear, com o comprimento desejado e com o local alvo específico numa posição definida assim como uma bolha de ADN a uma distância da lesão, quer em 5 &#39;Ou 3&#39;. O reconhecimento das lesões pelas helicases NER pode ser investigado através de imagens AFM. A translocação de ADN bloqueado das helicases em tO local da lesão é visível como um pico na distribuição da posição da proteína no DNA e indica o reconhecimento da lesão. Uma vez que a translocação do ADN destas helicases é ainda direccional, com uma polaridade de 5 &#39;a 3&#39;, a dependência do reconhecimento da lesão na posição do local de carga (bolha de ADN a montante ou a jusante da lesão) também indica se a lesão é preferencialmente reconhecida Na cadeia de ssDNA não translocada ou no lado oposto, não translocada 5 , 9 . Nas seções a seguir, os métodos utilizados serão introduzidos e os principais achados dessas experiências serão brevemente discutidos. Importante, analogamente ao trabalho exemplar sobre o reparo de DNA mostrado aqui, a imagiologia AFM pode ser aplicada ao estudo de diferentes sistemas de interação de DNA, tais como replicação ou transcrição de DNA 8 , 12 , 13 , 14 </Sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>Sonda de Força Molecular (MFP)</td><td>3D Asylum Research</td><td>N/A</td><td>microscópio de força atômica (AFM)</td></tr><tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>N/A</td><td>computador</td></tr><tr><td>ThermoMixer e bloco de 1,5 mL</td> Bloco de calor <td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Rotilabo Block-Heater H 250 & blocos para tubos de 0,5 mL</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Y264.1 & Bloco de calor Y267.1</td><td>para incubações de proteína-DNA</td></tr><tr><td>Mini-Subcélula GT</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>Câmara de</td><td>eletroforese 1704467 com rodízio de gel e fonte de alimentação</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>Fonte de</td><td>alimentação de eletroforese</td>1645050</tr><tr><td>Centifuge 5415 D com rotor</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td><td>centrífuga de mesa</td></tr><tr><td>Ultra-Lum UV eletrônico transilhonador MEB-15</td><td>Ultralum</td><td>900-1322-02</td><td>Mesa de irradiação UV</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N/A</td><td>UV espectrofotômetro</td></tr><tr><td>TKAX-CAD com 0,2 &mu; m filtro de cápsula</td><td>Unity Lab Services</td><td>N / A</td><td>unidade de deionização e filtro de água</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MFP software em Igor Pro</td><td>Asylum Research</td><td>N / A</td><td>AFM software</td></tr><tr><td>ImageJ (processamento de imagens Java de código aberto)</td><td>NIH Image</td><td>N/A</td><td>Software de análise de imagem</td></tr><tr><td>Excel (Microsoft Office)</td><td>Microsoft Corporation</td><td>N/A</td><td>software de análise de dados</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab Corporation</td><td>N/A</td><td>software de análise de dados estatísticos e gráficos</td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMCL-AC240TS</td><td>Olympus</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>AFM cantilevers</td></tr><tr><td>grau V-5 moscovita</td><td>SPI Supplies</td><td>1805</td><td>folhas de mica</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL 50k Ultracell</td><td>Millipore Ireland Ltd.</td><td>UFC505096</td><td>filtros de centrífuga</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extract II&nbsp;</td><td>&nbsp; Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>Kit de extração de gel de agarose</td></tr><tr><td>Papel de celulose Rotilabo tipo 111A</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AP59.1</td><td>Papel mata-borrão de deposição</td></tr><tr><td>AFM Anatop 25 (0,02 &mu; m)</td> <td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td><td>filtro de seringa</td></tr><tr><td>SSpI, BspQI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td> <td>R0132, R0712</td><td>enzimas de restrição para preparação de substrato de DNA</td></tr><tr><td>XhoI, BglII</td><td></td><td>R0146, R0144</td><td>enzimas de restrição para preparação de DNA</td></tr><tr><td>controla a enzima de restrição de corte Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td> <td>R0607</td><td>nickase</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0202S</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>Tris, HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855, 9105</td><td>produtos químicos tampão</td></tr><tr><td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957, HN03, HN02, P026</td><td>produtos químicos de sal</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>produtos químicos de sal</td></tr><tr><td>DTT, TCEP, EDTA</td><td></td><td>6908, HN95, 8040</td><td>produtos químicos/ reagentes</td></tr><tr><td>agarose, ácido acético, HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2267, 3738, K025</td><td>reagentes</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K054</td><td>nucleotídeos</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo #1 na Tabela 1</td><td>Biômeros</td><td></td><td>oligonucleotídeos de DNA complementares personalizados oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>#2, #3 e #6 na Tabela 1</td><td>Tecnologias de DNA Integradas (IDT)</td><td></td><td>fluoresceína personalizada contendo oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>oligonucleotídeos #4&nbsp; e #5 na Tabela 1</td><td>privado (disponível em, por exemplo, TriLink ou GlenResearch)</td><td></td><td>CPD contendo oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>Tubo de reação SafeSeal 0,5 mL e 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.704 e 72.706</td><td>tubos de incubação</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>6x concentrado gel carregamento corante roxo</td><td>Novo England Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>Corante de carregamento de DNA</td></tr><tr><td>Midori Green&nbsp;</td><td>Nippon Genetics Europe GmbH</td><td>999MG28055</td><td>Coloração de DNA</td></tr></tbody></table>

