Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

O objetivo geral deste experimento é fornecer um método eficiente e facilmente interpretável para detectar a localização subcelular e a internalização de proteínas de fusão GPCR expressas em células de mamíferos. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo de localização de proteínas subcelulares, como internalização e reciclagem de receptores. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada com facilidade e eficiência.

Portanto, esse método pode fornecer informações sobre o monitoramento e a localização de GPCRs. E também pode se aplicar a outros sistemas, como proteínas citoplasmáticas e nucleares. Depois de recuperar e passar as células HEK293 de acordo com o protocolo de texto, quando as células crescerem até quase a confluência, descarte o meio de crescimento equilibrado, adicione dois mililitros de PBS e gire o prato para lavar as células.

Descarte o PBS e adicione um mililitro de tripsina EDTA. Para digerir completamente as células, gire cuidadosamente o prato e aspire a solução. Em seguida, coloque o prato nesta incubadora de C02 com camisa de água a 37 graus Celsius por três minutos.

Enquanto as células estão incubando, prepare uma placa de seis poços adicionando dois mililitros de meio de crescimento equilibrado a cada poço. Então, quando as células forem levantadas do fundo do prato, adicione um mililitro de meio de crescimento equilibrado ao prato. Misture pipetando e transfira imediatamente 0,1 mililitros de suspensão celular para cada poço da placa de seis poços preparada.

Pipete suavemente a suspensão nos poços e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2. No dia seguinte, certifique-se de que as células sejam 85-95% confluentes. Em seguida, a dois tubos de microcentrífuga estéreis, adicione três microgramas de DNA de plasmídeo e 100 microlitros de meio de soro reduzido a um tubo.

Enquanto isso, adicione nove microlitros de reagente um e 100 microlitros de meio de soro reduzido a outro tubo. Incube os tubos em temperatura ambiente por cinco minutos. Combinar a mistura de plasmídeos diluídos com o reagente diluído.

Em seguida, misture delicadamente a solução e incube-a em temperatura ambiente por 20 minutos. Aspire o meio das células e adicione 1,5 mililitros de DMEM fresco sem FBS. Em seguida, adicione gota a gota 215 microlitros de mistura de reagente de transfecção de DNA a cada poço e misture delicadamente girando a placa.

Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por quatro a oito horas. Em seguida, substitua o meio por DMEM novo com 10% FBS. Incube as células por mais 24 a 48 horas antes de executar qualquer experimento.

A eficiência da transfecção pode variar muito em diferentes linhagens celulares. Portanto, a otimização do sentar e esfaquear na deposição pode ser necessária dependendo do tipo específico de célula usado. Remova o meio de crescimento da placa de cultura de seis poços.

Em seguida, use um mililitro de PBS para lavar a monocamada de células. Adicione 0,5 mililitros de tripsina EDTA, agite o prato e aspire a solução. Em seguida, incube a placa de cultura a 37 graus Celsius por três minutos.

Durante a incubação, insira lamínulas estéreis de 15 milímetros de diâmetro em cada poço de uma placa de 12 poços. Ressuspenda as células em um pequeno volume de meio de crescimento completo fresco e transfira o número necessário de células para a placa de 12 poços com lamínulas. Em seguida, incube as células por 16 a 24 horas.

Após 16 a 24 horas de incubação, quando as células crescerem até quase a confluência, adicione cinco micromolares do endro da sonda de membrana a cada poço e coloque as células de volta na incubadora por 30 minutos. Remova o meio de crescimento equilibrado e use PBS frio para lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione um mililitro de 4% de PFA a cada poço e agite as células por 15 minutos para fixá-las.

Com PBS, lave as células fixas duas vezes, adicione 200 a 300 microlitros de DAPI a cada poço e incube a placa por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar as células com PBS duas vezes, remova cuidadosamente as lamínulas da placa e retire o excesso de buffer. Inverta as lamínulas em lâminas de microscópio carregadas com uma gota de meio de montagem.

Em seguida, remova o excesso de meio de montagem das lâminas. Usando células que cresceram até perto da confluência, remova o meio de crescimento equilibrado e adicione DMEM fresco e aquecido. Incube as células por uma hora.

Trate as células com diferentes concentrações de ligante por 30 minutos. E trate as células com 10 elevado a seis ligantes molares negativos para os diferentes tempos mostrados aqui. Use PBS frio para lavar as células duas vezes e, em seguida, adicione um mililitro de 4% de PFA em PBS a cada poço, antes de agitar suavemente as células por 15 minutos.

Depois de lavar as células duas vezes em PBS, remova cuidadosamente as lamínulas dos poços da placa e monte-as conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Para realizar a microscopia confocal, ligue o hardware do microscópio confocal, incluindo a alimentação da lâmpada de mercúrio, o microscópio do PC, o scanner e o laser. Inicie o software, verifique a configuração e selecione o laser.

Ligue as diferentes unidades do sistema de microscopia confocal de acordo com as instruções. Coloque uma lâmina preparada na platina do microscópio e use o controlador da platina para posicionar a amostra sobre a lente objetiva. Para uma lente de imersão em óleo, adicione uma gota de óleo de cedro à lamínula e oriente a lâmina com uma lamínula voltada para a lente.

Em fluorescência, encontre as células de interesse, mude para o modo de varredura e escolha a potência do laser e a faixa espectral do fluoróforo de emissão. Capture imagens de alta qualidade ajustando a intensidade do laser e outros parâmetros. Esta figura ilustra a expressão de pEGFP-N1 em células HEK293.

O sinal GFP foi detectado no citoplasma e no núcleo. A localização subcelular em células HEK293 de receptores de hormônio liberador de gonadotrofina de S-Japonica, ou SjGnRHR, é mostrada aqui. Os receptores EGFP estão em verde e a coloração Dil, que destaca a membrana celular, está em vermelho.

Os receptores são vistos localizando-se na membrana plasmática. Para visualizar a internalização de SjGnRHRs, as células foram tratadas com hormônio liberador de gonadotrofinas em diferentes concentrações. Como visto aqui, a internalização dos receptores ocorreu de maneira dose-dependente, e o receptor foi completamente internalizado da superfície da célula com o ligante molar de 10 a menos seis.

Quando tratados com 10 elevado a menos seis ligantes molares por diferentes períodos de tempo, os SjGnRHRs internalizados foram detectáveis 10 minutos após a simulação do agonista, e a internalização extrema ocorreu por 60 minutos. Conforme demonstrado em células HEK293, em ambos os experimentos, a proteína de fusão fluorescente SjGnRHR EGFP localizava-se principalmente na membrana plasmática e foi dramática e rapidamente internalizada nas células. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as células sob as condições certas, sem contaminação por bactérias, fungos e micoplasma.

Seguindo este procedimento, métodos como verificação celular e imobilização podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como a segunda na passagem V dos receptores de proteína. Após cada desenvolvimento, a tecnologia abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular e bioquímica explorarem a localização e a internalização de receptores transmembranares em várias linhagens celulares.