Name: Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a medir a atividade enzimática de proteínas quinases usando ATP radiomarcado. Este ensaio versátil e quantitativo auxilia na compreensão das vias de sinalização celular em pesquisas de bioquímica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem a todos os atuais e antigos membros do laboratório Cobb pelo valioso trabalho e discussões, e Dionne Ware pela assistência administrativa. Estes estudos foram apoiados pelo National Institutes of Health Grant R37 DK34128 e Welch Foundation Grant I1243 para MHC

1. Kinase Recursos de Purificação e General Immunoprecipitation Pipeline NOTA: As quinases para utilização com este ensaio podem ser obtidas a partir de imunoprecipitados de células cultivadas ou por meios recombinantes tais como a purificação marcada por afinidade 6 . Abaixo está um protocolo geral para a imunoprecipitação marcada por sinalização que pode ter de ser modificada dependendo da quinase de interesse. Tudo deve ser mantido em gelo quando possível. <ol><li> Adicionar 2 μL de 1 mg / mL de anticorpo a 200 μL de lisados ​​celulares (geralmente ~ 1 mg / mL de concentração total de proteína) e incubar a 4 ° C durante 1 h enquanto balança. </li><li> Lavar as esferas de proteína Sepharose 2-3 vezes com tampão de lise (ver abaixo) por centrifugação breve a 4 ° C durante 30 s a 1 min a 5.000 xg (&quot;spin toque&quot;), remoção do sobrenadante com uma pipeta e resuspensão de esferas em tampão . <ol><li> Preparar tampão de lise: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 10%, ortovanadato de sï¿½io 0,2 mM, fluoreto de sï¿½io 100 mM, p-glicerofosfato 50 mM, Triton X 100 a 0,1% ou NP-40 a 0,1%. </li></ol></li><li> Adicionar 30 μL de pasta de 50% de pérolas de sepharose de proteína A em tampão de lise a lisados; Incubar a 4 ° C durante 1 h enquanto balançando. </li><li> Toque a centrifugação a 4 ° C para sedimentar as esferas e remova o sobrenadante. </li><li> Lavar 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem de pérolas (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4). </li><li> Lavar uma vez com tampão de reacção 1x quinase (HEPES 10 mM pH 8,0, MgCl 2 10 mM). Remova o máximo possível de tampão sem remover as contas. </li></ol> 2. Inicializando Reações de Quinase NOTA: Para ensaios de cinase IP, ~ 15 μL de contas não suspensas é uma amostra inicial típica. Para ensaios de proteína quinase recombinante, as quantidades de partida típicas variam de 0,1-1,0 μg em 1-10 para 25-50 μL de volumes de reacção final. Ajustar os volumes da amostra de proteína recombinanteS para serem iguais com o tampão que são armazenados antes da inicialização do ensaio. Quando se utilizam quantidades elevadas de quinase, incluir uma proteína transportadora tal como BSA para auxiliar na manutenção da estabilidade da proteína durante a duração do ensaio. <ol><li> Preparar o tampão de reacção quinase 5x indicado abaixo: HEPES 50 mM pH 8,0 MgCl2 50 mM 50 mM de Benzamidina (inibidor de protease) DTT 50 mM (agente de redução) 250 μM de ATP (não marcado, ou &quot;frio&quot;) </li><li> Manter amostras de cinase em gelo em tubos de 1,5 mL. Preparar a seguinte mistura reaccional em tubos separados de 1,5 mL arrefecidos: 21 μL de H2O 6 μL de tampão de reacção quinase 5x 1 μL de ATP marcado radioactivamente (&quot;quente&quot;) 2 μL de substrato (~ 5 mg / mL) NOTA: Para ensaios de cinase recombinante, o volume pode ser ajustado para acomodar a proteína purificada. Calcular tal que o volume final da reacção seja de 30 μL. Use esta receita para preparar um mestremisturar. Após a recepção do ATP marcado, diluir o stock em H2O para uma actividade específica de 0,01 mCi / mL antes da adição à mistura reaccional. </li><li> Para inicializar o ensaio, adicionar toda a mistura de reacção à amostra de quinase e incubar a reacção a 30 ° C durante 5 min a 1 h dependendo da actividade da quinase a ser ensaiada. NOTA: Quando se trabalha com uma quinase cuja actividade não foi previamente ensaiada, execute um curso de tempo de actividade de quinase com intervalos de 5 minutos entre os pontos de