Name: Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a detectar a internalização de receptores acoplados à proteína G em células HEK293 usando microscopia confocal. Este método eficiente permite visualizar a localização subcelular e dinâmica de proteínas de fusão GPCR em mamíferos.

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Os autores deste artigo gostariam de agradecer ao Prof. Jiayan Xie pela assistência técnica e uso do equipamento. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41406137).

1. Preparação de células <ol><li> recuperação de células <ol><li> Transferir as células criopreservadas 293 de rim embrionio humano (HEK293) a partir de um tanque de azoto líquido para um banho de água a 37 ° C e agitar continuamente durante 1-2 min. </li><li> Adicionar 10 mL de meio de crescimento equilíbrio nas (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% de soro de bovino (FBS), e 1% de solução de penicilina-estreptomicina fetal) para uma placa de cultura celular de 10 cm. Delicadamente adicionar as células descongeladas ao meio de crescimento equilibrado. </li><li> Incubar as células em uma jaqueta de água incubadora de CO2 a 37 ° C com uma atmosfera humidificada contendo 95% de ar e 5% de CO 2 durante 2-4 h. </li><li> Depois de 2 - 4 h, verificar que as células são ligadas. Substituir o meio de crescimento e equilibrada de cultura por outro 24-48 h. NOTA: A alteração do meio de crescimento equilibrada é útil porque remove sulfóxido de dimetilo (DMSO) e protege contra os danos celulares. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; passagem celular <ol><li> Depois de 24 - 48 h, quando as células foram cultivadas até à confluência perto, descartar o meio de crescimento equilibrada e lavar as células com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Agitar o prato delicadamente. </li><li> Descartar o PBS e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA (solução salina, 0,25% de tripsina e 0,02% de EDTA). Para digerir completamente as células, rodar o prato cuidadosamente e aspirar para fora da solução de tripsina-EDTA. Colocar o prato no 37 ° C, com camisa de água incubadora de CO 2 durante 3 min. NOTA: Durante este período, preparar três novas placas de cultura celular de 10 cm e adicionar 10 mL de meio de crescimento equilibrado a cada um. </li><li> Usando um microscópio de luz, determinar se as células de ter levantado a partir do fundo do prato. Adicionar 2 mL de meio de crescimento equilibrada ao prato. Misturar por pipetagem e pipetar imediatamente 0.6 ml da suspensão de células a cada uma das novas pratos. Misturar suavemente por pipetagem e permitir que as células a incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li&gt; </ol> Sementeira 2. celular <ol><li> Depois de 24 - 48 h, quando as células foram passadas cultivadas até à confluência perto, descartar o meio de crescimento equilibrada e lavar as células com 2 ml de PBS. Agitar o prato delicadamente. </li><li> Descartar o PBS e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA. Para digerir completamente as células, rodar o prato cuidadosamente e aspirar para fora da tripsina-EDTA. Colocar o prato no 37 ° C, com camisa de água incubadora de CO 2 durante 3 min. NOTA: Durante este período, preparar uma placa de 6 poços por adição de 2 mL de meio de crescimento equilibrado a cada poço. </li><li> Adicionar 1 mL de meio de crescimento equilibrada ao prato, se, sob observação microscópica, as células de ter levantado a partir do fundo da placa. Misturar por pipetagem e imediatamente pipetar 0,1 ml de suspensão de células (o volume é ajustado de acordo com a densidade de crescimento de células) para cada poço da placa de 6 poços preparado (placa de células-menos de 6 poços com 2 mL de meio de crescimento equilibrada). Misturar suavemente por pipetagem e permitir que as células-se a incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> Transfecção 3. celular <ol><li> Um método de transfecção, com as formulações de lipossomas NOTA: Por favor, veja a tabela de materiais de reagente de transfecção 1. <ol><li> No dia seguinte, assegurar que as células devem ser 85 - 95% confluentes. </li><li> Adiciona-se 3 ug de ADN de plasmídeo (500 ng / mL) e 100 de meio de soro reduzido para um tubo de microcentrífuga estéril, e misturar suavemente. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 9 mL do Reagente 1 e 100 de meio de soro reduzido em um outro tubo de microcentrífuga, e misturar suavemente. