Name: In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Aprenda a avaliar a capacidade supressiva de subpopulações de células reguladoras em modelos de transplante cardíaco em ratos. Este protocolo in vitro e in vivo permite estudar a indução de tolerância imunológica.

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Este trabalho foi realizado no contexto do projeto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que é parte do programa de governo francês "Investissements d'Avenir" gerenciado pela ANR (ANR-11-LABX-0016-01) e pelo projeto IHU-Cesti financiado também pelo " Programa de governo francês investissements d'Avenir", gerido pelo francês nacional investigação agência (ANR) (ANR-10-IBHU-005). O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Métropole e Région Pays de la Loire.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Transferência adotiva de splenocytes total para um destinatário recentemente transplantada é uma maneira eficiente para detectar a presença de células reguladoras induzido ou potencializadas por um tratamento. Linfopenia transitória induzida por irradiação de anfitrião promove a sobrevivência da pilha após a transferência e o estabelecimento da tolerância. Além disso, a irradiação sub-letais deixa tempo para células com propriedades tolerogenic para converter para novas células reguladoras durante reconstituição imunológ...

Aloenxerto cardíaco em ratos é um modelo de transplante de órgão confiável para avaliar tratamentos de indução de tolerância, para decifrar os mecanismos de indução de tolerância e de manutenção e tem o potencial para induzir as células reguladoras funcionalmente competentes e dominantes. Os protocolos abaixo descrevem um totalmente incompatibilidade heterotópica cardíaca enxerto de um rato de doador de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) em um rato de destinatário Lewis 1A (LEW.1A, RT1um). Nesta combinação de enxerto, rejeição aguda ocorre rapidamente (em cerca de 7 dias) e pode ser facilmente avaliada pelo enxerto batendo medição através de palpação do abdômen. Aqui propomos três protocolos para induzir a tolerância para o aloenxerto cardíaca em ratos. Nestes modelos, tolerância é induzida e/ou mantida por tipos de diferentes células reguladoras. Primeiro, o bloqueio de CD40-CD40L interações com um adenovírus codificação CD40Ig (AdCD40Ig) induziu a geração de CD8+ Tregs capazes de induzir tolerância quando enviaram transferidos para destinatários secundários enxertados1. Além disso, a depleção de CD8 em destinatários AdCD40Ig-Tratado gerados Bregs e RegMCs2,+ células (com anticorpos anti-CD8α). Análise profunda de CD8+ Tregs Propriedades destacou o papel fundamental de várias moléculas de imunorreguladores definido como interleucina-34 (IL-34) e Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Considerando que a superexpressão de IL-34 (com um vetor de vírus adeno-associados) induzida por Tregs através de geração de RegMCs, superexpressão da FGL-2 induzida Bregs, subjacentes a complexa rede de células reguladoras.
Rejeição crônica se desenvolve lentamente e é a longo prazo, uma análise aprofundada é necessário para distinguir tolerância contra rejeição crônica. Enxerto é geralmente avaliado por infiltração celular, fibrose, espessamento da deposição de C4d vascular da parede e complemento por immunohistology7. Enquanto histologia métodos requerem o sacrifício de animais ou biópsia do enxerto, aqui nós descrevemos um método simples para avaliar diferentes características do aloenxerto tolerada: o surgimento e a função das células reguladoras e as respostas de anticorpos específicos antidoador de sangue amostra por citometria de fluxo (aqui, nós usamos a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação).
Manutenção da tolerância para o enxerto após a detenção do tratamento é geralmente associada com a indução de células reguladoras8. Nas últimas décadas, os estudos enfocaram CD4+Tregs caracteriza-se por unanimidade-los por marcadores de chave Foxp3+, CD25altae CD127–9,10,11. Da mesma forma, vários marcadores foram atribuídos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28-, CD45RCbaixo, PD1+e Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre os anos, a expressão de GITR, CTLA4 e citocinas (IL-10, 34-TGFβ, IL, IL-35, FGL-2) foram adicionalmente associados a um Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. No entanto, populações de células reguladoras emergentes, tais como Bregs, RegMCs ou NKTregs, faltam de marcadores