Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

O objetivo geral deste ensaio é medir a atividade enzimática das proteínas quinases. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da sinalização da quinase, como quão ativa é uma quinase ou mutante de quinase, sua especificidade e se sua atividade é sensível a diferentes tratamentos celulares. A principal vantagem dessa técnica é que ela é versátil e quantitativa.

Demonstrando o procedimento estará Steve Stippec, um cientista pesquisador do Laboratório Cobb que tem uma boa experiência com este ensaio. Para começar, adicione dois microlitros de um miligrama por mililitro de anticorpo a 200 microlitros de lisados celulares e incube a quatro graus Celsius por uma hora enquanto balança. Lave os grânulos de proteína A-Sepharose duas a três vezes adicionando tampão de lise e, em seguida, toque girando a quatro graus Celsius por 30 segundos a um minuto a 5000 vezes g, em seguida, remova o sobrenadante com uma pipeta e ressuspenda os grânulos no tampão.