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Combinar a mistura plasmídeo diluída com reagente diluído 1 (volume total = 215 ul). Misturar suavemente e incuba-se durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> meio aspirado a chapa de células cultivadas, e adicionar 1,5 ml de DMEM fresco sem FBS. </li><li> Adicionar 215 uL de ADN-transfmistura reagente a cada exão, gota a gota bem, e misturar suavemente por agitação da placa. </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 4-8 h. Substituir com DMEM fresco com 10% de FBS. </li><li> Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante mais 24 - 48 h antes da execução de todas as experiências. </li></ol></li><li> Método de transfecção 2, com as formulações de lipossomas NOTA: Por favor, veja a tabela de materiais de reagente de transfecção 2. <ol><li> Adicionar meio de soro de 2 ug de ADN de plasmídeo (500 ng / ml), 4 ul de Reagente 2 e 100 uL reduzidos para um tubo de microcentrífuga estéril. Misturar suavemente e incuba-se durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar a mistura de transfecção para as células de um modo gota a gota. </li><li> Após a transfecção, as células incubar durante 24 - 48 h a 37 ° C e CO2 a 5%, antes da execução de todas as experiências. </li></ol></li></ol> 4. Cultura de Células em lamínulas <ol><li> Rémover o meio de crescimento a partir da cultura da placa de 6 poços. </li><li> Lavar a monocamada de células com 1 ml de PBS sem cálcio e magnésio. </li><li> Adicionar 0,5 ml de tripsina-EDTA. Agitar o prato com cuidado e aspirar off tripsina-EDTA. Incubar a placa de cultura durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. O tempo de incubação real varia de acordo com a linha celular utilizada. NOTA: Durante este período, preparar uma nova placa de 12 poços e adicionar 15 mm de diâmetro tampa estéril desliza para cada poço. As lamelas revestidas com lisina, laminina, colagénio ou podem melhorar a fixação das células para células HEK293 que se desprendem facilmente. </li><li> Quando as células são separadas, adicionar um meio de crescimento completo ml pré-aquecido a cada poço. Misturar por pipetagem e transferir imediatamente o número necessário de células para a placa de 12 poços com lamelas. Adicionar meio de crescimento completo e fresco a cada poço para ajustar o volume total para 1 mL </li><li> Incubar as células durante 16 - 24 h a 37 ° C e CO2 a 5%. NOTA: Depois de 30 -60 min, a maioria das células vai ter aderido às lamelas estéreis. </li></ol> 5. confocal Detecção de Microscopia <ol><li> localização celular <ol><li> Depois de 16 - 24 h, quando as células foram cultivadas até à confluência em perto as lamelas estéreis na placa de 12 poços, adicionar a sonda de membrana, DII, a cada poço, dando uma concentração final de 5 uM. Permitir que as células a incubar durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Após 30 min, remover o meio de crescimento equilibrada e lavar as células duas vezes em PBS frio (2-8 ° C). </li><li> Fixar as células por adição de 1 mL de uma solução de paraformaldeído a 4% (em PBS) a cada poço. Agitar suavemente durante 15 min. Cuidado: O paraformaldeído é moderadamente tóxica por contacto com a pele ou por inalação, e designada como um provável carcinógeno humano. Produtos químicos exaustores, recintos ventilados de equilíbrio ou de outras medidas de protecção deve ser utilizado durante o tratamento de pesagem e de paraformaldeído. &lt;/ Li&gt; <li> Lavam-se as células fixadas duas vezes em PBS. Adicionar 200-300 mL de DAPI (4&#39; , 6-diamidino-2-fenilindol) solução (0,5 ug / mL) a cada poço e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS. Cuidadosamente remover as lamelas a partir da placa e pavio o excesso de PBS. Inverta em lâminas de microscópio carregados com uma gota de meio de montagem (50% v / v de glicerol / água). Retire o excesso de meio de montagem dos slides. </li></ol></li><li> internalização celular <ol><li> Depois de 16 - 24 h, quando as células foram cultivadas até à confluência em perto as lamelas estéreis na placa de 12 poços, remover o meio de crescimento equilibrada e adicionar fresco, meio DMEM aquecido (37 ° C). Incubar as células durante 1 h a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Tratar as células com diferentes concentrações (0, 10 -12, 10 -9, e de 10 -6 M) de ligando durante 30 min e tratá-los com 10 -6 M de ligando para diferentes tempos (0,10, 30, e 60 min). </li><li> Lavar as células duas vezes em PBS frio (2-8 ° C). Fixar as células por adição de 1 mL de uma solução de paraformaldeído a 4% (em PBS) a cada poço. Agitar suavemente durante 15 min. </li><li> Lavar as células duas vezes em PBS. Cuidadosamente remover as lamelas a partir da placa e pavio fora o excesso de PBS. Inverta em lâminas de microscópio carregados com uma gota de meio de montagem (50% v / v de glicerol / água). Retire o excesso de meio de montagem dos slides. </li></ol></li><li> microscopia confocal <ol><li> Ligue o hardware de microscópio confocal, incluindo a potência da lâmpada de mercúrio, PC microscópio, scanner e laser. Entre para conta do sistema operacional, o lançamento do software, verifique a configuração e selecione laser. Ligue as diferentes unidades de sistema de microscopia confocal na ordem de acordo com as instruções. </li><li> Colocar as lâminas preparadas no palco microscópio. Coloque a amostra sobre a lente objetiva usando o controlador palco. Adicione uma gota de óleo de cedro ema lamela, quando a lente de imersão em óleo é seleccionado. Coloque as lamínulas em lâminas de frente para a lente. </li><li> Encontrar as células de interesse sob a microscopia fluorescente. </li><li> Alternar para o modo digitalizar. Escolha a potência do laser e a faixa espectral do fluoróforo emissões. Capturar as imagens confocal de alta qualidade por intensidade do laser de afinação e outros parâmetros. </li></ol></li></ol>