microscopia de força atômica investigações do reconhecimento de lesão de dna no reparo de excisão de nucleótidos

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

A imagem de imagem do AFM é uma técnica poderosa para o estudo de interações do proteína-ADN. Este método de molécula única permite a resolução simultânea de diferentes moléculas e conjuntos moleculares em uma amostra heterogênea. No contexto particular dos sistemas de proteínas que interagem com o DNA, diferentes formas de complexos proteicos e suas posições de ligação correspondentes em locais-alvo contendo fragmentos de DNA podem ser distinguidas. Aqui, é apresentada uma aplicação do AFM ao estudo do reconhecimento de lesões de DNA nos sistemas de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos procarióticos e eucarióticos (NER). Os procedimentos de preparação de amostras de DNA e proteínas são descritos e detalhes experimentais e analíticos dos experimentos são fornecidos. Os dados permitem conclusões importantes sobre as estratégias pelas quais a verificação do local-alvo pode ser alcançada pelas proteínas NER. Curiosamente, eles indicam diferentes abordagens de reconhecimento e identificação de lesões para o sistema NER eucariótico, dependendo do tipo de lesão. Além disso, propriedades estruturais distintas das duas diferentes helicases envolvidas no NER procariótico e eucariótico resultam e explicam as diferentes estratégias observadas para esses dois sistemas. É importante ressaltar que essas abordagens experimentais e analíticas podem ser aplicadas não apenas ao estudo do reparo do DNA, mas também de forma muito semelhante a outros sistemas de proteínas que interagem com o DNA, como aqueles envolvidos nos processos de replicação ou transcrição.

Distinguir entre diferentes tipos complexos baseados em volumes complexos de proteínas A actividade de helicase da NER helicase UvrB procariótica é estimulada pela ligação ao ADN 22 , 23 . UvrB requer uma região não emparelhada no ADN (uma bolha de ADN) de modo a carregar correctamente numa das duas cadeias simples de ADNcs. In vivo , esta estrutura de ADN é prop...

Aqui, o estudo de diferentes abordagens de reconhecimento de lesões de DNA por meio de imagens AFM de molécula única é demonstrado com o sistema de reparo por excisão de nucleotídeos como exemplo. Os procedimentos de preparações de amostras de DNA e proteína e detalhes experimentais, bem como analíticos para os experimentos de AFM são descritos.

Microscopia de Força Atômica Investigações do Reconhecimento de Lesão de DNA no Reparo de Excisão de Nucleótidos

