Detecção da expressão de microRNA na Membrana Peritoneal de Ratos Usando PCR Quantitativa em Tempo Real

O objetivo geral deste procedimento é purificar e detectar com sucesso miRNAs na membrana peritoneal de ratos. Para iniciar este procedimento, após anestesia inalatória com isoflurano a 4%. Pulverize a pele abdominal do rato com 70% de etanol e monte-o na folha de cortiça, nas costas.

Em seguida, faça uma incisão longitudinal na pele abdominal, músculo e membrana peritoneal do animal usando tesoura e fórceps. Pegue a membrana peritoneal usando a pinça e faça incisões horizontais em sua porção superior ao longo da costela mais baixa sob o diafragma. E na parte inferior da região lateral usando a tesoura cirúrgica.

Em seguida, faça incisões longitudinais laterais para remover a membrana peritoneal do corpo, usando a tesoura cirúrgica. Em seguida, lave-o com PPS em uma placa de Petri. Recorte e apare 20 miligramas de amostra de membrana peritoneal.

Neste procedimento, coloque uma amostra de membrana peritoneal de 20 miligramas em um homogeneizador de vidro. E adicione 700 microlitros de reagente de lise à base de fenol guanidina. Depois disso, homogeneizar a amostra de membrana peritoneal no gelo, pressionando lentamente um pilão sobre a amostra com torção.

Repita este processo várias dezenas de vezes, até que a amostra da membrana peritoneal tenha se dissolvido completamente no reagente de lise à base de fenol guanidina. Para maior homogeneização, transfira o lisado homogeneizado para um sistema de trituração de biopolímero na coluna de centrifugação da microcentrífuga em um tubo de coleta de dois mililitros. Em seguida, centrifugue-o a 14.000 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, transfira o lisado homogeneizado para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione 140 microlitros de clorofórmio ao lisado homogeneizado e tampe o tubo com segurança. Em seguida, misture o tubo por inversão por 15 segundos.

Depois, incube a amostra por dois a três minutos em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue-o a 12.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira 300 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga, sem perturbar o precipitante.

E adicione 450 micro litros de etanol 100%. Em seguida, misture a amostra por vórtice por cinco segundos. Em seguida, pipete até 700 micro litros da amostra em uma coluna giratória à base de membrana de silicone, colocada em um tubo de coleta de dois mililitros, e feche a tampa.

Em seguida, centrifugue a 15.000 vezes G por 15 segundos. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de coleta. Em seguida, adicione 700 microlitros de tampão de lavagem 1 à coluna giratória à base de membrana de silicone para lavar rigorosamente a amostra e fechar a tampa.

Centrifugar a 15 000 vezes G durante 15 segundos. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de coleta. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem 2 à coluna giratória à base de membrana de sílica, para remover qualquer vestígio de sal, e feche a tampa.

Em seguida, centrifugue a 15.000 vezes G por 15 segundos. Após centrifugação, rejeitar o fluxo e o tubo de recolha e repetir este procedimento. Em seguida, centrifugue novamente a coluna de centrifugação à base de membrana de sílica a 15.000 vezes G por um minuto.

Após a centrifugação, descarte o tubo de coleta e qualquer fluxo. Coloque a coluna giratória à base de membrana de sílica em um novo tubo de coleta de um ponto e cinco mililitros. Em seguida, transfira 25 microlitros de água livre de RNase para a coluna e feche a tampa.

Deixar a amostra à temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugar a 15 000 vezes G durante um minuto. Em seguida, transfira o alouette de 25 microlitros contendo o RNA total para um novo tubo de microcentrífuga e armazene-o a 80 graus Celsius negativos antes de usar.

Neste procedimento, prepare uma solução master mix que contenha dois microlitros de mistura de ácido nucleico 10x, dois microlitros de mistura de transcriptase reversa e quatro microlitros de tampão Hispec 5x, para um total de 8 microlitros por tubo. Em seguida, dispense 8 microlitros da solução master mix em cada tubo. Meça a quantidade de RNAs totais usando um espectrofotômetro.

Em seguida, adicione um micrograma dos RNAs totais isolados, purificados da amostra da membrana peritoneal, a cada tubo. Em seguida, adicione água livre de RNase a cada tubo para levá-lo a um total de 20 microlitros. Em seguida, misture bem pipetando e centrifugue por 15 segundos.

Em seguida, incubar a amostra por 60 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, incube-o por cinco minutos a 95 graus Celsius. Transfira o cDNA recém-gerado para um novo tubo de microcentrífuga e dilua-o 10 vezes com água livre de RNase.

Neste procedimento, prepare um master mix contendo 12 vírgula cinco microlitros de 2x master mix de PCR, dois vírgula cinco microlitros de cinco micromolares de cada primer de miRNA dissolvido em água livre de nuclease e um vírgula dois cinco microlitros de primer universal 10x, para cada poço. Dispense 22 vírgula cinco microlitros desta mistura principal em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione dois vírgula cinco microlitros de cDNA molde a cada poço.

Sele a placa de reação de 96 poços com um pedaço de filme. Em seguida, centrifugar a 1 000 vezes G durante 30 segundos. Para executar o programa de ciclagem de PCR, coloque a placa no instrumento de PCR em tempo real.

No software de PCR em tempo real, defina as propriedades experimentais. Em seguida, atribua nomes às amostras e miRNAs alvo em cada poço. Em seguida, no software de PCR em tempo real, insira um volume de reação de 20 micro litros e as seguintes condições de ciclo de PCR de acordo com as instruções.

Pré-incubação a 95 graus Celsius por 15 minutos. E então 40 ciclos de desnaturação a 94 graus Celsius por 15 segundos, e ajoelhado a 55 graus Celsius por 30 segundos, e extensão a 70 graus Celsius por 30 segundos. Com base no miRNA, micro array, os níveis de seis miRNAs estão significativamente aumentados na membrana peritoneal de ratos com fibrose peritoneal, em comparação com aqueles em ratos simulados e ratos controle, usando QRTCPR, seguindo o protocolo apresentado neste manuscrito.