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<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%2C+dually+couples+to+the+G%28q%29+and+G%28s%29+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li>
<li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+Characterization%2C+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O protocolo aqui apresentado fornece um método eficiente e facilmente interpretável para detectar a localização subcelular e internalizao de protea de fus de GPCR expresso em culas HEK293. A técnica pode ser facilmente adaptado para muitos genes diferentes e tipos de células, tais como para a localização celular e a internalização do receptor corazonin de Bombyx mori em HEK293 e BMN células 16. A aplicação bem sucedida deste ensaio poderoso depende de alguns ...

As células possuem carga máquinas tráfico para o transporte de materiais-tais como ligantes, microrganismos, nutrientes e proteínas transmembranares-into a célula de informação, energia e outros fins 1, 2 extracelular. É crítico para a homeostase celular, a função do tecido, e a sobrevivência das células em geral. A expressão com base em células de proteínas de fusão fluorescentes é uma maneira poderosa para o estudo da localização e internalização de receptores transmembranares, tais como G receptores acoplados à proteína (GPCR), em vias de sinalização 3. A expressão das proteínas de fusão marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) da medusa Aequorea victoria, combinado com as técnicas de detecção por fluorescência directa, ganhou uma vasta aceitação no-direccionamento proteína investigação 4, 5, 6. DETECTI baseada em GFPon tem a vantagem de permitir a imagens em tempo real de células vivas, evitando artefatos de fixação 7. Uma série de vectores de clonagem versáteis foi construído para facilitar a expressão de proteínas de fusão para GFP em várias células 8, 9. O vector pEGFP-N1 é um vector de plasmídeo amplamente utilizado e comercializado que codifica uma proteína fluorescente verde melhorada (EGFP), a qual foi optimizada a partir do tipo selvagem de GFP por fluoresccia mais brilhante e mais elevada expressão em células de mamíferos. Para observar o sinal fluorescente de EGFP expressa em células de mamíferos, a microscopia de fluorescência deveria ser conduzido com a excitação a 488 nm e a emissão a 507 nm, de preferência com microscopia confocal. Monitorando a localização subcelular e internalizao mediada por ligando dos receptores é uma técnica comum para investigar a transdução de sinal e da função de GPCR 10 </saté&gt;, 11. Na maioria dos casos, a internalização conduz à dessensibilização dos GPCRs (a atenuação da resposta do estímulo, a despeito da presença de agonistas) 12, 13. Os receptores interiorizados podem ser incorporados no lisossoma e degradado, ou eles podem ser reciclados de volta para a superfície celular, dependendo da natureza dos receptores e as linhas de células utilizadas nas experiências. Os receptores da hormona libertadora de gonadotropina (GnRHR) pertencem à família GPCR e tem uma estrutura típica de GPCR proteína, com um terminal amino extracelular, um terminal -COOH intracelular, e sete transmembranar (TM) 14 de domínios. A transfecção do plasmídeo recombinante Sj GnRHR-EGFP (com o gene de GnRHR de Sepiella japonica) e a detecção de microscopia confocal de GnRHR Sj marcaram-EGFP (expressos em células HEK293) foi relatada Previoudissimulado, e fluorescência de GFP foi estabelecido como um repórter para ensaios de localização da proteína transmembranar de 15. Agora, a internalização de Sj GnRHR, activado por S. japonica-hormona libertadora de gonadotropina (GnRH Sj), foi demonstrada em modos dependente do tempo e da dose por microscopia confocal.