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

O objetivo geral deste experimento de microscopia de força atômica é resolver as interações das proteínas de reparo do DNA com locais de dano no DNA e distinguir entre diferentes interações de DNA por vários complexos de proteínas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de reparo do DNA, como como um determinado sistema de reparo do DNA alcança o reconhecimento de suas lesões-alvo no DNA. A principal vantagem dessa técnica é que podemos ver e analisar diretamente os diferentes tipos de complexos envolvidos no processo de reconhecimento de lesões de DNA.Demonstrando o procedimento estará Nicolas Wirth, que usou essa abordagem durante sua pesquisa de bacharelado. Para começar, prepare um substrato de DNA adequado gerando uma lacuna de DNA de fita simples em um plasmídeo. Preencha a lacuna com oligonucleotídeos de DNA de fita simples modificados e, finalmente, linearize o DNA plasmático usando enzimas de restrição apropriadas.Para esses experimentos, os substratos de DNA de fita dupla têm cerca de 1.000 pares de bases de comprimento e contêm uma lesão de DNA, bem como uma região não emparelhada chamada bolha de DNA para carregamento de proteínas no DNA. Em seguida, prepare uma amostra de DNA de proteína para análise de AFM, pipetando primeiro o tampão de reação 10x e a água em um tubo de microrreação. Em seguida, adicione o DNA e as proteínas sob investigação.Por exemplo, aqui, 100 nanomolares da amostra de DNA e um micromolar ou cada uma das proteínas de reparo de excisão de nucleotídeos eucarióticos XPD e p44. Em seguida, incube a reação por 30 minutos a 37 graus Celsius em um bloco de calor. Após a incubação, gire brevemente a amostra.Em seguida, prepare um substrato de mica para colocar a amostra. Use um bisturi para cortar um pedaço de mica de um centímetro por um centímetro de uma tira maior. Em seguida, use um pedaço de fita adesiva para remover as camadas superiores da mica para revelar uma superfície de substrato limpa, plana e anatomicamente lisa.Dilate a amostra de DNA de proteína cinquenta a cem vezes em tampão de deposição AFM e deposite imediatamente 20 microlitros da amostra diluída na superfície da mica. O fator de diluição depende da concentração da amostra. Imediatamente após depositar a amostra na superfície da mica, enxágue a amostra três a quatro vezes com alguns mililitros de água filtrada e deionizada e seque o excesso de líquido.Use um jato suave de nitrogênio para secar a amostra. Por fim, use fita adesiva para fixar a amostra em suas bordas em uma lâmina de microscópio. Coloque a amostra no meio da platina do AFM e use almofadas magnéticas para fixar a lâmina do microscópio na platina.Em seguida, insira a ponta do AFM no suporte da ponta. Fixe a ponta no suporte sob um grampo apertando o parafuso para que fique apertado com os dedos. Uma vez fixado, insira o suporte da ponta no cabeçote de medição do AFM.Use os parafusos de posicionamento para mover a amostra em uma posição central. Coloque a cabeça de medição AFM em cima da amostra, certificando-se de que a cabeça esteja estável com as pernas dentro das reentrâncias do palco. Em seguida, alinhe o laser AFM na parte de trás do cantilever para obter a força do sinal ideal.Observe o sinal de reflexão na janela de vídeo do AFM para posicionar grosseiramente o laser. Para este modelo do AFM, gire as rodas do lado direito e da parte traseira da cabeça da medida do AFM para ajustar as posições de X e de Y do laser do AFM a fim dirigi-lo centralmente na extremidade do cantilever. Em seguida, otimize o sinal de soma do detector ajustando a posição do laser com as duas rodas.Direcione a reflexão do laser do AFM no centro do detector zerando o sinal diferente dos diodos da parte superior e da parte inferior da disposição do detector. Para esta etapa, gire o parafuso no lado esquerdo da cabeça de medição para este modelo AFM. Em seguida, determine a frequência de residência do cantilever acessando a janela de sintonia do painel mestre no software.Escolha uma amplitude correspondente a uma entrada de um volt para o Piezo que aciona a oscilação do cantilever e, em seguida, defina a frequência de oscilação para 5% negativos, ligeiramente abaixo da frequência de residência. Agora execute um ajuste automático de frequência e zere a fase da oscilação. Deixe o sistema atingir o equilíbrio térmico por cerca de uma hora antes de iniciar a geração de imagens, a fim de evitar desvios.Quando estiver pronto para iniciar a geração de imagens, no painel principal do software, defina um ponto de ajuste de proteção e prepare-se para aproximar a ponta da superfície da amostra selecionando engatar. Abaixe a roda dianteira da cabeça do AFM manualmente até que a configuração de proteção, ou ponto de ajuste, seja alcançada. Em seguida, abaixe cuidadosamente a roda dianteira até que o sinal do sensor Z esteja totalmente estendido para a esquerda.Ative a mesa de oscilação de vibração e feche o invólucro de isolamento acústico. Em seguida, abaixe o ponto de ajuste no software AFM usando a roda de hamster para engatar a ponta do AFM com a amostra. Para realizar imagens no modo de derivação no regime repulsivo, abaixe o ponto de ajuste até que o sinal de fase se torne ligeiramente menor do que a fase de nível livre.Em seguida, comece a escanear a amostra. Use