Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de In Vitro culturas de células

O objetivo deste procedimento é determinar a atividade do citocromo P450s, ou CYPs, em células cultivadas. Os CYPs são enzimas-chave envolvidas no metabolismo de medicamentos e tóxicos e sua expressão não é frequentemente retida in vitro. A expressão normal das enzimas CYP é frequentemente perdida quando as células são cultivadas in vitro.

Portanto, muitos modelos in vitro são potencialmente limitantes para a compreensão do metabolismo de medicamentos e tóxicos. A principal vantagem deste método é sua simplicidade ao avaliar a atividade do CYP em células cultivadas. Usando substratos e inibidores de sonda, diferentes plataformas de quantificação são apresentadas, incluindo espectrometria de massa.

Para começar, obtenha frascos criogênicos com células conforme descrito no protocolo de texto. O protocolo fornecido usa uma linha de células hepáticas como exemplo. Enquanto trabalha em condições estéreis, abra cuidadosamente o frasco criogênico para liberar qualquer excesso de pressão e, em seguida, pipete o conteúdo do frasco criogênico em um tubo de 10 mililitros cheio de nove mililitros de meio Williams'E pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Centrifugue a solução por 10 minutos a 400 vezes g à temperatura ambiente. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em cinco mililitros de meio de descongelamento proprietário, pré-aquecido a 37 graus Celsius e suplementado com glutamina. Depois de contar as células viáveis conforme descrito no protocolo de texto, semeie as células em uma placa revestida de colágeno de 24 poços a uma densidade de 60.000 células viáveis por poço e um volume final de 0,5 mililitros de meio de descongelamento.

Após alguns dias em cultura, as células formam uma estrutura trabecular subconfluente. A atividade metabólica ideal é normalmente observada entre os dias sete e 10 e é mais baixa no quarto dia. Para preparar as culturas diferenciadas de epitélio das vias aéreas, use epitélio primário das vias aéreas totalmente diferenciado disponível comercialmente que tenha sido cultivado na interface ar-líquido em uma inserção.

Usando uma pinça estéril, desaloje suavemente o inserto celular da matriz de agarose e transfira-o para a nova placa pré-carregada com 700 microlitros de meio de cultura proprietário. Avalie a integridade do tecido das vias aéreas usando métodos referenciados no protocolo de texto, como resistência transepitelial ou frequência de batimentos de cílios. Antes da experiência, preparar duas séries de inserções celulares para as células das vias respiratórias e poços para as células hepáticas com um mínimo de três repetições.

Utilizar uma série para a experiência de inibição e a outra apenas para a sonda metabólica. Prepare uma terceira série de células como um controle em branco de mídia. No dia do experimento, substitua o meio de cultura celular por 450 microlitros de meio fresco.

Adicione 50 microlitros de meio contendo o inibidor 10x CYP à série de células preparadas para o experimento de inibição e pré-incube por 30 minutos. Em seguida, substitua o meio da série de inibição por 450 microlitros de meio fresco e adicione 50 microlitros de meio contendo o inibidor de CYP 10x e o substrato de sonda 10x. Adicione 50 microlitros de meio com o substrato da sonda 10x às outras células e, em seguida, adicione uma quantidade equivalente de veículo diluído em meio aos controles de células em branco.

Depois de incubar as células por zero a cinco minutos para o ponto de tempo um, controle de fundo zero, colete o meio em tubos marcados separados e congele o meio para processamento futuro. Em seguida, incube o ponto de tempo duas células por 16 horas na incubadora de células. No final do período de incubação, recolher o meio utilizando o mesmo método de quantificação do produto metabólico.

Transfira 250 microlitros de meio de incubação para um microtubo de 1,5 mililitro e adicione a solução de estoque de padrão interno de 4-metilumbeliferona para atingir uma concentração final de 100 nanomolares. Ajuste o pH do meio entre 4,5 e 5,0 adicionando um HCl molar, um microlitro de cada vez. Verifique o pH pipetando de dois a 10 microlitros de meio em uma tira de pH e, em seguida, adicione 150 unidades de betaglucuronidase arilsulfatase de Helix pamatia.