específicos relevantes. Com efeito, Bregs principalmente são relatados como imaturo CD24+ células, com expressão de CD27 ambígua e, por vezes, produção de IL-10, TGFβ ou granzime B22,23,24. A complexidade da linhagem mieloide célula requer uma combinação de vários marcadores para definir seu perfil de regulamentar ou proinflammatory como CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a ou CD16325,26. Finalmente, alguns marcadores têm sido relatados para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, mas mais estudos são necessários para fenotipicamente eles descrever27,28,29 ,30,31,32. Assim, evidências de atividade supressiva são necessários para legitimar ainda mais descrição fenotípica para a identificação de novos biomarcadores, novos mediadores imunorreguladores e alargar o âmbito de aplicação de novas terapias celulares.
Propomos dois métodos complementares para avaliar a atividade supressora de células. Primeiro, o método em vitro consiste de células supressivas com células efetoras rotulada T estimuladas pelo doador alogênico células apresentadoras (APCs) em diferentes proporções ao longo de 6 dias de cultivo, e analisando o efetor proliferação de células T que reflete a imunossupressão doador-dirigido. Células de ratos tratadas podem ser comparadas diretamente às células de ingênuo ratos e ratos enxertados não tratados para atividade supressora (ou para qualquer outra população de celular regulamentar), em uma variação da proporção de supressor: effector. Além disso, este método não requer qualquer transplante, e os resultados são obtidos dentro de 6 dias. Em segundo lugar, o método na vivo consiste em transferir as células reguladoras pretendidas de um rato Tratado para um destinatário transplantado recentemente irradiado. Enquanto as células B, células mieloides ou T células de ratos não tratados ingênua são geralmente incapazes para inibir a rejeição aguda e para prolongar a sobrevivência do enxerto após transferência adotiva, células com atividade supressora potentiated de destinatários tratados têm esses atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia induzida pela irradiação do destinatário é recomendada para permitir que as células enviaram transferidas para ser afectada pela homeostase do sangue e dominar mais facilmente as respostas imunes do anti doadores. Para ambos os métodos, a utilização em vitro de alogênico de terceiros APCs ou na vivo transferência adotiva de supressiva células em destinatários enxertados com um coração de terceiros permitem análise da especificidade antidoador. Considerando que o método na vivo requer um número substancial de células, mal representado subpopulações de células podem ser mais facilmente avaliadas para atividade supressiva em vitro33.
Respostas humorais também podem ser medidas para avaliar o estado de tolerância e o controle de respostas de anticorpos direcionados aos antígenos do doador. Com efeito, a tolerância pode ser caracterizada por ausência de resposta humoral em direção o doador mas a conservação da capacidade para os destinatários desenvolver a resposta humoral a antígenos novos e preservação da memória respostas. Em primeiro lugar, o princípio da deteção de Alo-anticorpo baseia-se no reconhecimento de células do doador por destinatários anticorpos após incubação do tipo de célula do doador com soro de um destinatário enxertado. Respostas humorais, segunda dirigidas aos antígenos exógenos podem ser avaliada seguir estimulação de destinatários tolerantes a longo prazo com Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulsionado com adjutor de Freund completo. A presença de anticorpos IgM e IgG específicos contra antígenos pode ser detectada dias 4 e 13, respectivamente, após a imunização, com o ensaio de imunoabsorção ligado enzima (ELISA)34. Em terceiro lugar, a preservação da memória imune respostas pode ser avaliada pela injeção de xenogénicas células vermelhas do sangue (hemácias) em dias -7 e + 3 de transplante e hemácias coloração com destinatário soro coletado em dias + 8 e + 17 após o transplante. Todos estes métodos permitem a identificação de subtipos de imunoglobulinas usando anticorpos específicos do secundários e aquisição rápida dos resultados em menos de 1,5 h por FACS coloração ou algumas horas por ELISA.
Finalmente, esses protocolos são projetados para a caracterização de modelos de transplante e podem ser, em certa medida, aplicada aos modelos de doença auto-imune. Os princípios do método podem ser transpostos para todas as espécies.

