Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de

O objetivo deste procedimento é determinar a atividade das citocromo P450, ou CYPs, em células cultivadas. As CYPs são enzimas fundamentais envolvidas no metabolismo de medicamentos e substâncias tóxicas, e sua expressão geralmente não é mantida in vitro. A expressão normal das enzimas CYP frequentemente é perdida quando as células são cultivadas in vitro.

Portanto, muitos modelos in vitro possuem relevância potencialmente limitada para o entendimento do metabolismo de medicamentos e substâncias tóxicas. A principal vantagem deste método é sua simplicidade ao avaliar a atividade da CYP em células cultivadas. Utilizando substratos marcadores e inibidores, são apresentadas diferentes plataformas de quantificação, incluindo espectrometria de massas.

Para começar, obtenha frascos criogênicos com células conforme descrito no protocolo textual. O protocolo fornecido utiliza uma linhagem celular hepática como exemplo. Enquanto trabalha em condições estéreis, abra cuidadosamente o frasco criogênico para liberar qualquer pressão excessiva, em seguida pipete o conteúdo do frasco criogênico para um tubo de 10 mililitros contendo nove mililitros de meio Williams'E pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Centrifugue a solução por 10 minutos a 400 vezes g em temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante, re-suspenda as células em cinco mililitros de meio de descongelamento proprietário, pré-aquecido a 37 graus Celsius e suplementado com glutamina. Após contar as células viáveis conforme descrito no protocolo do texto, semeie as células em uma placa de 24 poços revestida com colágeno, numa densidade de 60.000 células viáveis por poço e volume final de 0,5 mililitros de meio de descongelamento.

Após alguns dias em cultura, as células formam uma estrutura trabecular subconfluente. A atividade metabólica ideal é geralmente observada entre os dias sete e dez, sendo mais baixa no dia quatro. Para preparar culturas de epitélio de vias aéreas diferenciado, utilize epitélio primário de vias aéreas totalmente diferenciado, disponível comercialmente, que tenha sido cultivado na interface ar-líquido sobre um inserto.

Usando pinças estéreis, desprenda suavemente o inserto celular da matriz de agarose e transfira-o para a nova placa previamente carregada com 700 microlitros de meio de cultura próprio. Avalie a integridade do tecido das vias aéreas utilizando métodos referenciados no protocolo textual, como a resistência transepitelial ou a frequência de batimento dos cílios. Antes do experimento, prepare duas séries de insertos celulares para as células das vias aéreas e poços para as células hepáticas, com no mínimo três replicatas.

Utilize uma série para o experimento de inibição e a outra para o marcador metabólico apenas. Prepare uma terceira série de células como controle em branco do meio. No dia do experimento, substitua o meio de cultura celular por 450 microlitros de meio fresco.

Adicione 50 microlitros de meio contendo o inibidor de CYP 10x à série de células preparada para o experimento de inibição e pré-incube por 30 minutos. Em seguida, substitua o meio na série de inibição por 450 microlitros de meio fresco e adicione 50 microlitros de meio contendo tanto o inibidor de CYP 10x quanto o substrato marcador 10x. Adicione 50 microlitros de meio com o substrato marcador 10x às outras células e, então, adicione uma quantidade equivalente de veículo diluído em meio aos controles de células em branco.

Após incubação das células por zero a cinco minutos para o ponto temporal um, controle zero de fundo, colete o meio em tubos separados e rotulados e congele o meio para processamento futuro. Em seguida, incube as células do ponto temporal dois por 16 horas na incubadora de células. Ao final do período de incubação, colete o meio utilizando o mesmo método para quantificação do produto metabólico.

Transfira 250 microlitros do meio de incubação para um microtubo de 1,5 mililitro e adicione a solução estoque do padrão interno 4-metilumbeliferona para atingir uma concentração final de 100 nanomolar. Ajuste o pH do meio entre 4,5 e 5,0 adicionando ácido clorídrico 1 molar, um microlitro de cada vez. Verifique o pH pipetando de dois a 10 microlitros do meio em uma tira de pH e, em seguida, adicione 150 unidades de beta-glicosidase arilsulfatase de Helix pomatia.