a velocidade de varredura de 2,5 micrômetros por segundo em áreas de superfície de imagem de quatro micrômetros por quatro micrômetros ou oito micrômetros por oito micrômetros quadrados com resoluções de pixels de 2.048 ou 4.096, respectivamente; e pressione o botão Do Scan. Pré-selecione complexos de DNA de proteína relevantes por inspeção visual direta das imagens no software AFM.Para amostras XPD, possíveis complexos incluem DNA XPD p44, bem como DNA XPD e DNA p44 com tamanhos distintamente diferentes devido às diferentes massas moleculares de XPD e p44. Meça os volumes de picos de proteínas individuais no DNA usando a ferramenta de seção na janela de análise para medir a altura e o diâmetro das seções de pico de proteína com os cursores da janela de seção. Use esses valores para determinar o volume dos picos usando modelos matemáticos simples para verificar o tipo complexo.Finalmente, calibre seu sistema do AFM com uma escala das proteínas com pesos moleculares conhecidos para traduzir estes volumes em pesos moleculares aproximados das proteínas e dos complexos da proteína. Para determinar características adicionais, como comprimentos de fragmentos de DNA, as posições dos complexos de proteínas no DNA e suas especificidades do local-alvo ou ângulos de banda de DNA, consulte o protocolo de texto anexo. Mostrada aqui é uma imagem do AFM com os três tipos diferentes de complexos DNA-ligados que podem ser distinguidos baseados em seus tamanhos diferentes.Os complexos de classe um são consistentes apenas com o cofator ativador de helicase p44, os complexos de classe dois consistem apenas na proteína XPD e os complexos de classe três consistem em XPD e p44, pois o reconhecimento de legião por XPD requer a ativação de sua atividade helicase por p44, e apenas os complexos de classe três mostram reconhecimento de lesão. A fim de identificar diferentes estratégias de reconhecimento de lesões, as localizações das proteínas nos substratos de DNA foram medidas para carga de proteínas em uma bolha de DNA nas cinco ou três direções principais de uma lesão de DNA mostrada em vermelho para NER helicases procarióticas e eucarióticas. Nas distribuições de posição da proteína, o reconhecimento da lesão de DNA pode ser visto como um pico devido ao aumento da ligação na posição da lesão de DNA.O procariótico NER helicase UVRB e sua contraparte eucariótica, XPD, mostram diferentes estratégias de reconhecimento de lesões de CPD que indicam diferentes preferências de fita de DNA. Especificamente, as lesões de CPD são reconhecidas na fita translocada por UVRB, mas preferencialmente na fita oposta, não translocada por XPD. Uma vez dominado, esse método pode ser feito em algumas horas ou dias, incluindo análise.É importante trabalhar com amostras altamente puras da proteína e do ADN para poder interpretar as características nas imagens do AFM e projetar com cuidado a carcaça do ADN segundo o sistema biológico e na pergunta que você quer endereçar. Além disso, os métodos de conjunto, como espaço de eletroforese em gel, deslocamento de eletromobilidade ou ensaios de incisão de DNA são, é claro, altamente complementares a esses experimentos de AFM; e esses métodos podem ajudar a resolver questões adicionais, como afinidades de ligação ao DNA ou atividades de excisão de lesões de DNA. Essa técnica é uma abordagem relativamente rápida e simples para visualizar diretamente os complexos de DNA de proteínas, e esses complexos nos dão uma boa imagem dos processos que ocorrem em um sistema biológico.Claro, isso não é apenas útil para entender os processos de reparo do DNA, mas também pode ser aplicado a outros sistemas de DNA de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como preparar uma amostra em seu sistema de DNA de proteína favorito, como obter imagens por AFM e de como extrair parâmetros úteis para uma interpretação de seus dados.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Neste vídeo, descrevemos o método de imunofluorescência para visualizar a localização das proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 nos locais de quebras de DNA de fita dupla em núcleos de células irradiadas.

Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.

Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Este protocolo descreve um método não invasivo para identificar eficientemente células da fase S para estudos de microscopia a jusante, como medir o recrutamento de proteínas de reparação de DNA por micro-irradiação a laser.

Micro-irradiação a laser para estudar recrutamento de DNA durante a fase S

Este trabalho apresenta um método simples e visual para detectar polimorfismos multi-nucleotídeos em uma plataforma de manipulação gota pneumático. Com o método proposto, toda a experiência, incluindo gota de manipulação e de detecção de polimorfismos de vários nucleótidos, pode ser realizada próximo de 23 ° C, sem o auxílio de instrumentos avançados.

A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota

Aprenda a usar microscopia de força atômica para investigar o reconhecimento de lesões de DNA no reparo por excisão de nucleotídeos. Este método permite visualizar interações proteína-DNA em nível molecular.

Microscopia de Força Atômica Investigações do Reconhecimento de Lesão de DNA no Reparo de Excisão de Nucleótidos

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