Um método versátil de padronização proteínas e células

O objetivo geral deste procedimento é padronizar células ou substratos, distribuindo-os em microcanais complexos longos e fechados usando ferramentas simples de bancada disponíveis na maioria dos laboratórios biológicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia em relação às interações célula a célula e célula a proteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de executar e requer apenas ferramentas prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios biológicos.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque requer otimização das condições de incubação das células e substratos escolhidos pelo pesquisador. A demonstração visual desse método é crítica, pois a colocação adequada do carimbo e da solução PDMS melhora significativamente a reprodutibilidade do experimento. Comece desenhando o layout do microcanal usando uma ferramenta de desenho CAD.

Em seguida, imprima o desenho em papel branco. Em seguida, use isopropanol para limpar uma lâmina de vidro grande o suficiente para acomodar o design. E então seque o slide com uma pistola de ar.

Prenda fita adesiva na lâmina de vidro limpa, tomando cuidado para não prender bolhas de ar. Em seguida, cole as laterais do slide de vidro no papel com o desenho, de modo que o lado da fita fique voltado para cima. Use um bisturi para cortar a fita na lâmina de vidro, usando o desenho do papel como referência.

Depois de cortado, retire a fita das áreas indesejadas da lâmina de vidro. Em seguida, enxágue a lâmina de vidro com isopropanol para remover qualquer adesivo residual. E então use uma pistola de ar para secar a superfície.

Depois de padronizado e limpo, asse a lâmina de vidro em um forno a 65 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, role suavemente sobre a fita com um rolo de borracha, para remover as bolhas de ar e permitir que a lâmina esfrie até a temperatura ambiente em uma placa de Petri. Comece misturando 10 partes de um elastômero PDMS com 1 parte de seu agente de cura e mexa a mistura vigorosamente.

Em seguida, coloque a mistura em uma câmara de vácuo para desgaseificar a mistura até que não haja mais bolhas de ar. Despeje uma camada de 2 mm de espessura da mistura no molde de fita adesiva e desgaseifique o molde até que todas as bolhas de ar desapareçam. Depois de resfriado, use um bisturi para cortar a camada PDMS a pelo menos 5 mm de distância dos recursos.

E então, retire o PDMS curado do molde usando uma pinça. Faça um único orifício de entrada com um punção de biópsia de 1 mm, de preferência no final de uma rede de microcanais. Em seguida, limpe o molde PDMS com fita adesiva, para remover partículas de poeira do dispositivo.

Esterilize o dispositivo de microcanal PDMS enxaguando-o com uma solução de 70% de ehtanol, seguido de água deionizada estéril, e exponha-o à luz ultravioleta por 30 minutos. Use uma pinça para colocar o molde PDMS estéril em uma lamínula de vidro estéril e aplique uma leve pressão usando a ponta da pinça. Em seguida, coloque uma gota de poli d lisina em tampão tetraborato de sódio na entrada dos microcanais.

Coloque a placa de Petri sob vácuo por 10 minutos. Durante esse tempo, observe o ar saindo do canal na forma de bolhas. Solte o vácuo e observe a solução de substrato fluindo para o microcanal Incube o prato a 37 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, retire cuidadosamente o carimbo PDMS usando uma pinça estéril e lave o padrão três vezes com água deionizada. Adicione uma solução de 1% BSA à lamínula de vidro, para reduzir a adesão não específica, e incube a amostra durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, aspire a solução BSA.

Para iniciar a padronização indireta das células, prepare uma suspensão celular em meio de cultura livre de soro, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Adicione a suspensão celular à placa de Petri padronizada, submergindo completamente a região padronizada na suspensão celular. Em seguida, incube a placa de Petri a 37 graus Celsius em uma incubadora por 15 minutos para permitir que as células se fixem ao substrato padronizado.

Após a incubação, aspire o excesso de suspensão celular da placa de Petri e lave as células padronizadas três vezes com PBS, agitando suavemente por dez segundos para remover as células soltas. Em seguida, adicione o meio de cultura apropriado às culturas de células padronizadas e incube as células padronizadas a 37 graus Celsius em uma incubadora tamponada com dióxido de carbono. Para a padronização direta das células, primeiro, esterilize o dispositivo microfluídico enxaguando-o com uma solução de etanol a 70% seguido de água deionizada.

Em seguida, mergulhe o dispositivo durante a noite em uma solução de 1% BSA para evitar a adesão de células não específicas ao PDMS. Seque o dispositivo em temperatura ambiente e prenda-o no fundo da placa de Petri tratada com cultura de tecidos. Coloque 4 a 8 microlitros da suspensão celular, o suficiente para preencher os microcanais, na entrada, cobrindo completamente o orifício.

Em seguida, coloque a placa de Petri em uma câmara de vácuo por 10 minutos. Libere o vácuo e observe a suspensão celular fluindo para o microcanal. Incube a placa de Petri a 37 graus Celsius em uma incubadora tamponada com dióxido de carbono, por até uma hora.

Em seguida, retire o prato da incubadora e use uma pinça para retirar cuidadosamente o PDMS do prato. Lave o padrão com PBS e, em seguida, adicione meios de cultura de células à placa de Petri. Quando terminar, coloque as células de volta na incubadora.

Aqui são mostrados neurônios corticais embrionários de ratos padronizados em superfícies de poli d lisina e laminina. A localização das células demonstra aderência geral às áreas padronizadas e crescimento ao longo das listras de PDL e laminina. Mostrados aqui, em uma ampliação maior, estão os mioblastos C2C12.

Este tipo de célula também adere às áreas padronizadas e demonstra fusão em miotubos multinucleados. Esta técnica também foi adaptada para padronização celular direta, mostrada aqui com fibroblastos. Este método de padronização celular direta não tem efeito adverso na sobrevivência celular.

Após esse procedimento, outros métodos, como a microscopia fluorescente, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais envolvendo localização de proteínas ou interações célula-substrato. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a colocação adequada da gotícula de células ou solução de substrato para cobrir todo o inlay é fundamental para o sucesso. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem a orientação do axônio fotorreceptor na biologia da retina.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como padronizar células e substrato com dispositivos microfluídicos PDMS permeáveis a gás usando pressão negativa. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.