tempo. </li></ol> 3. Terminação da Reação e SDS-PAGE <ol><li> Parar a reacção colocando em gelo e adicionando 7,5 μL de tampão de amostra Laemmli 5x 6 . </li><li> Aquecer a 100 ° C durante 30 s a 2 min em bloco de calor. </li><li> Toque em rotação e carregue 20 μL por poço em gel SDS-PAGE a 10-15%. Executar o gel o tempo suficiente para separar a cinase eo substrato (tipicamente 1 h a potência constante de 5 W) Certifique-se de manter o aparelho de gel blindado para limitar a exposição a 32 </suP&gt; P. <ol><li> Aqui, use aparelhos de gel caseiros, mas mini-géis padrão comercialmente disponíveis são perfeitamente adequados. Use as dimensões da seguinte forma: Géis: 8 cm de largura, 5,5 cm de comprimento (resolução), 1,5 mm de espessura. Combs: 15 poços, espessura de 1,5 mm, 2,9 mm de largura, 16 mm de profundidade </li></ol></li></ol> 4. Gel de coloração e secagem Cuidado: Para todas as etapas, certifique-se de reduzir a exposição pessoal a 32 P usando blindagem radioativa e usando equipamento de proteção pessoal. Para obter mais informações sobre etapas específicas, algumas referências úteis são incluídas. <ol><li> Remover o gel das placas de vidro / alumina e colocar em 50 mL de mancha de Coomassie (10% de ácido acético glacial, 50% de metanol, 0,25% de corante R-250) durante 1 h num agitador orbital ajustado para 50 rpm. Para este passo use um recipiente que é ligeiramente maior do que o próprio gel. 8 </li><li> Mova o gel da mancha para a solução fixadora (10% de ácido acético glacialD, 20% de metanol) a fim de desidratação. Rocha do gel em 600-700 mL de solução de fixação durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm. Coloque pedaços de espuma ou toalhetes de laboratório atados no recipiente com o gel para absorver o corante Coomassie 8 , 9 . </li><li> Remover o gel da solução de fixação e mergulhar em 200 ml de metanol durante 1-2 minutos com agitação suave até que o gel se torne branco leitoso. Isto ajudará a evitar a fissuração durante o passo de secagem. </li><li> Molhar um pedaço de 14 cm x 14 cm de papel de filtro qualitativo com metanol e colocar em secador de vácuo de gel de laje. Coloque o gel para baixo na face frontal do papel de filtro voltada para cima. </li><li> Cubra o gel com filme plástico cuidadosamente para evitar rugas e bolhas de ar. Executar o secador durante 1,5 h a 80 ° C. Depois que o vácuo foi alcançado abra a tampa e role para fora todas as bolhas de ar se necessário com um brayer macio da borracha. </li></ol> 5. Autoradiograma e contagens de cintilação <ol><li> RemovaEd gel e anexar um marcador autorad, régua fosforescente ou pontos para o papel de filtro no lado do gel. Se estiver usando pontos, certifique-se de que eles estejam em um padrão assimétrico. Isto irá alinhar o gel com o filme após exposição e desenvolvimento. </li><li> Use um contador Geiger para verificar a intensidade do sinal. Para sinais mais fracos, a exposição a -70 ° C a -80 ° C com um ecrã de intensificação aumentará a densidade da banda do filme. </li><li> Em uma sala escura, coloque o gel seco em uma cassete de filme com filme e uma tela intensificadora na seguinte ordem de cima para baixo: gel, filme, tela intensificadora. </li><li> Conecte a tela de intensificação à tampa da cassete e fita o gel no lugar para fazer este passo mais fácil. A tela de intensificação emite luz quando irradiada pelas partículas beta das 32 P. Estas emissões de luz penetram a película mais eficientemente do que as partículas beta. <ol><li> Certifique-se de que o comprimento de onda emitido peloLagoas para um comprimento de onda o filme é mais sensível a. </li><li> Use um contador Geiger para determinar quanto tempo para deixar a exposição para: se contagem cpm é ~ 100 ou abaixo, tente durante a noite a -70 ° C. Se a contagem for ~ 10.000, comece com uma exposição de 1 h e otimize a partir daí. </li></ol></li><li> No final da exposição remova a película e desenvolva-se em um processador de filme médico / de raios-X. Se a exposição foi realizada a -70 a -80 ° C, deixe a cassete aquecer até à temperatura ambiente para minimizar a condensação