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEW.1W e ratos LEW.1A</td><td>Janvier Labs, França</td><td></td><td>8 semanas de idade,&nbsp;</td></tr><tr><td>Ratos doadores terceirizados da BN</td><td>Janvier Labs, França</td><td></td><td>8 semanas de idade,&nbsp;</td></tr><tr><td>name</td><td>company</td><td>número de catálogo</td><td>comments</td></tr><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AdCD40Ig</td><td>Núcleo de vetor viral, INSERM UMR 1089, Nantes, França</td><td></td><td>plasmídeos caseiros</td></tr><tr><td>IL34-AAV</td><td>Núcleo de vetor viral, INSERM UMR 1089, Nantes, Plasmídeos</td><td>caseiros</td>da França <td></td></tr><tr><td>FGL2-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, França</td><td></td><td>plasmídeos caseiros</td></tr><tr><td>anti-TCRab</td><td>Hibridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clone R7 / 3</td><td>Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-CD25</td><td>Hiridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clone</td> <td>OX39Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>Hibridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clone OX8</td><td>Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-CD45RA</td><td>Hibridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clone OX33</td><td>Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-CD161</td><td>Hibridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>3.2.3 clone</td><td>Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-CD11b / c</td><td>Hibridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clone OX42</td><td>Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-TCRgd</td><td>Hibridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clone</td> <td>V65Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-CD45RC</td><td>Hibridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clone OX22</td><td>Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-CD4</td><td>Hibridoma da Coleção Europeia de Cultura de Células, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clone OX35</td><td>Cultura caseira, purificação e acoplamento de fluororóforo</td></tr><tr><td>anti-CD45R</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td> <td># 554881, clone</td><td></td>His24</tr><tr><td>anti-rato IgG-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, EUA</td> <td># 112-096-071</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato IgG1</td><td>Serotec</td><td>#MCA 194</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato IgG2a</td><td>Serotec</td><td>#MCA 278</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato IgG2b</td><td>Serotec</td><td>#MCA 195</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato IgM-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, EUA#</td><td>115-095-164</td><td></td></tr><tr><td>estreptavidina HRP</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554066</td><td></td></tr><tr><td>KLH</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, EUA#</td><td>9013-72-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td></td><td>Solução Tampão de Fosfato sem cálcio e magnésio,&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td>#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reagentes de substrato TMB</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#555214</td><td></td></tr><tr><td>CellTraceTM Kit de proliferação celular CFSE</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EUA</td><td></td><td></td></tr>#C34554 <tr><td>RPMI 1640 medium 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EUA#</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>penicilina estreptomicina</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Buffer</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EUA#</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos não essenciais</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EUA#</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EUA#</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>2 beta mercaptoetanol</td><td>Sigma, Saint-Louis, EUA</td><td></td><td></td></tr>#M3148 <tr><td>Corante de Proliferação Celular eFluor&reg; 450 Cell</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EUA#</td><td>65-0842-85</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr>#G3126 <tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EUA</td><td></td><td></td></tr>#D1306 <tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics, Alemanha</td><td>#11088882001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint-Louis, EUA</td><td></td><td></td></tr>#E5134 <tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>#B230561</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads magnéticos</td><td>Dynal, Invitrogen</td><td>#11033</td><td>Goat anti-mouse IgG</td></tr><tr><td>One Comp eBeads</td><td>Ebiosciences, San Diego, EUA</td><td>#01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Consulte as diretrizes</td><td></td><td></td>institucionais</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Consulte as diretrizes</td><td></td><td></td>institucionais</tr><tr><td>Naplbuphine</td><td>Consulte as diretrizes</td><td></td><td></td>institucionais</tr><tr><td>Terramicina</td><td>Consulte as diretrizes institucionais</td> Buprenorfina Consulte as diretrizes <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>institucionais diretrizes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Consulte as diretrizes</td><td></td><td></td>institucionais</tr><tr><td>Adjuvante</td><td></td><td></td><td></td>completo de Freund</tr><tr><td>Rompun</td><td>Consulte as diretrizes</td><td></td><td></td>institucionais</tr><tr><td>Ringer lactato</td><td>Consulte as diretrizes</td><td></td><td></td>institucionais</tr><tr><td>Cetamina</td><td>Consulte as diretrizes institucionais</td><td></td><td></td></tr><tr>Solução <td></td><td></td> de <td>lise de glóbulos vermelhos</td><td>Diluir 8,29g de NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, EUA A-9434), 1g de KHCO3 (Prolabo 26 733.292) e 37,2mg de EDTA (Sigma, Saint-Louis, EUA E5134) em 800ml de H2O. Ajuste o pH para 7,2-7,4 e complete para 1L com H2O.</td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td></td><td></td><td>Diluir 1g de colagenase em 500 ml de RPMI-1640 + 5 ml de Hepes + 2% FCS</td></tr><tr><td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0,5%)</td><td></td><td></td><td>Adicionar 5 mL de EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, EUA E5134) e 20ml de FCS a 1ml de PBS 1X</td></tr><tr><td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td><td></td><td></td><td>Diluir 50&micro; g (=1 frasco) de CFDA SE (componente A) em 90&mu; l Solução de DMSO (componente B) para obter uma solução de estoque de 10mM. Em seguida, dilua a solução estoque a 1/20.000 em PBS 1X para obter um 0,5&mu; Solução</td></tr><tr><td>M meio completo para cocultura</td><td></td><td></td><td>500ml de meio RPMI-1640 completo com 5 ml de penicilina (80 unidade/ml)-estetomicina (80 mg/ml), 5 ml de L-glutamina, 5 ml de aminoácidos não essenciais (100X), 5ml de piruvato de sódio (100mM), 5 ml de tampão HEPES (1M), 2,5 ml de mercaptometanol b (7 ml de estoque de 2-bmercaptoetanol diluído em 10 ml de RPMI), 10% FCS</td></tr><tr><td>name</td><td>company</td><td>número de catálogo</td><td>comments</td></tr><tr><td>equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon 50ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#227261</td><td></td></tr><tr><td>falcon 15ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#188271</td><td></td></tr><tr><td>peneira</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning pratos de cultura de plástico</td><td>VWR, Pessac</td><td>#391-0439</td><td></td></tr><tr><td>100&micro; m e 60&micro; m filtros de tecido</td><td>Sefar NITEX, Heiden, Suíça</td>#<td>03-100/44 e #03-60/35</td><td></td></tr><tr><td>96 poços Placas de fundo em U para cocultura</td><td>&nbsp; Placa de cultura de tecidos com fundo em U Falcon, estéril, Corning</td><td>#353077</td><td></td></tr><tr><td>96 poços Placas de fundo em V para coloração FACS</td><td>ThermoScientifique, Danemark</td><td>#249570</td><td></td></tr><tr><td>Placas ELISA de fundo plano de 96 poços</td><td>Nunc Maxisorb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>serengue para esmagamento do baço</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#309649</td><td></td></tr><tr><td>leitor ELISA</td><td>SPARK 10M, Tecan, Suíça</td><td>SPARK 10M, Tecan, Suíça</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>banho-maria&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiador de raios X</td><td>Lincolshire, Inglaterra</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>agitador</td><td></td><td></td><td></td>solar</tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ímã</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EUA</td><td>12302D</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo de avaliação da atividade supressiva, t, b e células mieloides e respostas humoral de pacientes transplantados

