Name: Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de In Vitro culturas de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a avaliar a atividade das enzimas CYP em culturas celulares usando espectrometria de massa e sondas luminogênicas. Este método simples melhora a relevância dos modelos in vitro para estudos de metabolismo de fármacos.

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Os autores agradecem à Epithelix Sarl e à Biopredic International por fornecerem as micrografias das células das vias aéreas e das células hepáticas e a Neil Smith pela figura que ilustra o procedimento experimental.

<ol><li>Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Canton%2C+C+%22Encyclopedia+of+Drug+Metabolism+and+Interactions%22">Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions</a>. , 1-31 (2016).</li>
<li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li>
<li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((57+varieties%3A+the+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li>
<li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+drug+metabolizing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pap.+Med.+Fac.+Univ+Palacky%22%5BJournal%5D)">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).</li>
<li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li>
<li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li>
<li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+hepatoma+HepaRG+cells%3A+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Interact%22%5BJournal%5D)">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li>
<li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+%28MucilAir%29+to+assess+respiratory+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li>
<li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li>
<li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li>
<li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism%3A+substrates+and+inhibitors+in+vitro%2C+in+vivo+and+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li>
<li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Dispos%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li>
<li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Mol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li>
<li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism%3A+a+clinical+probe+for+P450+2E1%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li>
<li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver%2C+Helix+pomatia%2C+and+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li>
<li>Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf">http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf</a> (2013).</li>
<li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+omics+analyses%2C+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25947886">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li>
</ol>

AB e EM eram empregados da British American Tobacco no momento que este manuscrito foi escrito. O trabalho descrito neste manuscrito foi financiado pela British American Tobacco, e taxas de publicação do video-artigo foram pagos pela British American Tobacco.

Actualmente, muitos sistemas de testes toxicológicos padronizados utilizar bactérias Engineered, linhas celulares, ou células embrionárias, que não são representativos do metabolismo humano normal 1. Isso pode levar a previsões imprecisas do potencial actividade tóxicos de uma substância química ou medicina. Inovador em modelos in vitro, como culturas de células de órgãos e 3D sobre um chip, estão a ser desenvolvidos na tentativa de melhor replicar a morfologia normal e a actividade metabólica dos tecidos humanos 21, 22, 23. competência metabólica é um critério que pode ser usado para decifrar quais modelos são mais adequados para estudos de avaliação e de biotransformação de drogas toxicológicos. O protocolo temos descrito neste documento destina-se a medir a actividade de enzimas CYP, utilizando células vivas. É flexível e pode ser usado para diferentes sistemas de células em 2D ou 3D cultures e oferece a opção de usar um probe- luminogenic ou uma abordagem baseada em espectrometria de massa. Ambos os métodos são suficientemente sensível para detectar quantidades de nanogramas de materiais e requerem apenas um pequeno número de células cultivadas em um formato com múltiplas cavidades. Eles também podem ser aplicados a esferóides ou células cultivadas em matrizes complexas. A selecção do substrato de sonda é, obviamente, um elemento crítico do protocolo. A especificidade do ensaio baseia-se na sonda a ser selectiva da enzima CYP e uma outra camada de garantia pode ser obtida pela utilização de um inibidor de CYP selectiva. Os substratos e inibidores enumerados no presente documento são apenas alguns exemplos, mas outros podem ser encontrados na literatura. É importante considerar vários tempos de incubação quando se trabalha com um novo tipo de célula como um resultado negativo da actividade de CYP pode ser devido à enzima ser expressa num nível baixo. A adição de um tipo de célula que pode ser usada como um controlo positivo é aconselhável assegurar que umresultado negativo não está ligada a um problema técnico e para ajudar com qualquer solução de problemas. células hepáticas primárias são metabolicamente competente e pode ser usado como controle, para hepatócitos primários exemplo em suspensão são muito fáceis de usar, mas a sua viabilidade é limitada no tempo. Linhas de células hepáticas são possíveis alternativas, que são relativamente fáceis de utilizar, conforme descrito no presente protocolo, mas algumas são melhores do que outros em termos de actividade metabólica 6, 21. Uma vez que o ensaio não é destrutivo, a menos que a proteína total é quantificado, é possível seguir a actividade de CYP ao longo do tempo em estudos longitudinais 20. Este é um ponto importante porque algumas células terão actividade CYP variável ao longo do tempo na cultura. Um resultado negativo pode ser associada com a falta de confluência, com o progresso ou a diferenciação in vitro de desdiferenciação. Nesse caso, a abordagem é semi-quantitative uma vez que os dados não é normalizada pela quantidade total de proteína em cada cultura de células. Não é sempre possível ou recomendado para reutilizar o tecido depois de medir a actividade de CYP como exposição a sondas, inibidores ou indutores pode ter um efeito tóxico sobre o tecido, como é o caso para TCDD. fracções de células, tais como microssomas, também poderia ser usado para caracterizar a actividade de CYP de um determinado tipo de célula. Microssomas preparações, no entanto, requerem uma grande quantidade de material celular, a adição de co-factores adequados e tampão para assegurar que as enzimas permanecer activo. Usando células vivas elimina a etapa de preparação microsome complicado e trabalhar fora que buffers e cofatores funcionar melhor. Como recomendação geral, é uma melhor prática para caracterizar ainda mais o perfil de CYP expressão em culturas de células para verificar se ele corresponde a actividade enzimática. Este nível adicional de verificação é recomendado, uma vez que as sondas metabólicas não são enticonfiar específico para um único CYP e proporciona maior confiança que a actividade metabólica medida é compensada pela expressão da enzima correspondente. Uma vez que os CYP são proteínas de membrana que são relativamente difíceis de preparar por western blots, portanto, RT-PCR quantitativo tem sido a abordagem preferida para estas enzimas perfil 20. É importante notar que este protocolo descreve um método para ensaio de actividade de enzima CYP que apenas representa uma família de enzimas metabólicas, embora importante. A flexibilidade de uma abordagem de espectrometria de massa permite que o desenvolvimento de métodos de aquisição para outras transformações metabólicas dos substratos de sonda. No entanto, aqueles têm de ser concebidos um de cada vez e não existem actualmente menos sondas específicas conhecidas e inibidores selectivos para outras famílias de enzimas metabólicas. Esta lacuna deve ser endereçada para permitir uma avaliação abrangente da competência metabólica em syste de células in vitroSenhora.