na película ou remover a película imediatamente antes da formação da condensação 10 . </li><li> Colocar o filme sobre o gel / papel de filtro seco e alinhar a imagem do marcador / pontos com os marcadores / pontos no gel seco. Marcar no filme as bandas correspondentes aos padrões de proteína. Rotular os padrões de proteína e quais pistas as reações são para referência futura. </li><li> Excise as faixas do gel que correspondem às bandas de interesse no filme e colocá-losEm 7 mL de frascos de cintilação. Adicionar 4 mL de fluido de cintilação e contar com contador de cintilação líquida. Confirme se o contador está configurado para monitorar a janela correta do espectro de energia para 32 P. NOTA: Certifique-se também de excluir a banda correspondente ao substrato da pista de controle de não quinase. Isto será utilizado para calcular a radiação de fundo que será subtraída de todas as contagens de cintilação da amostra. </li></ol> 6. Análise dos Resultados NOTA: O autorradiograma fornece uma visualização qualitativa dos resultados. Para uma quantificação precisa, a incorporação de 32 P pode ser medida com um contador de cintilação. Os dados são usualmente expressos em termos de actividade relativa, como mostrado na Figura 1B . Enquanto as condições uniformes forem mantidas para todas as amostras, medições relativas de actividade específica são suficientes para comparar tratamentos. <ol><li> Ao calcular valores absolutos de atividade específica, execute um rigorOtimização de todas as condições de reação, incluindo cinase, substrato e concentrações de ATP fria, a fim de assegurar um intervalo linear de atividade ao longo do tempo ( ex. 2 x [quinase] = 2 x atividade específica). Para quinases com elevada actividade específica, efectuar ensaios com aumento da concentração de substrato, caso a actividade de quinase seja limitada pela quantidade de substrato. </li><li> Calcular a actividade específica da quinase de interesse em unidades de nanomoles de fosfato transferidos por minuto por mg de cinase. <ol><li> Subtraia os espaços em branco das cpm nas faixas contadas. </li><li> Calcula a decaimento do ATP quente: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0,95 onde t é o número de dias desde a data de referência (deve ser fornecido pelo fornecedor), t 1/2 é o Meia-vida de 32 P, que é de 14,3 dias, e 0,95 reflecte a eficiência do contador de cintilação. Exemplo: se estiver usando ATP quente com 28 dias de idade, o valor de decaimento deve ser 0,245. </li><li> Calc(Pmol) de ATP total no ensaio (usualmente isto é igual à quantidade de ATP frio na reacção): volume de ensaio (μL) x [ATP fria] (μM) = ATP total (pmols). Exemplo: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol </li><li> Calcular cpm / pmol ATP: [μL de ATP quente x (2,2 x 10 7 ) x factor de decaimento] / pmol de ATP frio. NOTA: O valor de 2,2 x 10 7 converte 0,01 mCi / μL de ATP em cpm. </li><li> Calcular a quantidade de cinase no ensaio em mg. Para quinases recombinantes e quinases imunoprecipitadas, os métodos padrão tais como os ensaios BCA são adequados para determinar as concentrações iniciais. Exemplo: wtERK2 0,0002 μg / μL numa reacção de cinase de 50 μL é 0,01 μg, ou 1 x 10 -5 mg. </li><li> Calcular o cpm total no ensaio. Reúna 30 μL de reações e administre 20 μL de cada reação em um gel. Multiplicar as cpm contadas (após subtracção em branco) por um factor de volume total de ensaio / volume carregado. Continuando oExemplo, multiplique todas as contagens por 1,5 ou 30/20. </li><li> Calcular a actividade específica da cinase ensaiada: Cpm total no ensaio) / (cpm / pmol ATP) / (tempo de ensaio em minutos) / (quantidade de quinase em mg) NOTA: A divisão do valor acima em 1000 produz a actividade específica em nanomoles / minuto / mg </li></ol></li><li> Calcular quantos mols de fosfato são incorporados num substrato (desde que o seu peso molecular seja conhecido). Isto é usado para determinar o número de fosfositos numa proteína particular depois de a reacção ter terminado. Cpm total no ensaio) / (cpm / pmol ATP)] / (quantidade de substrato em pmoles) </li></ol>