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

A principal preocupação no transplante é alcançar tolerância específica através da indução de células reguladoras. A compreensão dos mecanismos de tolerância requer modelos confiáveis. Aqui, descrevemos modelos de tolerância ao enxerto cardíaco em ratos, induzido pelo bloqueio dos sinais costimulation ou upregulation das moléculas imunorreguladores, através da transferência de genes. Cada um desses modelos permitidos na vivo a geração de células reguladoras, tais como pilhas de T reguladoras (Tregs), células B regulamentares (Bregs) ou células mieloides regulamentares (RegMCs). Este manuscrito, descrevemos dois protocolos complementares que foram usados para identificar e definir a atividade das células reguladoras in vitro e in vivo para determinar a sua responsabilidade na indução de tolerância e manutenção. Primeiro, um ensaio supressiva em vitro permitiu a rápida identificação de células com capacidade supressiva sobre efetoras imune respostas de forma dose-dependente e pode ser usado para uma análise mais aprofundada como medição de citocinas ou citotoxicidade. Em segundo lugar, a transferência adotiva de células de um destinatário Tratado tolerante para um destinatário transplantado recentemente irradiado, destaque as propriedades de tolerogenic dessas células em respostas imunes de enxerto dirigido de controlo e/ou convertendo novas células reguladoras ( denominado tolerância infecciosa). Esses métodos não são restritos às células com marcadores fenotípicos conhecidos e podem ser estendidos para qualquer população celular. Além disso, o doador dirigido allospecificity de células reguladoras (uma meta importante no campo) podem ser avaliados usando células de doador de terceiros ou do enxerto em vitro ou na vivo. Finalmente, para determinar a capacidade de tolerogenic específicos destas células reguladoras, nós fornecemos protocolos para avaliar as respostas humoral anticorpo antidoador e a capacidade do destinatário para desenvolver respostas humorais contra antígenos conhecidos novos ou antigos. Os modelos de tolerância descrito podem ser usados para caracterizar mais células reguladoras, para identificar novos biomarcadores e imunorreguladores moléculas e são adaptáveis a outros modelos de transplante ou doenças auto-imunes em roedores ou humanos.