Após a incubação por uma hora a 37 graus Celsius, interrompa a reação adicionando 250 microlitros de metanol frio. Evapore o solvente utilizando uma centrífuga a vácuo a 45 graus Celsius. Reconstitua as amostras com 500 microlitros de uma solução de acetonitrila a 30% em água.

Para realizar a quantificação baseada em espectrometria de massas, adicione 250 microlitros de cada padrão de diluição seriada a um frasco de vidro âmbar para cromatografia líquida de ultra desempenho para injeção no amostrador automático de UPLC-MS. Adicione também as amostras de teste a frascos âmbar de UPLC e coloque-os no amostrador automático de UPLC. Após randomizar todos os frascos, execute a UPLC-MS usando as configurações detalhadas no protocolo descrito no texto, dependendo da sonda específica a ser quantificada.

Utilize a ferramenta Quantitate, Build Quantitation Method nas ferramentas de quantificação do espectrômetro de massas para gerar a curva de calibração a partir do padrão sintético adquirido e do padrão interno, em seguida use o Assistente de Quantificação para selecionar o lote de amostras e as amostras a serem quantificadas e executar o método de quantificação. Para induzir CYP1A1, CYP1B1, utilize o layout da placa descrito no protocolo textual. Incube as células designadas para indução com uma concentração final de 10 nanomolar de TCDD em meio por um período de 72 horas.

Após esse período, remova o meio, lave as placas com PBS três vezes e adicione meio fresco. Antes de incubar as células com a sonda luminogênica, pré-incube o subconjunto designado de células induzidas por 30 minutos com o inibidor da CYP1A1, CYP1B1 no meio. Adicione a sonda luminogênica, éter 6'cloroetílico da luciferina, numa concentração final de 50 micromolar às células não induzidas, induzidas e induzidas com inibidor.

Incube por quatro horas e, em seguida, transfira 25 microlitros do meio de cultura para uma placa branca e opaca de 96 poços e adicione 25 microlitros do reagente de detecção de luciferina fornecido pelo fabricante. Após a incubação por 20 minutos à temperatura ambiente, leia imediatamente a placa utilizando um luminômetro. A luminiscência relativa produzida pela dealquilação do éter 6'cloroetílico da luciferina, que é catalisada pelas CYP1A1 e CYP1B1, é apresentada aqui.

O exemplo mostra nenhuma atividade enzimática na ausência de indução por TCDD. Após a indução por TCDD, observa-se a atividade de CYP1A1, CYP1B1 em ambos os tipos celulares hepáticos e respiratórios. Por fim, a adição do inibidor de CYP1A1, CYP1B1 alfa-naftoflavona reduz ou elimina a atividade de CYP.

Para avaliar a atividade da CYP2A6 e da 2A13 em tipos celulares hepáticos e das vias aéreas, quantificou-se a quantidade de 7-hidroxicumarina produzida pela hidroxilação da cumarina pela enzima, utilizando UPLC LC-MS. Na incubação com cumarina por zero minuto, apenas o sinal de fundo é detectado. Após 16 horas, observa-se a hidroxilação da cumarina com a formação de 7-hidroxicumarina nos dois tipos celulares.

Por fim, a adição do inibidor da CYP2A, 2A13 impede a formação de 7-hidroxicumarina. Após dominar a técnica, as etapas de incubação com a sonda e quantificação podem ser realizadas em algumas horas até um dia na maioria dos casos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar diversos ensaios de metabolismo da fase um utilizando diferentes tipos celulares, confirmando a especificidade da enzima mediante inibição e/ou indução, conforme necessário.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que diferentes tipos celulares podem exigir tempos de incubação mais longos, e é essencial incluir um tipo celular que possa ser usado como controle positivo. Não se esqueça de que o trabalho com TCDD pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso completo de equipamento de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao executar este procedimento. As implicações desta técnica estendem-se ao uso de modelos in vitro apropriados para avaliação pré-clínica de novos medicamentos e à avaliação de riscos de produtos químicos e ingredientes utilizados em produtos de consumo.