<ol><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complexity+of+the+ERK%2FMAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33(2016).</li>
<li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li>
<li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine%2Fthreonine-specific+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li>
<li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+fluorescence+assay+for+serine%2Fthreonine+kinases+using+specific+chemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/">http://cshprotocols.cshlp.org/</a> (2016).</li>
<li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja9856856">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215(1999).</li>
<li>Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html">http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html</a> (2007).</li>
<li>Autoradiography. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. , 3 edn, Humana Press. (2009).</li>
<li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNK1%2C+a+novel+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li>
<li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.biochem.6b00096">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li>
<li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11(2011).</li>
<li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1%2F2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669(2013).</li>
<li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+%28ERK5%29+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As quinases são uma família diversificada de proteínas que desenvolveram extensa funcionalidade em numerosos contextos e os ensaios de quinase têm sido extremamente úteis no estudo de várias proteínas de sinalização e têm contribuído muito para a nossa compreensão atual da comunicação celular. Notavelmente, o mesmo ensaio básico foi utilizado na caracterização de duas cinases diferentes, apesar das grandes diferenças de estrutura e actividade. A quinase WNK1 contém uma bolsa catalítica atípica em que a lisina crítica se...

As cinases de proteínas são sofisticadas enzimas críticas para a transmissão de sinais celulares em respostas apropriadas 1 . Dado o seu papel na manutenção da homeostase e na prevenção ou promoção de estados de doença 2 , os métodos bioquímicos para avaliar a actividade de quinase continuam a ser ferramentas poderosas para delinear as particularidades da sinalização eucariótica 3 . Embora as estratégias que utilizam anticorpos fosfo específicos tenham sido altamente informativas em termos de medição dos efeitos de diferentes condições de tratamento no estado de sinalização celular 4 , um ensaio de cinase permite medir os efeitos de diferentes condições de tratamento directamente em termos da actividade enzimática de uma cinase de interesse. Embora existam várias opções para ensaios semelhantes que não utilizam materiais radioactivos 5 , continuamos a depender deste método para uma quantificação robusta dos resultados. LáSão duas aplicações típicas deste ensaio, ambas valiosas por razões diferentes: o ensaio de quinase imunoprecipitado (IP) ( Figura 1 ) e o ensaio de proteína quinase recombinante ( Figura 2 ). O ensaio de quinase de IP é tremendamente útil para identificar factores capazes de activar cinases de proteína específicas, bem como avaliar as condições de tratamento inibitório. Resumidamente, uma quinase marcada com epítopo de interesse é transfectada em células eucarióticas cultivadas, submetida a uma variedade de tratamentos, imunoprecipitada e ensaiada quanto à capacidade de incorporar fosfato radiomarcado num substrato modelo ( por exemplo, proteína básica de mielina (MBP)). O ensaio de quinase de IP pode também ser realizado sem recorrer à sobre-expressão, quer por imunoprecipitação de proteína endógena ou qualquer número de técnicas de edição genómica. Uma vez que os tratamentos são administrados em cultura, este método pode detectar estimulações transmitidas através de múltiplos factores a montanteOu paralelas por leitura in vitro . Uma grande vantagem deste método é que não requer conhecimento prévio de factores directos a montante ou a jusante ou sítios de fosforilação. Além disso, uma vez identificados substratos específicos para uma quinase de interesse, o mesmo protocolo de ensaio de cinase pode ser utilizado com componentes recombinantes para medir actividade específica em relação a substratos naturais e identificar locais de fosforilação específicos quando combinados com análise de espectrometria de massa. Os locais identificados desta maneira podem ser ainda validados com ensaios de quinase utilizando mutantes de substrato. Por último, este método também pode ser utilizado para detectar e medir a autofosforilação. O protocolo proporcionado aqui pressupõe um esquema de purificação de proteínas optimizado ou método de transfecção para expressar uma cinase marcada por afinidade de interesse em células cultivadas. Para exposições mais detalhadas de transfecção, lise, imunoprecipitação e protOcols, sugerimos referir-se a Cold Spring Harbor Protocolos 6 . Para obter mais informações sobre o desenvolvimento e modificação do ensaio, consulte a Fosforilação de Proteínas: Métodos Selecionados na Enzimologia 7 .

