Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

O objetivo geral desta triagem é identificar inibidores de proteína quinase de moléculas pequenas que modulam a pluripotência de células-tronco embrionárias. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da sinalização de células-tronco embrionárias, identificando novas vias de sinalização de proteínas quinases que regulam a pluripotência de células-tronco embrionárias. Portanto, a principal vantagem dessa técnica é que a triagem é relativamente fácil de executar usando equipamentos de laboratório padrão e reagentes prontamente disponíveis.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos que a maioria das pesquisas em vias de sinalização de pluripotência havia ignorado completamente vastas ondas do quinom. Prepare pratos de 10 centímetros revestidos de gelatina adicionando cinco mililitros de gelatina a 0,1% em placas de 10 centímetros. Depois de incubar em temperatura ambiente por cinco minutos, aspire a gelatina e deixe a placa secar por dois minutos.

Em seguida, coloque qualquer linha de células ES de camundongo padrão nas placas revestidas em meio de células ES de camundongo padrão contendo 100 nanogramas por mililitro de LIF marcado com GST, soro de bezerro fetal a 10% e reposição de soro nocaute a 5%. Cultive as células a 37 graus Celsius 5%CO2 e substitua o meio todos os dias. Passe as células ES do camundongo a cerca de 80% de confluência a cada dois dias, aspirando o meio e lavando com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato por placa.

Em seguida, adicione um mililitro de tripsina EDTA por placa de células ES de camundongo e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, ressuspenda as células tripsinizadas em quatro mililitros de meio e centrifugue as células a 1200 RPM por cinco minutos. Ressuspenda completamente o pellet de célula resultante em cinco mililitros de meio, pipetando para cima e para baixo para gerar uma única suspensão de célula.

Conte as células combinando uma suspensão de células de 10 microlitros e 10 microlitros de azul de tripano. Coloque a mistura em uma câmara de contagem de células ou use um hemocitômetro e um microscópio óptico. Em seguida, semeie 3000 células ES de camundongo em placas de 96 poços revestidas com 0,1% de gelatina em um volume final de 100 microlitros de meio usando uma pipeta multicanal.

Em seguida, aplique inibidores de quinase em uma diluição de um a 100 usando uma pipeta multicanal. Pipete suavemente o meio para misturar o inibidor e a suspensão celular. Em seguida, deixe as células se acomodarem em uma capa de cultura de tecidos por uma hora para garantir uma distribuição igual na superfície do revestimento.

Cultive as células por 48 horas sem alterar o meio. Para iniciar a análise de triagem, lave 96 placas de células ES de camundongos em 200 microlitros de PBS usando um aspirador multicanal e pipetas. Após a lavagem, misture os extratos de células em 150 microlitros de tampão de lise.

Clarificar os extractos por centrifugação a 1500 vezes G durante 30 minutos em placas de 96 poços com fundo em V. Em seguida, imobilize 100 microlitros de sobrenadantes em uma membrana de nitrocelulose usando um coletor de plotagem de pontos a vácuo de 96 poços. Seque a membrana e manche com 40 mililitros de Ponceau S para garantir uma transferência consistente.

Depois de lavar a membrana com TBST, bloqueie-a em TBST mais 3% de leite. Em seguida, incube a membrana em anticorpos Nanog e Dnmt3b em uma diluição de um a 1000 no tampão de bloqueio durante a noite. No dia seguinte, lave a membrana três vezes por 10 minutos em TBST.

Em seguida, incube-o em 30 mililitros de anticorpos secundários em uma diluição de um a 10.000 em tampão de bloqueio. Desenvolva a membrana usando um sistema de imagem digital de immunoblotting. É fundamental validar os inibidores de quinase identificados na triagem usando immunoblotting convencional antes de prosseguir.

Isso ajuda a remover falsos positivos antes de uma análise posterior a jusante. Analise os dados da tela e valide os inibidores como reguladores de pluripotência genuínos, conforme descrito no protocolo de texto. Aqui é mostrado um gráfico de pontos Nanog representativo da tela executada.

Os inibidores de controle positivo que impulsionam a pluripotência preparada ou ingênua são destacados. Também é mostrado um gráfico de pontos Dnmt3b representativo da tela executada. Os inibidores de controle positivo que impulsionam a pluripotência preparada ou ingênua são novamente destacados.

Neste gráfico, os inibidores foram classificados para a relação Nanog para Dnmt3b. Um limite duplo de relação Nanog para Dnmt3b é definido para identificar inibidores que estabilizam a pluripotência ingênua ou preparada. Sinais Nanog e Dnmt3b somados também são fornecidos.

Além disso, os inibidores de quinase selecionados para validação adicional são anotados. Aqui é mostrada uma validação convencional de immunoblot de inibidores de quinase selecionados, immunoblots Nanog e Dnmt3b, bem como a proporção Nanog para Dnmt3b e o sinal total são fornecidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar inibidores de quinase de pequenas moléculas que modulam a pluripotência de células-tronco embrionárias.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 72 horas se executada corretamente. Embora esse método possa fornecer informações sobre as vias de sinalização da quinase que controlam a pluripotência, ele também pode ser aplicado à diferenciação de células-tronco embrionárias e outros sistemas regulatórios, como modificadores epigenéticos. Após o procedimento, outras bibliotecas de inibidores de moléculas pequenas, como aquelas direcionadas a modificadores epigenéticos, podem ser usadas para identificar novos atores na regulação da pluripotência.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para nosso grupo de pesquisa elucidar novas vias de sinalização de pluripotência. Usamos essa técnica para identificar um novo papel para a via amplificada na regulação da pluripotência.