O metabolismo é o processo através do qual os produtos químicos estranhos ao corpo são modificados pela adição de grupos hidrofílicos e conjugados para facilitar a sua excreção 1. Tipicamente, o metabolismo de xenobiicos é um processo de dois passos com a Fase I que consiste principalmente de uma oxidação com a adição de um ou vários grupos hidroxilo, 1 2. Na Fase II, os grupos hidroxilo são utilizados como aceitantes para um conjugado hidrofílico tal como glucuronida ou um radical sulfato de 1, 2. Se um grupo aceitador já está presente nas moléculas, o passo de conjugação pode acontecer independentemente de Fase I metabolismo. Cada reacção é realizada por um grupo específico de enzimas, por exemplo, os CYP (citocromo P450), que catalisam a hidroxilação (Figura 1) e desalquilação de substratos químicos 3. Conjugation é catalisada por sulfotransferases, UDP-glucuronosiltransferases (Figura 1), glutationa-S-transferases e N-acetiltransferases 4. Cada tecido e órgão terá um perfil específico da expressão da enzima metabólica, com o fígado que expressam mais dessas proteínas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figura 1: Exemplo de Fase I e Fase II Metabolismo de cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalisar a 7-hidroxilação da cumarina. 7-hidroxicumarina é conjugado com uma porção glucuronido por enzimas de fase II UGTs, com UGT1A6 e UGT1A9 mostrando a actividade mais elevada. Compreendendo o metabolismo de xenobiicos é crítica na avaliação da segurança da droga e para a avaliação dos riscos químicos, por duas razões: a cinética da reacção irá determinar quanto tempo uma droga ou substância química permanecerá no corpo numa forma activa ou inactiva bntes de excreção; e o composto parental pode ser modificada para uma espécie mais reactiva, instável e tóxico por enzimas metabólicas. Tais reacções também conhecidos como &quot;bio-activação&quot; são principalmente conduzidos por enzimas CYP fase I mas também em raras ocasiões, de fase II conjugação 5. Com base nisso, a capacidade de um modelo in vitro para prever com precisão o risco associado com um fármaco ou um produto químico é altamente dependente da competência metabólica do sistema celular. As linhas celulares derivadas a partir de tecidos doentes ou de transformação de células normais, muitas vezes perdem parte se não todo o perfil representativo enzima metabólica do seu tecido de origem 6. A manutenção do perfil de enzima metabólica normal, parece ser melhor em culturas de células primárias (pelo menos em culturas de curto prazo) e é ainda melhorado se o tecido é cultivadas numa matriz que lhe permita reter a sua estrutura 3D 1. Portanto, o caracterecarac- da competência metabólica de um sistema de células in vitro é um passo preliminar importante na orientação a decisão sobre qual modelo de celular é apropriado para conduzir avaliações de segurança química. Neste trabalho foi realizado um protocolo ao perfil da actividade e expressão de enzimas de fase I de CYP in vitro com exemplos da sua aplicação com uma linha celular hepática 7 e 3D culturas de células de pulmão primário 8. CYP substratos específicos, os seus produtos metabólicos e inibidor controlos são descritos, juntamente com spectrometry- massa e métodos de quantificação baseado no luminogenic. Uma vez que alguns CYP são induzida e outros são constitutivas, também será dado exemplos para os dois cenários.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente & Células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; filtro de seringa</td><td>m Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbeliferona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-fenil pentina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hidroxibupropiona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hidroxiclorozoxazona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-etoxicumarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-hidroxicumarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-metoxipsoraleno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrila</td><td>Fisher</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-naftoflavona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-glucuronidase/arilsulfatase</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropiona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>clorzoxasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>colágeno</td><td>Cell Systems</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>cumarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>dissulfiram</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluvoxamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (suplemento de glutamina)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG suplemento de metabolismo</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG descongelamento suplemento de mídia</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferina-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher</td><td>M / 4056/17</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir células das vias aéreas</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir células das vias aéreas meios de manutenção</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &mu; m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro; m 2,1 x 50 mm</td><td>Águas</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS software</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Analista 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>luminômetro</td><td>Molecular Devices</td><td>Espectrofotômetro SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td> Contador de células <td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>Evaporador rotativo Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