<table><tbody><tr><td>Proteína A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiomarcado [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Blindagem radioativa</td> Research <td>Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 corante (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grau 3 papel de filtro qualitativo Whatman</td><td></td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Secador de gel a vácuo de placa</td><td>Bio-Rad</td><td>Modelo 583 #1651745&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcador Autorad</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Régua fosforescente</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Pontos fosforescentes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Contador Geiger</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 com detector</td><td></td>44-9</tr><tr><td>BioMax 8 x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Filme MS 8" x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Tela Intensificadora 8" x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Processador de filme médico/raio-X</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cintilação</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>MP</td><td>Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Contador de cintilação</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio da actividade da proteína quinase com atp radiomarcado

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

As cinases proteicas são capazes de governar mudanças celulares em grande escala em resposta a complexas matrizes de estímulos, e muito esforço tem sido direcionado para descobrir detalhes alostéricos de sua regulação. As quinases compreendem redes de sinalização cujos defeitos são frequentemente marcas de múltiplas formas de cancro e doenças relacionadas, tornando uma plataforma de análise passível de manipulação de factores reguladores a montante e validação de requisitos de reacção críticos na procura de terapêuticas melhoradas. Aqui, descrevemos um ensaio de quinase básico que pode ser facilmente adaptado para se adequar a questões experimentais específicas incluindo, mas não se limitando a, testar os efeitos de agentes bioquímicos e farmacológicos, manipulações genéticas tais como mutação e deleção, bem como condições de cultura de células e tratamentos para sondar Mecanismos de sinalização celular. Este ensaio utiliza [γ- 32 P] ATP radiomarcado, que permite comparações quantitativas e uma visualização clara dos resultados, e pode ser modSe para utilização com quinase imunoprecipitada ou recombinante, substratos específicos ou tipificados, numa vasta gama de condições de reacção.

Ensaios de quinase WNK1 IP O WNK1 marcado com Myc foi transfectado em células HEK293 e imunoprecipitado com um anticorpo anti-Myc 11 . O imunoprecipitado exibiu actividade quinase em direcção ao substrato modelo MBP assim como para si próprio ( Figura 1A ). Os mutantes WNK1 foram então testados quanto à actividade de quinase em relação a MBP pelo mesmo método, desta vez empregando construç...

As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.