A avaliação da atividade supressora seguindo a classificação da APCs (Figura 1), células do Respondente e Tregs simultaneamente (Figura 2), ou individualmente (Figura 4), e qualquer outras putativos regulamentar as células (Figura 3), pode ser feito na vivo por injecção directa das células reguladoras e em vitro por medida do brilho CFSE (<strong class=...

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

A indução de tolerância em transplantes está frequentemente associada ao surgimento de uma população de células reguladoras. Ausência de resposta imune contra o doador, mas preservação da imunidade contra antígenos exógenos. Dispomos de diferentes protocolos para avaliar in vitro e in vivo a capacidade supressora de qualquer subconjunto de células reguladoras e o estado das respostas humorais do hospedeiro.Anestesie uma rata Lewis doadora de 1W usando inalação de isoflurano com O2 suplementado com N2O a 1% após cinco minutos. Posicione o animal em decúbito dorsal e desinfete o abdômen com betadine para realizar uma toracotomia. Prenda a veia cava inferior e a veia cava superior com clamps, faça ligaduras e, em seguida, corte-as.Em seguida, corte a artéria pulmonar e a aorta e conserve o enxerto em NaCl 0,9% gelado. Anestesie uma rata receptora Lewis 1A de 150 gramas com oito a 12 semanas usando inalação de isoflurano em O₂ suplementada com N₂O a 1%. Deite o animal em decúbito dorsal e desinfete o abdômen com betadine para realizar laparotomia cefalopúbica. Exteriorize os intestinos, clamp as artérias abdominais. Realize uma anastomose lateral terminal entre a aorta enxertada e a ao

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Tregs são potentes supressores do sistema imune. Há uma falta de marcadores de superfície única para defini-los, portanto, definições de Tregs são principalmente funcionais. Aqui nós descrevemos um...

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O transplante de medula óssea murina é uma técnica amplamente utilizada para estudar os mecanismos imunológicos que regem enxerto-versus-hospedeiro da doença em seres humanos. A capacidade de monitorar padrões de tráfico de células...

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Descreve-se um ensaio de diagnóstico potencialmente valiosa, que pode ser utilizada para decidir a retirada da imunossupressão após transplante sem risco elevado de rejeição do enxerto. O ensaio utiliza os princípios do tipo hipersensibilidade cutânea tardia e fornece uma avaliação precisa do dador respostas imunes efetoras e reguladoras específicas montadas pelos destinatários.

Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

A capacidade de monitorar as respostas das células T em detalhe, in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune. Aqui nós descrevemos o uso de matrizes alvo fluorescentes (ACL) em um ensaio in vivo de células T em que avalia&gt; 250 parâmetros simultaneamente por citometria de fluxo.

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

Este artigo descreve um método para medir a aloreactividade numa população mista de células T utilizando citometria de fluxo de imagem.

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.

Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

Esse protocolo fornece uma estratégia de co-cultura in vitro para investigar os efeitos das células T reguladoras na proliferação e diferenciação das células T efetoras.

In Vitro Análise Funcional de Células T Reguladoras: Foco na Proliferação e Diferenciação

Aprenda a avaliar a capacidade supressiva de subpopulações de células reguladoras em modelos de transplante cardíaco em ratos. Este protocolo in vitro e in vivo permite estudar a indução de tolerância imunológica.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados (Vídeo) | JoVE Journal

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

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