espectrometria de massa e abordagens baseadas no luminogenic caracterizar fase i metabolic competência de<em&gt; in vitro</em&gt; culturas de células

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

enzimas que metabolizam xenobióticos desempenham uma função chave na biotransformação de medicamentos e substâncias tóxicas através da adição de grupos funcionais que aumentam a solubilidade e facilitar a excreção. Em algumas ocasiões, essas modificações estruturais levar à formação de novos produtos tóxicos. A fim de reduzir os ensaios com animais, risco química pode ser avaliada utilizando as células metabolicamente competentes. A expressão das enzimas metabólicas, no entanto, não é estável ao longo do tempo, em muitos sistemas de cultura primária in vitro e é muitas vezes parcial ou ausente em linhas de células. Por conseguinte, o estudo de medicamentos, aditivos, e metabolismo poluentes do ambiente in vitro devem, idealmente, ser conduzida em sistemas celulares em que a actividade metabólica tenha sido caracterizados. Nós explicar aqui uma abordagem para medir a actividade de uma classe de enzimas metabólicas (Fase Humano I) em linhas celulares de culturas 2D e 3D primárias utilizando sondas químicas e os seus produtos metabólicos quantificáveis ​​por espectrometria de massa e UPLCluminometria. O método pode ser implementado para testar a actividade metabólica em linhas celulares e células primárias derivadas de uma variedade de tecidos.