Ensaio da Actividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

O objetivo geral deste ensaio é medir a atividade enzimática de proteínas quinases. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de sinalização por quinases, como quão ativa é uma quinase ou uma mutante de quinase, sua especificidade e se sua atividade é sensível a diferentes tratamentos celulares. A principal vantagem desta técnica é que ela é ao mesmo tempo versátil e quantitativa.Demonstrará o procedimento Steve Stippec, cientista pesquisador do Laboratório Cobb, que possui vasta experiência com este ensaio. Para começar, adicione dois microlitros de anticorpo a um miligrama por mililitro a 200 microlitros de lisados celulares e incube a quatro graus Celsius por uma hora sob agitação. Lave as esferas de proteína A-Sepharose duas a três vezes adicionando tampão de lise e, em seguida, centrifugue brevemente a quatro graus Celsius por 30 segundos a um minuto a 5000 ×g, remova o sobrenadante com uma pipeta e re-suspenda as esferas em tampão.Em seguida, adicione 30 microlitros de uma suspensão a 50% de perlas de proteína A-Sepharose e tampão de lise aos lisados. Incube os lisados a quatro graus Celsius durante uma hora sob agitação. Faça uma centrifugação breve a quatro graus Celsius para sedimentar as perlas e remova o sobrenadante.Lave as microesferas três vezes com um mililitro de tampão de lavagem de microesferas, seguido por centrifugação breve, e depois lave as microesferas uma vez com tampão de reação de quinase 1X. Após a centrifugação breve, remova o máximo possível do tampão sem remover as microesferas. Para iniciar o ensaio, adicione toda a mistura de reação à amostra de quinase.Incube a reação a 30 graus Celsius por cinco minutos a uma hora, dependendo da atividade da quinase sendo analisada. Pare a reação colocando-a em gelo e adicionando 7,5 microlitros de tampão amostra Laemmli 5 X, depois aqueça a reação a 100 graus Celsius por três a cinco minutos no bloco térmico. Após centrifugar brevemente a amostra, carregue 20 microlitros por poço em um gel de SDS-PAGE de 10 a 15%.Certifique-se de manter o aparato de eletroforese protegido para limitar a exposição ao fósforo-32, pois ele é um emissor beta de alta energia. Execute o gel por tempo suficiente para separar a quinase e o substrato. Após a corrida, remova o gel das placas de vidro e alumínio e, em seguida, coloque o gel em 50 mililitros de solução corante de Coomassie por uma hora em um agitador orbital ajustado a 50 RPM.Para esta etapa, utilize um recipiente ligeiramente maior que o próprio gel. Para descorar o gel, transfira-o da solução de coloração para a solução fixadora. Coloque pedaços de espuma ou lenços laboratoriais amarrados no recipiente com o gel para absorver o corante Coomassie.Balançar o gel em 600 a 700 mililitros de solução fixadora durante a noite em agitador orbital a 50 RPM. No dia seguinte, remover o gel da solução fixadora e mergulhá-lo em 200 mililitros de metanol por um a dois minutos com agitação suave até que o gel fique branco leitoso. Isso ajudará a prevenir rachaduras durante a etapa de secagem.Em seguida, umedeça um pedaço de papel-filtro qualitativo de aproximadamente 14 centímetros por 14 centímetros com metanol e coloque-o sobre um secador de géis em placa com vácuo. Coloque o gel sobre o papel-filtro, com a face dianteira voltada para cima. Cubra cuidadosamente o gel com filme plástico, ligue o secador, execute-o e aplique vácuo.Uma vez atingido o vácuo após apenas alguns segundos, remova as bolhas de ar com um rolo de borracha macia. Continue o processo por 90 minutos. Remova o gel seco e fixe um marcador de autoradiografia, como uma régua ou ponto fosforescente, no papel-filtro do lado do gel e coloque-o em uma cassete contendo uma tela intensificadora.Utilize um contador Geiger para verificar a intensidade do sinal. Para sinais mais fracos, a exposição a temperaturas entre -70 graus Celsius e -80 graus Celsius com uma tela intensificadora aumentará a densidade da banda no filme. Em uma câmara escura, coloque um pedaço de filme sobre o gel seco dentro da cassete de filme contendo uma tela intensificadora.Se a contagem de CPM for 100 ou abaixo, faça uma exposição prolongada durante a noite a menos 70 a 80 graus Celsius. Alternativamente, se a contagem estiver mais próxima de 10.000, comece com uma exposição de uma hora e otimize a partir desse ponto. Ao final da exposição, remova o filme antes de revelá-lo em um processador médico ou de filme radiográfico.Marque as faixas correspondentes aos padrões de proteína no filme. Além disso, identifique os padrões de proteína e as pistas de reação para referência futura. Recorte as faixas do gel que correspondem às faixas de interesse no filme.Coloque as bandas em frascos de cintilação de sete mililitros e adicione quatro mililitros de fluido de cintilação. Conte as bandas utilizando um contador de cintilação líquida. Confirme que o contador está ajustado para monitorar a janela correta do espectro de energia para fósforo-32.Prossiga para analisar os resultados conforme descrito no protocolo textual. Frações purificadas de ERK2 foram utilizadas em um ensaio de quinase com MBP na presença ou ausência de MEK1R4F, um estimulador constitutivamente ativo da atividade quinase de ERK2. Em um experimento semelhante, um ensaio de quinase de MBP foi utilizado para medir a atividade de mutantes recombinantes de ERK2 purificados de culturas bacterianas em relação à proteína selvagem.Embora a ERK2 tenha sido capaz de fosforilar MBP quando estimulada pela MEK1R4F, a atividade quinase da ERK2 é drasticamente abolida pela mutação da lisina catalítica ou de uma treonina próxima aos sítios canônicos de fosforilação dupla. As variantes ERK2 T188D e ERK2 T188E exibem atividade quinase marginal frente a um pequeno peptídeo flexível. No entanto, elas são incapazes de fosforilar robustamente os substratos conhecidos da ERK2, Nup153 e PDX1, como observado com a ERK2 do tipo selvagem.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um a dois dias, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar ATP radiomarcado para analisar a atividade de proteínas quinases, a fim de compreender melhor as redes de sinalização nas quais elas estão inseridas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar o protocolo de precipitação de aminoácidos para isolamento das quinases de interesse, a fim de considerar quantidades iguais de proteína, e de medir as concentrações da proteína recombinante para garantir comparações precisas da atividade quinase.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de sinalização celular explorarem vias de transdução específicas e seus papéis na regulação homeostática, bem como suas contribuições para a progressão de doenças. Não se esqueça de que trabalhar com materiais radioativos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