<table><tbody><tr><td>Linha celular HEK293</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM / Glicose alta</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Glicose alta 4.0 mM L-glutamina</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Genom</td><td>GNM10010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Genom</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina e 0.02% EDTA</td><td>Genom</td><td></td><td></td>GNM25200</tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td> <td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>mídia de soro reduzida</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente de Transfecção</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Reagente 1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Reagente de Transfecção</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Reagente 2</td></tr><tr><td>Solução de coloração DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Montagem Antidesbotamento</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células de 100 mm</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços&nbsp;</td><td>Placa de</td> 12 poços ExCell Bio <td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td>Lâminas de</tr> Vidro <tr>de<td>Cobertura</td><td>de</td> Vidro <td>NEST 801007</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma CO2 Incubadora</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>5100001311</tr></tbody></table>

detecção de activados por ligandos l acoplado a proteína do receptor de internalização por microscopia confocal

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) é uma técnica de imagem óptica para imagens de alto contraste. É uma abordagem poderosa para visualizar proteínas de fusão fluorescentes, como a proteína fluorescente verde (GFP), para determinar sua expressão, localização e função. A localização subcelular de proteínas-alvo é importante para identificação, caracterização e análises funcionais. A internalização é um dos mecanismos predominantes que controlam a sinalização do receptor acoplado à proteína G (GPCR) para garantir as respostas celulares apropriadas aos estímulos. Aqui, descrevemos um método experimental para detectar a localização subcelular e internalização de GPCR em células HEK293 com microscopia confocal. Além disso, este experimento fornece alguns detalhes sobre cultura de células e transfecção. Este protocolo é compatível com uma variedade de marcadores fluorescentes amplamente disponíveis e é aplicável à visualização da localização subcelular da maioria das proteínas, bem como da internalização do GPCR. Essa técnica deve permitir que os pesquisadores manipulem com eficiência a expressão do gene GPCR em linhagens celulares de mamíferos e deve facilitar estudos sobre localização e internalização subcelular de GPCR.

A Figura 1 mostra um exemplo de um sistema de microscópio confocal. A Figura 2 apresenta a expressão de pEGFP-N1 em células HEK293. O sinal de GFP foi detectado no citoplasma e núcleo. A Figura 3 mostra a localização subcelular de GnRHR de S. japonica em células HEK293, consistente com os nossos resultados publicados anteriormente 15. A proteína de fusão com a marca de EGFP na extremidade C-terminal de <e...

Este protocolo descreve a detecção de microscopia confocal de receptor acoplado a proteína G (GPCR) internalização em células de mamífero. Ele inclui a cultura de células de base, transfecção, e procedimento de microscopia confocal e fornece um método eficiente e facilmente interpretável para detectar a localização subcelular e internalização de GPCR expresso-fusão.

Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

O objetivo geral deste experimento é fornecer um método eficiente e de fácil interpretação para detectar a localização subcelular e a internalização de proteínas de fusão GPCR expressas em células de mamíferos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de localização proteica subcelular, como a internalização e reciclagem de receptores. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser utilizada de forma simples e eficiente.Portanto, este método pode fornecer subsídios para o monitoramento e localização de RCPGs. Além disso, pode ser aplicado a outros sistemas, como proteínas citoplasmáticas e nucleares. Após recuperar e repicar as células HEK293 de acordo com o protocolo descrito, quando as células tiverem atingido quase a confluência, descarte o meio de crescimento equilibrado, adicione dois mililitros de PBS e agite o recipiente para lavar as células.Descarte o PBS e adicione um mililitro de tripsina EDTA. Para digerir completamente as células, agite cuidadosamente o recipiente e aspire a solução. Em seguida, coloque o recipiente neste incubador de CO₂ com jaqueta de água a 37 graus Celsius por três minutos.Enquanto as células estão em incubação, pre

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Biology

Biologia

Aqui, descrevemos os métodos detalhados de células vivas de imagem para investigar quimiotaxia. Apresentamos fluorescência métodos microscópicos para monitorar a dinâmica espaço-temporal dos eventos de sinalização em células migratórias. Medição dos eventos de sinalização nos permite entender melhor como uma rede de sinalização GPCR-alcança gradiente de detecção de quimioatrativos e controles de migração direcional das células eucarióticas.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.

Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.

Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Este protocolo utiliza o inchaço de agarose como uma técnica poderosa e generalizável para incorporar proteínas de membrana integral (IMPs) em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (GUVs), como descrito aqui para a reconstituição da proteína humana receptora de serotonina 1A (5-HT1AR), uma das classes de receptores farmacofarologicamente importantes acoplados à proteína G.

Construção de membranas lipídicas modelo incorporando receptores acoplados de proteína G (GPCRs)

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Aprenda a detectar a internalização de receptores acoplados à proteína G em células HEK293 usando microscopia confocal. Este método eficiente permite visualizar a localização subcelular e dinâmica de proteínas de fusão GPCR em mamíferos.

Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

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