Exemplos de actividade metabólica medidos para dois pares de CYP (CYP1A1 / 1B1 e CYP2A6 / 2A13) nas culturas de células das vias respiratórias a partir de três dadores diferentes (das vias aéreas M360, M370, M417) e a linha de células hepáticas (linha Hep) são mostrados na Figura 6 20. Actividade medida por luminometria CYP A Figura 6A mostra o luminescência relativa resultante da actividade de CYP1A1 / 1B1 O-desalquilação de Luc-CEE (luciferina éter 6&#39;-cloroetil) em células das vias respiratórias (3 dadores) e células hepáticas com e sem indução TCDD. CYP1A1 / 1B1 são enzimas altamente induzíveis e, tipicamente, não são expressas a um nível constitutiva na maioria dos tecidos. Como pode ser observado na Figura 6A, nenhum sinal é detectado luminogenic quando as células não são induzidos. Quando ambos os tipos de células são pré-incubadas com a TCDD, uma forte CYP1A1 / indutor 1B1, uma marcasinal ed luminogenic é detectado em comparação com o controlo (Figura 6A). Isto indica que a sonda Luc-CEE foi metabolizado líder para a libertação da porção de luciferina que é quantificado posteriormente. Em geral, a actividade da linha celular hepática tratados TCDD é menor do que para as células das vias respiratórias, mesmo após normalização de proteína total. Este não é invulgar, uma vez linhas de células tendem a ser menos metabolicamente activa do que as células primárias. A adição de α-naftoflavona tem um efeito inibidor evidente sobre a actividade de CYP1A1 / 1B1 em todos os tipos de células que confirma ainda mais o CYP-dependência do metabolismo Luc-CEE. A quantificação dos metabolitos do CYP450 usando UPLC-MS A Figura 6B ilustra a quantificação da actividade de CYP2A6 / 2A13 em células das vias respiratórias a partir de 3 dadores (Airway M343, M345, M347) e células hepáticas (linha Hep) após incubação com cumarina na presença e na ausência do inhiBITOR 8-metoxipsoraleno. Os dados são normalizados para proteína total. No controlo cumarina incubação 0 min, nenhuma 7-hidroxicumarina é detectado (Figura 6B). CYP2A6 / 2A13 são expressos constitutivamente em determinados tecidos e, portanto, depois de 16 h de incubação, com formação de cumarina 7-hidroxicumarina é detectado nos diferentes tipos de células testadas, mesmo sem indução. Quando o 8-metoxipsoraleno, de um inibidor de CYP2A é adicionada (Figura 6B), a formação de 7-hidroxicumarina é consideravelmente reduzido. Deve notar-se que na presença do inibidor de CYP, é normal ainda detectar alguma actividade residual como inibição raramente é completa e uma vez que outros CYP pode também ser capaz de reconhecer o substrato mas processar-se muito menos eficientemente. Também pode ser observado que a actividade metabólica gravado pode ser diferente entre os doadores quando se utiliza células primárias, uma vez que é visível para CYP2A6 em células das vias respiratórias(Figura 6B). Isto é esperado como actividade CYP é susceptível de genótipo e de polimorfismos de cada doador. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figura 6: Ensaio de Actividade Resultado para CYP1A1 / 1B1 Actividade (A) e CYP2A6 2A13 actividade / (B) na linha de células hepáticas e em três das vias aéreas celular Doadores (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE actividade desalquilação é mostrado com e sem indução de CYP1A1 / 1B1 por TCDD. α-naftoflavona foi utilizado como inibidor de CYP1A1 / 1B1. A actividade é expressa como unidades relativas de luminesccia (RLU) normalizados por hora de incubação em minutos (min) e a proteína total (mg). (B) de CYP2A6 / 2A13 não requerem indução como eles são expressos constitutivamente. Cumarina actividade 7-hidroxilação em proteínas pmol / min / mg é mostrada em diferentes pontos de tempo, com e sem o inibidor de 8-methoxypsorAlen. Todos os resultados são apresentados como um valor médio de três medições independentes com desvios padrão da média. Esta figura foi modificado a partir de Baxter 20. Tabela Suplementar 1: UPLC e configurações espectrômetro de massa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

Competência metabólica de sistemas in vitro é um requisito chave para a biotransformação e disposição de drogas e substâncias tóxicas. Neste protocolo, descrevemos a aplicação de sondas metabólicas referência para avaliar metabolismo de fase I em culturas de células.

Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de<em&gt; In Vitro</em&gt; culturas de células

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

O objetivo deste procedimento é determinar a atividade das citocromo P450, ou CYPs, em células cultivadas. As CYPs são enzimas fundamentais envolvidas no metabolismo de medicamentos e substâncias tóxicas, e sua expressão geralmente não é mantida in vitro. A expressão normal das enzimas CYP frequentemente é perdida quando as células são cultivadas in vitro.Portanto, muitos modelos in vitro possuem relevância potencialmente limitada para o entendimento do metabolismo de medicamentos e substâncias tóxicas. A principal vantagem deste método é sua simplicidade ao avaliar a atividade da CYP em células cultivadas. Utilizando substratos marcadores e inibidores, são apresentadas diferentes plataformas de quantificação, incluindo espectrometria de massas.Para começar, obtenha frascos criogênicos com células conforme descrito no protocolo textual. O protocolo fornecido utiliza uma linhagem celular hepática como exemplo. Enquanto trabalha em condições estéreis, abra cuidadosamente o frasco criogênico para liberar qualquer pressão excessiva, em seguida pipete o conteúdo do frasco criogênico para um tubo de 10 mililitros contendo nove mililitros de meio Williams'E pré-aquecido a 37 graus Celsius.Centrifugue a solução por 10 minutos a 400 vezes g em temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante, re-suspenda as células em cinco mililitros de meio de descongelamento proprietário, pré-aquecido a 37 graus Celsius e suplementado com glutamina. Após contar as células viáveis conforme descrito no protocolo do texto, semeie as células em uma placa de 24 poços revestida com colágeno, numa densidade de 60.000 células viáveis por poço e volume final de 0,5 mililitros de meio de descongelamento.Após alguns dias em cultura, as células formam uma estrutura trabecular subconfluente. A atividade metabólica ideal é geralmente observada entre os dias sete e dez, sendo mais baixa no dia quatro. Para preparar culturas de epitélio de vias aéreas diferenciado, utilize epitélio primário de vias aéreas totalmente diferenciado, disponível comercialmente, que tenha sido cultivado na interface ar-líquido sobre um inserto.Usando pin&ccedil;as est&eacute;reis, desprenda suavemente o inserto celular da matriz de agarose e transfira-o para a nova placa previamente carregada com 700 microlitros de meio de cultura pr&oacute;prio. Avalie a integridade do tecido das vias a&eacute;reas utilizando m&eacute;todos referenciados no protocolo textual, como a resist&ecirc;ncia transepitelial ou a frequ&ecirc;ncia de batimento dos c&iacute;lios. Antes do experimento, prepare duas s&eacute;ries de insertos celulares para as c&eacute;lulas das vias a&eacute;reas e po&ccedil;os para as c&eacute;lulas hep&aacute;ticas, com no m&iacute;nimo tr&ecirc;s replicatas.Utilize uma série para o experimento de inibição e a outra para o marcador metabólico apenas. Prepare uma terceira série de células como controle em branco do meio. No dia do experimento, substitua o meio de cultura celular por 450 microlitros de meio fresco.Adicione 50 microlitros de meio contendo o inibidor de CYP 10x à série de células preparada para o experimento de inibição e pré-incube por 30 minutos. Em seguida, substitua o meio na série de inibição por 450 microlitros de meio fresco e adicione 50 microlitros de meio contendo tanto o inibidor de CYP 10x quanto o substrato marcador 10x. Adicione 50 microlitros de meio com o substrato marcador 10x às outras células e, então, adicione uma quantidade equivalente de veículo diluído em meio aos controles de células em branco.Após incubação das células por zero a cinco minutos para o ponto temporal um, controle zero de fundo, colete o meio em tubos separados e rotulados e congele o meio para processamento futuro. Em seguida, incube as células do ponto temporal dois por 16 horas na incubadora de células. Ao final do período de incubação, colete o meio utilizando o mesmo método para quantificação do produto metabólico.Transfira 250 microlitros do meio de incubação para um microtubo de 1,5 mililitro e adicione a solução estoque do padrão interno 4-metilumbeliferona para atingir uma concentração final de 100 nanomolar. Ajuste o pH do meio entre 4,5 e 5,0 adicionando ácido clorídrico 1 molar, um microlitro de