assaying-protein-kinase-activity-with-radiolabeled-atp

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Leucina Quinase Repita Rico 2 é uma quinase de vários domínios de grande porte, mutações em que são a causa genética mais comum da doença de Parkinson. Análise da atividade da proteína quinase tem provado ser uma ferramenta crucial na compreensão da biologia e disfunção desta proteína. Neste...

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

Este vídeo demonstra um ensaio enzimático baseado em cromatografia em camada fina para determinar a atividade da pirofosfoquinase usando nucleotídeos radiomarcados. O método fornece informações sobre a síntese de nucleotídeos e reações de fosfotransferência.

Ensaio de atividade enzimática baseado em cromatografia em camada fina: uma técnica para determinar a atividade da pirofosfoquinase in vitro usando cromatografia em camada fina

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Descrevemos um protocolo básico para quantificar a atividade da ATPase in vitro. Este protocolo pode ser otimizado com base no nível de atividade e requisitos para uma determinada ATPase purificada.

Medindo<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade ATPase para enzimática Caracterização

Relatamos e demonstramos um ensaio otimizado de ligação à nitrocelulose que pode ser usado para quantificar a autofosforilação de histidina quinases bacterianas purificadas. Nosso método tem várias vantagens sobre as técnicas tradicionais baseadas em SDS-PAGE, fornecendo uma alternativa valiosa para caracterizar essas importantes proteínas.

Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

Os ensaios de competição de péptidos são amplamente utilizados numa variedade de experiências moleculares e imunológicas. Este artigo descreve um método detalhado para um ensaio de quinase competitiva com oligopéptido in vitro e os procedimentos de validação associados, que podem ser úteis para encontrar locais de fosforilação específicos.

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [32P] rotulagem ATP.

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Aprenda a medir a atividade enzimática de proteínas quinases usando ATP radiomarcado. Este ensaio versátil e quantitativo auxilia na compreensão das vias de sinalização celular em pesquisas de bioquímica.

Ensaio da Actividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Explorar mais vídeos