Depois de incubar por uma hora a 37 graus Celsius, pare a reação adicionando 250 microlitros de metanol frio. Evaporar o solvente usando uma centrífuga a vácuo a 45 graus Celsius. Reconstituir as amostras com 500 microlitros de uma solução de acetonitrila a 30% para água.

Para realizar a quantificação baseada em espectrometria de massa, adicione 250 microlitros de cada padrão de diluição serial a um frasco de vidro de cromatografia líquida âmbar de ultra desempenho para injeção no amostrador automático UPLC-MS. Adicione também as amostras de teste aos frascos de UPLC âmbar e coloque-as no amostrador automático UPLC. Depois de randomizar todos os frascos, execute o UPLC-MS usando as configurações detalhadas no protocolo de texto, dependendo da sonda específica a ser quantificada.

Use a ferramenta Quantificar, Construir Método de Quantificação nas ferramentas de quantificação do espectrômetro de massa para gerar a curva de calibração a partir do padrão sintético adquirido e do padrão interno e, em seguida, use o Assistente de Quantificação para selecionar o lote de amostra e as amostras para quantificar e executar o método de quantificação. Para induzir o CYP1A1, CYP1B1, use o layout da placa encontrado no protocolo de texto. Incubar as células designadas para indução com uma concentração final de 10 nanomolares TCDD em meio por um período de 72 horas.

Após este período, remova o meio, enxágue os poços com PBS três vezes e adicione um pouco de meio fresco. Antes de incubar as células com a sonda repórter luminogênica, pré-incube o subconjunto designado de células induzidas por 30 minutos com o inibidor do CYP1A1, CYP1B1 em meio. Adicionar o propbe luminogénico, éter cloroetílico de luciferina 6', a uma concentração final de 50 micromolares, às células inibidoras não induzidas, induzidas e induzidas.

Incube por quatro horas e, em seguida, transfira 25 microlitros de meio de cultura para uma placa branca e opaca de 96 poços e adicione 25 microlitros de reagente de detecção de luciferina fornecido pelo fabricante. Depois de incubar por 20 minutos em temperatura ambiente, leia a placa imediatamente usando um luminômetro. A luminescência relativa produzida pela desalquilação do éter cloroetílico da luciferina 6', que é catalisada pelo CYP1A1, CYP1B1, é apresentada aqui.

O exemplo não mostra atividade enzimática na ausência de indução de TCDD. Após a indução de TCDD, a atividade do CYP1A1, CYP1B1 é observada nos tipos de células hepáticas e respiratórias. Finalmente, a adição do inibidor do CYP1A1, alfa-naftoflavona do CYP1B1, reduz ou elimina a atividade do CYP.

Para avaliar a atividade do CYP2A6, 2A13 em tipos de células hepáticas e das vias aéreas, a quantidade de 7-hidroxicumarina produzida por hidroxilação da cumarina pela enzima foi medida usando UPLC LC-MS. Em zero minutos de incubação com cumarina, apenas o fundo é detectado. Após 16 horas, observa-se hidroxilação da cumarina com a formação de 7-hidroxicumarina nos dois tipos celulares.

Finalmente, a adição do inibidor do CYP2A, 2A13 previne a formação de 7-hidroxicumarina. Uma vez dominada, as partes de incubação e quantificação da sonda dessa técnica podem ser feitas em algumas horas a até um dia na maioria dos casos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar vários ensaios de metabolismo de fase um usando diferentes tipos de células, confirmando a especificidade da enzima usando inibição e/ou indução conforme necessário.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que diferentes tipos de células podem exigir tempos de incubação mais longos e é essencial incluir um tipo de célula que possa ser usado como controle positivo. Não se esqueça de que trabalhar com TCDD pode ser extremamente perigoso, e precauções, como equipamento de proteção individual completo, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento. As implicações desta técnica estendem-se à utilização de modelos in vitro adequados para a avaliação pré-clínica de novos medicamentos e para as avaliações de risco de produtos químicos e ingredientes utilizados em produtos de consumo.