cada vez. Verifique o pH pipetando de dois a 10 microlitros do meio em uma tira de pH e, em seguida, adicione 150 unidades de beta-glicosidase arilsulfatase de Helix pomatia.Após a incubação por uma hora a 37 graus Celsius, interrompa a reação adicionando 250 microlitros de metanol frio. Evapore o solvente utilizando uma centrífuga a vácuo a 45 graus Celsius. Reconstitua as amostras com 500 microlitros de uma solução de acetonitrila a 30% em água.Para realizar a quantificação baseada em espectrometria de massas, adicione 250 microlitros de cada padrão de diluição seriada a um frasco de vidro âmbar para cromatografia líquida de ultra desempenho para injeção no amostrador automático de UPLC-MS. Adicione também as amostras de teste a frascos âmbar de UPLC e coloque-os no amostrador automático de UPLC. Após randomizar todos os frascos, execute a UPLC-MS usando as configurações detalhadas no protocolo descrito no texto, dependendo da sonda específica a ser quantificada.Utilize a ferramenta Quantitate, Build Quantitation Method nas ferramentas de quantificação do espectrômetro de massas para gerar a curva de calibração a partir do padrão sintético adquirido e do padrão interno, em seguida use o Assistente de Quantificação para selecionar o lote de amostras e as amostras a serem quantificadas e executar o método de quantificação. Para induzir CYP1A1, CYP1B1, utilize o layout da placa descrito no protocolo textual. Incube as células designadas para indução com uma concentração final de 10 nanomolar de TCDD em meio por um período de 72 horas.Após esse período, remova o meio, lave as placas com PBS três vezes e adicione meio fresco. Antes de incubar as células com a sonda luminogênica, pré-incube o subconjunto designado de células induzidas por 30 minutos com o inibidor da CYP1A1, CYP1B1 no meio. Adicione a sonda luminogênica, éter 6'cloroetílico da luciferina, numa concentração final de 50 micromolar às células não induzidas, induzidas e induzidas com inibidor.Incube por quatro horas e, em seguida, transfira 25 microlitros do meio de cultura para uma placa branca e opaca de 96 poços e adicione 25 microlitros do reagente de detecção de luciferina fornecido pelo fabricante. Após a incubação por 20 minutos à temperatura ambiente, leia imediatamente a placa utilizando um luminômetro. A luminiscência relativa produzida pela dealquilação do éter 6'cloroetílico da luciferina, que é catalisada pelas CYP1A1 e CYP1B1, é apresentada aqui.O exemplo mostra nenhuma atividade enzimática na ausência de indução por TCDD. Após a indução por TCDD, observa-se a atividade de CYP1A1, CYP1B1 em ambos os tipos celulares hepáticos e respiratórios. Por fim, a adição do inibidor de CYP1A1, CYP1B1 alfa-naftoflavona reduz ou elimina a atividade de CYP.Para avaliar a atividade da CYP2A6 e da 2A13 em tipos celulares hepáticos e das vias aéreas, quantificou-se a quantidade de 7-hidroxicumarina produzida pela hidroxilação da cumarina pela enzima, utilizando UPLC LC-MS. Na incubação com cumarina por zero minuto, apenas o sinal de fundo é detectado. Após 16 horas, observa-se a hidroxilação da cumarina com a formação de 7-hidroxicumarina nos dois tipos celulares.Por fim, a adição do inibidor da CYP2A, 2A13 impede a formação de 7-hidroxicumarina. Após dominar a técnica, as etapas de incubação com a sonda e quantificação podem ser realizadas em algumas horas até um dia na maioria dos casos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar diversos ensaios de metabolismo da fase um utilizando diferentes tipos celulares, confirmando a especificidade da enzima mediante inibição e/ou indução, conforme necessário.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que diferentes tipos celulares podem exigir tempos de incubação mais longos, e é essencial incluir um tipo celular que possa ser usado como controle positivo. Não se esqueça de que o trabalho com TCDD pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso completo de equipamento de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao executar este procedimento. As implicações desta técnica estendem-se ao uso de modelos in vitro apropriados para avaliação pré-clínica de novos medicamentos e à avaliação de riscos de produtos químicos e ingredientes utilizados em produtos de consumo.

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Bioquímica

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